Method Article

Zmodyfikowana metoda rurki rolkowej do precyzyjnie zlokalizowanego i powtarzalnego obrazowania przerywanego podczas długotrwałej hodowli wycinków mózgu w systemie zamkniętym

DOI:

10.3791/56436

⸱

December 28th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Molecular, Cellular and Integrated Neuroscience Program, Colorado State University, 2IBMC-Instituto de Biologia Molecular e Celular, i3S-Instituto de Investigaçãoe Inovação em Saúde, ICBAS, Universidade do Porto, 3Denali Therapeutics

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowana tutaj jest zmodyfikowana metoda rolkowa do hodowli i przerywanego obrazowania w wysokiej rozdzielczości wycinków mózgu gryzoni przez wiele tygodni z precyzyjną zmianą położenia na fototrawionych szkiełkach nakrywkowych. Żywotność neuronów i morfologia warstw są dobrze zachowane. Zapewnione są zastosowania tego w pełni zamkniętego systemu wykorzystującego wirusy do ekspresji specyficznej dla typu komórki.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowane wycinki mózgu gryzoni są przydatne do badania komórkowego i molekularnego zachowania neuronów i gleju w środowisku, które utrzymuje wiele z ich normalnych interakcji in vivo. Wycinki uzyskane z różnych transgenicznych linii myszy lub wykorzystanie wektorów wirusowych do ekspresji fluorescencyjnie znakowanych białek lub reporterów w wycinkach mózgu typu dzikiego pozwalają na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Chociaż opracowano kilka metod obrazowania wycinków mózgu, połączenie hodowli wycinków z możliwością wykonywania powtarzalnego obrazowania w wysokiej rozdzielczości określonych komórek w żywych wycinkach przez długi czas stwarzało problemy. Jest to szczególnie ważne, gdy wektory wirusowe są używane do ekspresji białek egzogennych, ponieważ najlepiej zrobić to w systemie zamkniętym, aby chronić użytkowników i zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Doniesiono o prostych modyfikacjach dokonanych w metodzie hodowli wycinków mózgu w rurce rolkowej, które pozwalają na powtarzalne obrazowanie wycinków w wysokiej rozdzielczości przez wiele tygodni w zamkniętym systemie. Hodowla plastrów na blaszkach nakrywkowych pozwala na użycie znaczników odniesienia w celu szybkiej i precyzyjnej zmiany położenia sceny w celu zobrazowania tego samego pola w czasie przed i po różnych zabiegach. Przedstawiono przykłady zastosowania tej metody w połączeniu ze specyficznym barwieniem i ekspresją neuronów w celu zaobserwowania zmian w architekturze wycinków hipokampa, ekspresji neuronalnej białek fluorescencyjnych za pośrednictwem wirusa oraz rozwoju patologii kofiliny, którą wcześniej obserwowano w hipokampie choroby Alzheimera (AD) w odpowiedzi na leczenie plasterkami oligomerów peptydu β amyloidu (Aβ).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotna hodowla zdysocjowanych neuronów z regionów mózgu gryzoni jest ważnym narzędziem używanym przez badaczy do obserwacji reakcji na patologicznie uwikłane bodźce. Jednak takie badania mają tę wadę, że patrzą na neurony tylko w 2D i bez ich glejowego systemu wsparcia. Ponadto, o ile nie jest uprawiany w warunkach bardzo dużej gęstości (640 neuronów/mm2 lub około 16% powierzchni), w których niemożliwe staje się śledzenie losowego wzrostu dendrytu lub aksonu na więcej niż krótką odległość od jego ciała komórkowego, żywotność neuronów hipokampa w ciągu 4 tygodni znacznie spada1, ograniczając użycie zdysocjowanych kultur do rozszerzonych badań patologii związanych z wiekiem. Hodowla plastrów przygotowanych z mózgu gryzoni jest atrakcyjną opcją, która pokonuje te ograniczenia, utrzymując zorganizowaną architekturę komórek i żywotność przez tygodnie lub miesiące. Opisano warunki utrzymania wielu różnych regionów mózgu gryzoni w hodowli plastrów2.

Dwie główne metody są szeroko stosowane do długotrwałej hodowli wycinków mózgu: hodowla na błonach na granicy powietrze-ciecz3 lub hodowla na szkiełkach nakrywkowych w szczelnie zamkniętych probówkach, które mogą obracać się w inkubatorze rolkowym w celu zapewnienia napowietrzania4. Plastry hodowane na błonach można bezpośrednio obrazować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości przy użyciu mikroskopu pionowego i obiektywów zanurzeniowych w wodzie5. Alternatywnie, plastry hodowane na błonach przeniesiono do naczyń ze szklanym dnem, aby uzyskać dobrą rozdzielczość kolców dendrytycznych za pomocą mikroskopu odwróconego6. Jednak obie metody obrazowania plastrów hodowanych na błonach są systemami otwartymi, które wymagają zmian podłoża i często wykorzystują leki przeciwgrzybicze i/lub antybiotyki w celu zapobiegania lub zmniejszania zanieczyszczenia5,6. Plastry na błonie na granicy powietrze-medium zachowują doskonałą morfologię i przeżycie, ale powrót do precyzyjnych lokalizacji podczas powtarzalnego obrazowania przy dużym powiększeniu jest niezwykle trudny, chyba że eksperyment śledzi tylko małe grupy komórek wyrażających marker fluorescencyjny. Chociaż plastry wyhodowane na błonach były używane z ekspresją transgenów za pośrednictwem wirusa5,6, protokoły bezpieczeństwa biologicznego mogą wymagać zastosowania zamkniętego systemu hodowli dla niektórych wektorów wirusowych, które są używane do ekspresji fluorescencyjnie znakowanych białek i reporterów fizjologii komórki. Ponadto cele zanurzenia wymagają dekontaminacji między próbkami, które będą śledzone w culture5. Jednym z głównych zastosowań kultur interfejsu błonowego jest połączenie obrazowania w wysokiej rozdzielczości z elektrofizjologią w pojedynczych punktach czasowych7.

Metoda rolkowa z szkiełkami nakrywkowymi wewnątrz plastikowej rurki nie pozwala na żadną elektrofizjologię ani obrazowanie w wysokiej rozdzielczości bez usunięcia szkiełka nakrywkowego. Z tego powodu metoda ta była najczęściej stosowana w badaniach długoterminowych, w których dokonano obserwacji po fiksacji8. Opisana tutaj jest metoda, która wykorzystuje technikę hodowli w rurce rolkowej, ale na wywierconych rurkach z plastrami na szkiełkach nakrywkowych, które można obrazować powtarzalnie tak długo, jak długo kultury są utrzymywane. Zamknięty system nie wymaga wymiany podłoża do obrazowania i wykorzystuje blaszki nakrywkowe, aby zapewnić znaki referencyjne, które umożliwiają obrazowanie w dużym powiększeniu, po dniach lub tygodniach, dokładnie tych pól, które zostały wcześniej zobrazowane.

Stosujemy tę metodę do badania zmian w hipokampie gryzoni, głównym regionie mózgu odpowiedzialnym za pamięć i uczenie się. Hipokamp gryzoni jest często badany jako model zmian patologicznych lub związanych z wiekiem obserwowanych podczas rozwoju zaburzeń poznawczych9, takich jak te, które występują w AD. Nasza metoda szczególnie dobrze nadaje się do badania zmian patologicznych, które rozwijają się w obrębie pojedynczego wycinka w czasie w odpowiedzi na zmiany środowiskowe, takie jak wzrost peptydów Aβ, co jest charakterystyczne dla AD8. Jedną z patologii związanych z mózgiem człowieka i gryzonia jest obecność agregatów i pręcików kofilina-aktyna, przy czym te ostatnie zawierają wiązki włókien, w których kofilina i aktyna są w stosunku molowym 1:110,11,12. Pręciki zaobserwowano w utrwalonych wycinkach hipokampa szczura po leczeniu Aβ, a także w żywym wycinku mózgu gryzonia wyrażającego kofilinę-GFP poddanego hipoksji8 i mogą one przyczyniać się do dysfunkcji synaps obserwowanej w AD i udarze. Tutaj używamy tej nowej metody hodowli do obserwacji przebiegu i rozkładu w czasie w wycinkach ekspresji egzogennych chimerycznych białek fluorescencyjnych wprowadzonych przez różne wirusy. Następnie wykorzystujemy specyficzną dla neuronów ekspresję konstruktu reporterowego kofiliny, aby śledzić rozwój patologii pręcików i agregatów kofiliny w wycinkach hipokampa w odpowiedzi na leczenie rozpuszczalnymi oligomerami Aβ (Aβo).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie zwierząt odbywa się zgodnie z zatwierdzonymi protokołami hodowli i użytkowania zwierząt, które są zgodne z Wytycznymi Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Stanowego Kolorado.

UWAGA: Poniższy protokół opisuje metodę przygotowania i hodowli do długotrwałej inkubacji i przerywanego obrazowania wycinków hipokampa. Pojedynczy wycinek hipokampa jest mocowany do specjalnie przygotowanego blaszki nakrywkowej za pomocą skrzepu plazmowego, a następnie szkiełka nakrywkowe są uszczelniane na płaskiej stronie wywierconej rurki rolkowej, która jest utrzymywana w inkubatorze rolkowym. Skrzepy osocza są rozpuszczane za pomocą plazminy przed infekcją wirusową w celu ekspresji białek fluorescencyjnych i obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Fluorescencyjny barwnik żywotny neuronów jest używany do obrazowania neuronów w plasterkach.

1. Przygotowanie stojaka na rury rolkowe

  1. Użyj szablonu pokazanego w Rysunek 1Wydrukowano do rozmiaru pokazanego na pasku skali. Za pomocą gwoździa wybij małe otwory (wystarczająco duże, aby można było umieścić drobny znacznik punktowy) w szablonie wyśrodkowanym na otworach.
  2. Umieść szablon na dnie naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 15 cm (średnica nominalna 14 cm) i zaznacz położenie otworów. Powtórz to na drugim daniu.
  3. Za pomocą wierteł przeznaczonych do użytku na plastiku wywierć sześć otworów o średnicy 1.5 cm na każdej czaszy w sześciokątnym układzie (4.8 cm od środka do środka) ze środkami otworów 2.5 cm od krawędzi naczynia. Wywierć trzy otwory (o średnicy 3 mm) w odległości 12 mm od krawędzi, które są umieszczone w równej odległości między dwoma większymi otworami, jak pokazano na rysunku Rysunek 1A.
  4. Dnem każdej naczynia skierowanym do siebie umieść maszynową o długości 2,5 cala (średnica 3/16 cala) z płaską podkładką przez jeden z małych otworów, a następnie drugą płaską podkładkę, kawałek rurki polietylenowej (przekładka, 4.7 cm), kolejną płaską podkładkę, drugą naczynie do hodowli tkankowej, kolejną płaską podkładkę, podkładkę blokującą, i orzech.
  5. Powtórz krok 1.4 na pozostałych dwóch maszynowych i dokręcaj tylko luźno, aż wszystkie maszynowe znajdą się na swoim miejscu. Następnie mocno dokręć nakrętki.
  6. Wbij przelotki (o grubości 5/16 cala, średnicy otworu 5/8 cala) w otwory dolnej naczynia, aby uzyskać końcowy stojak na rurki rolkowe (Rysunek 1B; pokazany z dwiema rurkami na miejscu). Umieść naklejkę na każdym stojaku z unikalnym numerem.

2. Przygotowanie rur rolkowych i szkiełek nakrywkowych

  1. Wykonanie przyrządu do wiercenia otworu w rurach rolkowych
    1. Wywierć otwór o średnicy 1,5 cm o głębokości 8 cm w środkowej stronie drewnianego klocka o wymiarach 2 x 4 x 5,5 cala pod takim kątem, aby płaska strona rury rolkowej była prawie równoległa do klocka po włożeniu (Rysunek 2A).
    2. Powiększ otwór za pomocą okrągłego pilnika do drewna, aby zarówno poszerzyć, jak i zwęzić otwór, aby umożliwić włożenie rurki (rurki rolkowe mają nieco większą średnicę w pobliżu końca nasadki) (Rysunek 2B).
    3. Wywierć pionowy otwór o średnicy 1,5 cm, 5,5 cm od boku bloku i wyśrodkowany nad bocznym otworem (Rysunek 2C).
    4. Gdy boczny otwór jest wystarczająco zwężany, włóż rurkę rolkową, która jest zaznaczona w żądanym miejscu, aby wyśrodkować otwór na plaster i ustawić rurkę tak, aby zaznaczone miejsce było wyśrodkowane w pionowym otworze o długości 1.5 cm.
    5. Wyjmij rurkę i zmierz odległość od miejsca do końca rurki. Zaznacz tę odległość od środka otworu w przyrządzie i włóż gwóźdź, aby zapewnić ogranicznik do prawidłowego ustawienia rury do wiercenia (strzałka w Rysunek 2C).
    6. Użyj piły do metalu, aby odciąć gwóźdź równo z powierzchnią drewnianego klocka, aby zapobiec obrażeniom.
    7. Dodaj zaciski sprężynowe na spodzie przyrządu, jeśli znajduje się wiertarka ze szczelinami, które pozwalają na jej zakotwiczenie (Rysunek 2D strzałka). W przeciwnym razie użyj C-clamps, aby bezpiecznie przytrzymać przyrząd do wiertarki.
  2. Używając opisanego powyżej przyrządu, aby przytrzymać i ustawić płaską rurkę hodowlaną z tworzywa sztucznego o boku 11 cm płaską stroną do góry (Rysunek 2A), wywierć otwór o średnicy 6 mm ze środkiem 1,0 cm od dołu i wyśrodkowanym między bokami rurki.
    UWAGA: Należy użyć wiertła przeznaczonego do plastiku.
  3. Za pomocą obrotowego narzędzia do gratowania wygładź krawędzie otworu (Rysunek 2E) i wykonaj 4 rowki na wewnętrznej krawędzi otworu (Rysunek 2E, wstawka), aby ułatwić opróżnianie otworu podczas obracania.
  4. Za pomocą dziurkacza o średnicy 12 mm wytnij krążki o średnicy 12 mm z nietoksycznych dwustronnych arkuszy kauczuku silikonowego z klejem. Za pomocą standardowego dziurkacza do papieru z jednym otworem (średnica 6 mm) wykonaj otwór w środku każdego dysku.
  5. Wypłukać wywiercone probówki 70% etanolem, wysuszyć je na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego i sterylizować probówki i dziurkowane krążki samoprzylepne przez 40 minut pod lampą UV (30 W przy średniej odległości 70 cm) w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    6. Po
  6. 20 minutach należy ponownie ustawić probówki i krążki, aby wszystkie odsłonięte powierzchnie zostały wysterylizowane. W sterylnych warunkach oderwij biały podkład od krążka samoprzylepnego i przymocuj gumę silikonową na zewnątrz tuby, wyrównując otwory (Rysunek 2F).
    Ostrzeżenie: Aby uniknąć ekspozycji na promieniowanie UV, załóż okulary ochronne i zamknij obudowę przed włączeniem UV lamp.
  7. Czyste blaszki nakrywkowe o średnicy 12 mm (100 centralnie ponumerowanych kwadratów 1 mm) niemieckie szkiełka nakrywkowe. Delikatnie przytrzymaj szkiełka nakrywkowe kleszczami i zanurz je w absolutnym etanolu, następnie w wodzie, a następnie ponownie w absolutnym etanolu, a na koniec zanurz szkiełka nakrywkowe w płomieniu, aby spalić etanol. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do ostygnięcia.
  8. Trzymając szkiełka nakrywkowe kleszkami, zanurz w 2% 3-aminopropylotrietoksysilanie w acetonie na 10 s. Opłucz szkiełka nakrywkowe ultraczystą wodą i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
  9. Umieść szkiełka nakrywkowe na sterylnej bibule filtracyjnej wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego i włącz światło UV. Odsłaniaj szkiełka nakrywkowe z każdej strony przez 20 minut
    Ostrzeżenie: Aby uniknąć ekspozycji na promieniowanie UV, załóż okulary ochronne i zamknij obudowę przed włączeniem UV lamp.

3. Przygotowanie plastrów hipokampa

  1. Przed rozpoczęciem sekcji przygotuj połówki obosiecznych żyletek do rozdrabniacza tkanek. Ostrożnie złóż ostrza wzdłuż palcami i zatrzaśnij na pół.
  2. Opłucz połówki ostrzy acetonem za pomocą bawełnianego wacika, aby je wyczyścić, a następnie spłucz w absolutnym etanolu i wysusz na powietrzu. Przed zamontowaniem połówki ostrza na rozdrabniaczu tkanek wysterylizuj go, spłukując 70% etanolem.
  3. Postępuj zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania; po znieczuleniu izofluranem poddaj eutanazji 4-7-dniowe młode myszy lub szczura przez ścięcie głowy i usuń głowę nożyczkami lub gilotyną.
    UWAGA: Protokół hodowli plastrów mózgu jest niezależny od szczepu lub genotypu myszy lub szczura. Wykorzystano wiele transgenicznych linii myszy o różnym pochodzeniu genetycznym.
  4. Opłucz głowę 70% etanolem i umieść ją na szalce Petriego o średnicy 60 mm. Do momentu ostatecznego zamontowania wycinka mózgu na rurze rolkowej, wszystkie poniższe kroki są wykonywane w okapie z przepływem laminarnym, aby zachować sterylność.
  5. Za pomocą ostrza chirurgicznego #21 wykonaj strzałkowe przecięcie skóry i czaszki. Za pomocą kleszczy Dumont #5 oderwij skórę i czaszkę, aby odsłonić mózg.
  6. Za pomocą zamkniętych kleszczy delikatnie wydłub cały mózg, uwalniając go, ściskając kleszczami przez pień mózgu za móżdżkiem. Umieść mózg w sterylnym naczyniu o średnicy 60 mm zawierającym 4 °C Zrównoważony roztwór soli Gey's / 0,5% glukozy (GBSS / glukoza).
  7. Używając mikroskopu preparacyjnego do wizualizacji mózgu (Ryc. 3A), umieść mózg grzbietową stroną do góry i odetnij przednią trzecią część mózgu i móżdżek za pomocą ostrza chirurgicznego (Rysunek 3B).
    1. Za pomocą kleszczy przytrzymaj przycięty mózg tylną stroną do góry i brzuszną stroną do boku szalki Petriego, aby zapewnić stabilność. Delikatnie odczep opony mózgowe wokół strzałkowej linii środkowej i usuń tkankę śródmózgowia za pomocą kleszczyków Dumont #5 z cienką końcówką (Rysunek 3C, przerywane kółko).
    2. Wykonaj dwa nacięcia wzdłuż boku mózgu, aby go otworzyć (Rysunek 3C, linie przerywane). Gdy mózg zostanie umieszczony grzbietowo do dołu i rozłoży się, szczelina hipokampa powinna być widoczna (Rysunek 3D, strzałka).
    3. Przenieś rozprowadzony otwarty mózg na kawałek folii z tworzywa sztucznego z polichlorotrifluoroetylenu i umieść go do krojenia na etapie rozdrabniania tkanek. Zwilż ostrze GBSS/glukozą i posiekaj hipokamp na plastry o grubości ~300 μm.
    4. Za pomocą pipety transferowej spłucz pokrojony mózg z folii z tworzywa sztucznego do świeżego naczynia o średnicy 60 mm zawierającego GBSS/glukozę (Rysunek 3E). Delikatnie uszczypnij i odczep cienkimi szczypcami pozostałe opony mózgowe i inne tkanki niezwiązane z hipokampem (Rysunek 3F) z plastrów (Rysunek 3G, H).

4. Plastry poszycia

  1. Po uzyskaniu plastrów umieść 2 μl osocza kurzego na środku blaszki fototrawionej przygotowanego szkiełka nakrywkowego. Lekko rozprowadź plazmę, aby uzyskać plamkę o średnicy 3-4 mm.
    UWAGA: Blaszona blaszka fototrawiona to górna strona szkiełka nakrywkowego, gdy patrzy się na nią przez mikroskop preparacyjny, tak aby cyfry były prawidłowo zorientowane.
  2. Przenieś 1 wycinek mózgu za pomocą sterylnej szpatułki z wąską końcówką (Rysunek 4A) do plamki plazmowej (Rycina 4B). Użyj zamkniętych kleszczy, aby utrzymać plasterek na końcówce szpatułki, jednocześnie podnosząc plasterek z GBSS/glukozy.
  3. Przyłóż szpatułkę do plamki plazmy na szkiełku nakrywkowym i przy zamkniętych kleszkach dociśnij plasterek do szkiełka nakrywkowego.
  4. Wymieszać 2,5 μl osocza z 2,5 μl trombiny w osobnej probówce. Szybko umieść 2,5 μl tej mieszaniny nad i wokół plasterka i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby ją wymieszać (Rysunek 4B).
    UWAGA: Osocze zakrzepnie w ciągu 10-15 sekund, więc należy to zrobić szybko. Jeśli problemem jest przyleganie plastrów, zmieszaj 5 μl osocza z 5 μl trombiny i użyj 4-5 μl na plasterku, usuwając część po wymieszaniu, tak aby plasterek leżał płasko na szkiełku nakrywkowym.
  5. Usuń przezroczystą plastikową powłokę z odsłoniętej strony kleju z kauczuku silikonowego uprzednio przymocowanego do rurki rolkowej i umieść szkiełko nakrywkowe z plastrem mózgu na kleju, wyrównując plasterek w otworze (Rysunek 4C).
  6. Aby zapewnić przyczepność, należy delikatnie i równomiernie docisnąć szkiełko nakrywkowe kciukiem, równomiernie dociskając szkiełko nakrywkowe i przytrzymując je przez około 1 minutę podczas przenoszenia do szafy bezpieczeństwa biologicznego.
  7. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj 0,8 ml kompletnej pożywki hodowlanej Neurobaseal A (tabela materiałów) do każdej probówki (Rysunek 4D).
  8. Przepuścić mieszaninę 5% CO2/95% powietrza przez sterylną pipetę Pasteura z bawełnianą zatyczką, bezpiecznie przytrzymywaną przez zacisk. Przepłukać rurkę rolkową mieszaniną gazów i szybko zakryć rurkę w miarę jej wyjmowania z okolic pipety.
  9. Oznacz probówki numerem plastra i numerem stojaka. Włóż rurki do stojaka na rolki, upewniając się, że są geometrycznie wyważone. Jeśli liczba rurek jest nieparzysta, dodaj rurki, aby zrównoważyć.
  10. Umieść stojaki w inkubatorze rolkowym o temperaturze 35 °C z rolkami obracającymi zębatkę rolkową z prędkością około 10-13 RPH (Rysunek 4E). Aby utrzymać pożywkę na dnie probówek, przechyl inkubator do tyłu o około 5°, podnosząc jego przód na desce.
  11. Wprowadź numer plastra i tubki do arkusza kalkulacyjnego, który służy do zapisywania wszystkich informacji o zabiegach plastrowych i datach obserwacji.
  12. Około 6 dnia w hodowli dodać 1 μl (0,002 j.) aktywnego plazminy do każdej probówki.
  13. Po całkowitym rozpuszczeniu skrzepów (zwykle w ciągu kilku godzin) należy usunąć pożywkę i zastąpić ją świeżą pożywką bez plazminy. W razie potrzeby plastry można inkubować z plazminą przez noc, a pożywkę zmienić następnego dnia.
  14. Plastry są zwykle inkubowane przez co najmniej 7-10 dni przed użyciem w eksperymentach. Odessać pożywkę i wymienić ją w 3. lub 4. dniu, ponownie w 7. dniu, a następnie co 7 dni.

5. Przygotowanie wektorów wirusowych do ekspresji transgenu

UWAGA: Ekspresja transgenów w neuronach kultur warstwowych jest osiągana albo za pomocą mózgów genetycznie modyfikowanych gryzoni, albo przez wprowadzenie transgenu przez infekcję rekombinowanymi wirusami z niedoborem replikacji. Adenowirusy (AV), wirusy związane z adenowirusem (AAV) i rekombinowane wektory lentiwirusowe były używane w naszych kulturach warstw hipokampa do ekspresji różnych fluorescencyjnych chimer białkowych w wycinkach mózgu.

  1. Przygotuj AV z niedoborem replikacji do ekspresji interesującego RNA zgodnie z metodami opisanymi w innym miejscu13,14. Mianowanie wirusów pod kątem zakaźnego U/ml metodą seryjnego rozcieńczania przy użyciu przeciwciała przeciwko białku o ekspresji wirusa, jak opisano14. Aby zaobserwować agregaty kofiliny i tworzenie pręcików kofilina-aktyna, użyj cDNA kofiliny-R21Q-mRFP (plazmid #51279)16.
    UWAGA: Promotor synapsyny 1 jest doskonałym wyborem dla ekspresji specyficznej dla neuronów15, podczas gdy promotor wirusa cytomegalii jest przydatny do zwiększania poziomów ekspresji w wielu typach komórek13.
  2. Przygotuj AAV przez jednoczesną transfekcję plazmidu transferowego zawierającego gen będący przedmiotem zainteresowania i plazmid rep/cap, z plazmidem pomocniczym lub bez, do komórek pakujących HEK293, które dostarczają wirusowy gen E1, jak opisano wcześniej17,18.
    UWAGA: Rekombinowany AAV może być również wykonany do celowanej insercji do genomu komórki gospodarza19. Do transferu plazmidu używamy ludzkiej kofiliny 1 z C-końcowym znacznikiem białka fluorescencyjnego mRFP1 (plazmid #50856) sklonowanym do plazmidu AAV zawierającego promotor synapsyny poniżej czujnika wapnia GCaMP5G20. Fragment DNA kodujący sekwencję peptydu samorozszczepiającego P2A jest wprowadzany metodą PCR między GCaMP5G a kofilinę-RFP podczas przygotowywania plazmidu transferowego, aby zapewnić ekspresję obu białek z pojedynczego transkryptu AAV 21.
  3. Przygotuj rekombinowane wektory lentiwirusa przez kotransfekcję plazmidu transferowego zawierającego gen lub cDNA będący przedmiotem zainteresowania i sygnały integracji, wraz z mieszaniną pakowania lentiwirusa trzeciej generacji, która dzieli geny wirusa gag, pol, rev i vsv-g na trzy oddzielne plazmidy22,23.
  4. Do transferu plazmidu użyj jednoetapowego systemu klonowania24, aby złożyć promotor synapsyny i cDNA kofiliny-R21Q-mRFP (z plazmidu #51279) w pLKO.1-GFP (plazmid #30323), z promotorem synapsyny i kofiliną-R21Q-mRFP zastępującymi odpowiednio promotor hPGK i cDNA GFP.
  5. Transfekcja końcowego plazmidu do komórek HEK293T za pomocą fosforanu wapnia, jak opisano wcześniej23.
  6. Zebrać pożywkę z czterech szalek o średnicy 10 cm, zagęścić do 500 μl za pomocą koncentratorów odśrodkowych o temperaturze 150 K, a następnie przechowywać końcowego lentiwirusa w temperaturze -80 °C w małych porcjach po szybkim zamrożeniu w ciekłym azocie. Rozmrozić podwielokrotność tylko raz w celu zainfekowania komórek.
  7. Określ empirycznie objętość każdego typu wirusa przygotowanego do osiągnięcia pożądanego stopnia ekspresji, ustanawiając szereg różnych kultur warstwowych, aby śledzić ekspresję transgenów po zakażeniu różnymi ilościami wirusa.
    UWAGA: Zazwyczaj stosuje się 1-10 μl wirusa na plasterek.

6. Zabiegi na plastry

  1. Infekowanie plasterków wirusem
    1. Pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego zatwierdzonej do pracy z wirusami na poziomie bezpieczeństwa biologicznego odpowiednim dla wektora, należy zmieszać porcję wirusa (zwykle 1-10 μl) z 0,8 ml kompletnej pożywki.
    2. Odessać pożywkę z plastra za pomocą sterylnej pipety Pasteura do pułapki zbiorczej zawierającej wybielacz. Syfon wtórny jest zawsze używany między pierwszym odwadniaczem a źródłem podciśnienia.
    3. Zastąp tę pożywkę podwielokrotnością zawierającą wirusa przygotowaną powyżej, umieść probówki hodowlane z powrotem na stojaku i umieść w inkubatorze.
    4. Po 2-5 dniach inkubacji plastrów z wirusem w komorze bezpieczeństwa biologicznego, należy usunąć pożywkę zawierającą wirusa za pomocą sterylnej pipety transferowej i umieścić ją w butelce zawierającej zatwierdzony środek przeciwwirusowy do zabijania wirusa.
  2. Barwienie neuronów barwnikiem przyżyciowym
    1. Przygotuj i przechowuj porcje fluorescencyjnego barwnika żywotnego neuronów25 poprzez szybkie zamrożenie 4 μl podwielokrotności w ciekłym azocie o stężeniu 100 μM i przechowuj je w temperaturze -20 °C. Nie zamrażaj/nie rozmrażaj barwnika więcej niż raz.
    2. Aby oznaczyć neurony do wizualizacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, rozmrozić jedną podwielokrotność neuronalnego barwnika życiowego i rozcieńczyć do 4 ml w kompletnym pożywce Neurobasel (końcowe stężenie barwnika wynosi 100 nM).
    3. Usunąć pożywkę z plastrów przez aspirację (lub za pomocą pipety transferowej, jeśli pożywka zawiera wirusa) i zastąpić ją 0,8 ml pożywki zawierającej 100 nM neuronalnego barwnika życiowego. Włóż plastry z powrotem do aparatu rolkowego w inkubatorze.
    4. Po inkubacji plastrów przez 2 godziny odessać pożywkę zawierającą barwnik i zastąpić ją 0,8 ml świeżej kompletnej pożywki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
      UWAGA: Znakowanie neuronów w plasterkach barwnikiem życiowym wymaga kilku godzin inkubacji. Pierwsze zdjęcia wykonywane są zazwyczaj po 24 godzinach od zabiegu farbowania. Chociaż neurony są specjalnie oznaczone, występuje fluorescencja tła, która zmniejsza się w ciągu 2-3 dni, aby zapewnić lepsze obrazowanie neuronów. Intensywność barwnika witalnego spada po 72 godzinach.
    5. Aby śledzić zmiany w morfologii plasterków w czasie, ponownie etykietuj wycinki co 7 dni.

7. Obrazowanie warstw

  1. Zobacz plasterki pod odwróconym mikroskopem. Aby uzyskać najjaśniejsze obrazowanie fluorescencyjne, na 24 godziny przed obrazowaniem, należy wymienić pożywkę hodowlaną na kompletną pożywkę Neurobasal A bez wskaźnika pH czerwieni fenolowej.
    UWAGA: W przypadku opisywanych tutaj eksperymentów, wycinki są oglądane na konfokalnym mikroskopie fluorescencyjnym z odwróconym dyskiem z odwróconym dyskiem, wyposażonym w liniowo kodowany stolik x, y z kontrolą piezoelektryczny i czułą kamerę cyfrową o wysokiej rozdzielczości.
  2. Przenieś probówkę z kulturą plastrów, która ma być zobrazowana, z aparatu rolkowego do wykonanego na zamówienie uchwytu probówki ( Rysunek 5A), który jest umieszczony w adapterze stage (Rysunek 5B), aby utrzymać szkiełko nakrywkowe prostopadle do obiektywu i utrzymać plasterek w tej samej orientacji podczas powtarzających się sesji obrazowania w długich odstępach czasu.
  3. Dociśnij suwak na adapterze stage mocno do rury, aby utrzymać rurkę na miejscu (Rysunek 5B). Utrzymuj temperaturę plastra na poziomie 35 °C podczas obrazowania za pomocą pasków grzewczych i regulatora termoregulacyjnego wbudowanego w specjalnie wykonany adapter stolika (Rysunek 5C).
    UWAGA: Szczegółowe informacje na temat uchwytu rury, stage adapter i grzałka są dostępne pod adresem: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.
  4. Korzystając z obiektywu o małej mocy (np. 4X) i transoświetlenia w jasnym polu, skup się na fototrawionym wzorze siatki (Rysunek 6A) pod plasterkiem. W przypadku początkowej sesji obrazowania szybko przeskanuj okolicę wycinka, aby zlokalizować i zapisać liczbę różnych obszarów, w których pożądane jest obrazowanie w większym powiększeniu (np. róg amonowy (CA)1, CA3, zakręt zębaty (DG) itp.).
  5. Przenieś stół montażowy do pierwszego kwadratu siatki zawierającego obszar zainteresowania. Przełącz się na obiektyw powietrzny 20X i zlokalizuj znak odniesienia (np. końcówkę wytrawionej liczby) (Rysunek 6B).
  6. Przełącz się na obiektyw o wyższej mocy (40X lub 60X), zlokalizuj znacznik odniesienia, a następnie nagraj pozycję x i y sceny. Przesuń scenę, aby znaleźć interesujące Cię pole (pola) w pobliżu i zapisz ich przesunięcia x i y od znaku odniesienia (Rysunek 6B, strzałka). W razie potrzeby powtórz w innych obszarach siatki.
    UWAGA: Te przesunięte pozycje od znaku odniesienia umożliwiają spójne wskazanie tego samego położenia szkiełka nakrywkowego, gdy plasterek jest obrazowany, nawet jeśli oryginalne ustawienie x, y znaku odniesienia zmienia się, gdy rurka lub adapter stage są usuwane i wymieniane.
  7. Uchwyć obraz Z-stack w każdym wybranym polu za pomocą sterowania obiektywem mikroskopu lub sterowania stolikiem piezoelektrycznym, jeśli jest dostępny.
    UWAGA: Płaszczyzny obrazu uzyskuje się zwykle w odstępach od 0,5 μm do 2 μm, w zależności od wielkości i pożądanej rozdzielczości cech obrazu. Tworzenie wysokiej jakości obrazu 3D wymaga, aby cechy obrazu rozciągały się na wielu płaszczyznach akwizycji, a więc do wizualizacji mniejszych obiektów wymagane są mniejsze odstępy między płaszczyznami.
  8. Całkowity czas obrazowania dla każdego wycinka powinien być jak najkrótszy.
    UWAGA: Większość zgłoszonych tutaj sesji obrazowania trwała krócej niż 18 minut/wycinek. Jednak zobrazowaliśmy niektóre wycinki dziesięć lub więcej razy, a nawet 40 minut podczas jednej sesji, bez widocznej szkody dla długoterminowego przetrwania wycinka.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby określić, jak dokładnie można wykorzystać znaczniki referencyjne do odtworzenia tych samych komórek w tych samych polach w czasie, zbadaliśmy plastry wyhodowane na fototrawionych szkiełkach nakrywkowych (Rysunek 6A). Neurony zostały uwidocznione poprzez barwienie życiodajnym barwnikiem (100 nM przez 2 godziny; nie barwi komórek nieneuronalnych), który znika z neuronów z czasem, nie uszkadzając komórek25. Zidentyfik...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj metoda roller tube pozwala na długoterminową hodowlę i obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości pokrojonej tkanki mózgowej. Jednym z głównych problemów związanych z zastosowaną tutaj techniką plastrów jest montaż i konserwacja plastrów. Powłoki szkiełek nakrywkowych, które wspomagają przyleganie plastrów, sprzyjają przerzedzaniu plastrów poprzez zwiększenie wzrostu neurytów i migracji komórek z plasterka; W ten sposób uniknęliśmy stosowania tych podłoży. Wprowadzenie grup aminowych do szkła poprzez pot...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dnka od 15 cm naczyń hodowlanychVWR Scientific25384-326
maszynowe z krzyżakowym (#10-32)Ace HardwarePodkładki płaskie o długości 2,5 cala i średnicy 3/16"
#10Nakrętki maszynowych ACE Hardware
(#10-32)ACE Hardware
 ACE Hardware5/16", gruby; 5/8", średnica otworu; 1.125", OD
Rurki polietylenowe (5/16"; OD, 3/16"; ID)ACE HardwareCut to 1,8
długości Podkładka blokująca #10ACE Hardware
Wiertarka, 5 prędkości Ace HardwareProTech Model 1201
Nunclon Delta Rury płaskieVWR62407-076
Wiertła, 3 mm, 6 mm i 15 mm Ace HardwareMarka Diablo FreudWiertła do cięcia tworzyw sztucznych.
Wiertła do drewna, 1,5 cm i 1 mmAce Hardware
Pilnik do drewna, 1/4" okrągłyAce Harware
Klipsy sprężynowe, uchwyt zatrzaskowy 16 mmAce Hardware
Narzędzie do gratowania z obrotową głowicą, 5"Ace Hardware26307
Samoprzylepny arkusz silikonowy (Secure Seal)Grace Bio-Labs666581Grubość 0,5 mm
Dziurkacz 6 mmOffice Max
Dziurkacz 12 mmthepunchbunch.com
70%
etanolu Fototechnologiczne szkiełka nakrywkowe, średnica 12 mmBellco Glass, Inc.1916-91012
Bunsena
Absolutny etanol
Nanoczysta woda
3-aminopropylotrietoksylanSigma-AldrichA3648
AcetonSigma-Aldrich179124
#5 Kleszcze DumontaNarzędzia naukowe11251-30
Rozdrabniacz tkanek McIlwainTed Pella, Inc.10180
Żyletki z podwójną krawędziąTed Pella, Inc.121-6
Bibuła filtracyjna Whatman VWR28450-182Pocięte na kółka o średnicy 5,8 cm
Poli-chloro-trifluoro-etylen (Aclar)Ted Pella, Inc.10501-10Pocięte w kółka o średnicy 5,8 cm
#21 Ostrze chirurgiczneVWR Scientific25860-144
#5 Kleszcze DumontNarzędzia do nauki11251-30
Szpatułka, nierdzewna ze stożkowym końcemVWR82027-518
Zrównoważony roztwór soli Gey'sSigma-AldrichG9779 
  GlukozaThermoFisher Scientific15023-02125% (w/v) Roztwór, filtr 0,2 mm sterylizowany
Osocze kurczakaCocalico Biologicals30-0300-5LUwodnić w sterylnej wodzie, odwirować przy 2500 x g 30 min przy 4 &stopniach; C, szybkie zamrażanie podwielokrotności w ciekłym azocie i przechowywanie w  -80 stopni Celsjusza
Trombina, miejscowa (bydlęca)PfizerTrombin-JMISzybkie zamrażanie podwielokrotności w ciekłym azocie w stężeniu 1,000 jednostek międzynarodowych/ml w dostarczonym rozcieńczalniku i przechowywanie w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Stosować w dawce 250 jednostek/ml.
InkubatorBellco BiotechSciERA
FormaModel 3956
N21-MAXThermoFisher ScientificAR008
Pen/Strep (100X)ThermoFisher Scientific15140122
200 mM GlutaminaThermoFisher Scientific25030081
GlukozaThermoFisher Scientific15023-02125% (w/v) Roztwór, filtr 0,2 mm sterylizowany
Neurobasal AThermoFisher Scientific10888-022 Kompletna pożywka: 48 ml Neurobasal A, 1 ml N21-MAX, 0,625 ml 200 mM glutaminy, 0,180 ml 25% glukozy, 0,250 ml 100x wstrzykiwacz/paciorkowiec.
Opakowanie lentiwirusa trzeciej generacjiLife TechnologiesK4975-00
159 K odcinające filtry odśrodkowe (Centricon)EMD Millipore
Lentiviral system klonowania (InFusion)Clonetech
Plasmids 30323, 50856, 51279Addgene
Barwnik żywotności komórek neuronalnych (NeuO)Technologie komórek macierzystych1801Rozmrozić raz i szybko zamrozić w 4 i mikro; L podwielokrotności. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Mikroskop odwróconyOlympusIX83
Obiektywy mikroskopoweOlympuspowietrze: 4X, 20; olej: 40X, 60X,
system konfokalny z wirującym dyskiemYokagawaCSU22
Mikroskop EMCCD KamerafotometrycznaKaskada II
Kodowanie liniowe (x,y), piezoelektryczny z płaskim górnym stopniemASI
Lasery mikroskopowe i integracjaInnowacje w zakresie inteligentnego obrazowania
HEK293T komórekAmerican Type Culture CollectionCRL-3216
Ludzka plazminaSigma AldrichP18670,002 U/ml w 0,1% albuminie surowicy bydlęcej (filtr 0,2 mm sterylizowany), szybkie zamrażanie w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze -80 stopni Celsjusza.
Gumowe przelotki " Palnik rolkowy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
  2. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  3. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  4. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  5. Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
  6. Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
  7. Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -P., Béīque, J. -C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
  8. Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
  9. Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, Suppl 2 10365-10370 (2013).
  10. Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
  11. Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
  12. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
  13. He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
  14. Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
  15. Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
  16. Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609(2013).
  17. Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
  18. Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
  19. Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
  20. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  21. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556(2011).
  22. Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
  23. Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27(2010).
  24. Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89(2015).
  25. Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
  26. Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
  27. Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
  28. Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
  29. Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer's disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
  30. Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10(2011).
  31. Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995(2014).
  32. Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6(2015).
  33. Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Brain Slice CultureRoller Tube MethodPhotoetched CoverslipsFluorescence ImagingViral Vector ExpressionNeuronal Vital DyeConfocal MicroscopyHippocampal SlicesLong term CultureEnclosed System

Related Articles