Opisany jest podstawowy protokół oceny toksyczności substancji chemicznych u zwierzęcia modelowego, Caenorhabditis elegans. Metoda ta jest wygodna i przydatna przy opracowywaniu farmaceutyków, a także przy ocenie ryzyka związanego z różnymi zanieczyszczeniami środowiska.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar wpływu substancji chemicznych na wzrost i rozmnażanie Caenorhabditis elegans
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ocena toksykologiczna jest kluczowa dla zrozumienia wpływu chemikaliów na organizmy żywe w podstawowych i stosowanych dziedzinach nauk biologicznych. Caenorhabditis elegans, niewystępujący u ssaków, jest cennym organizmem modelowym do badań toksykologicznych ze względu na wygodę i brak problemów etycznych u zwierząt w porównaniu z systemami ssaków. W protokole tym opisano szczegółową procedurę oceny toksykologicznej substancji chemicznych C. elegans. Kliniczny lek przeciwnowotworowy, etopozyd, który jest ukierunkowany na ludzką topoizomerazę II i hamuje replikację DNA ludzkich komórek nowotworowych, został wybrany jako modelowa substancja chemiczna do testów. Jaja C. elegans zsynchronizowane z wiekiem były wystawione na działanie dimetylosulfotlenku (DMSO) lub etopozydu, a następnie wzrost C. elegans monitorowano codziennie przez 4 dni za pomocą obserwacji mikroskopu stereoskopowego. Całkowita liczba jaj złożonych z C. elegans traktowanych DMSO lub etopozydem została również policzona za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Leczenie etopozydem znacząco wpłynęło na wzrost i reprodukcję C. elegans. Porównując całkowitą liczbę jaj złożonych z robaków z różnymi okresami leczenia chemikaliami, można stwierdzić, że szkodliwy wpływ substancji chemicznych na rozrodczość C. elegans jest odwracalny lub nieodwracalny. Protokoły te mogą być pomocne zarówno w opracowywaniu różnych leków, jak i ocenie ryzyka związanego z toksycznymi substancjami środowiskowymi.
Wprowadzenie
Ocena toksykologiczna jest niezbędna do rozwoju farmaceutyków, nutraceutyków i kosmeceutyków, a także do oceny ryzyka różnych toksyn środowiskowych. Model gryzoni jest jednym z najpopularniejszych systemów eksperymentalnych in vivo w tym badaniu toksykologicznym; alternatywnie szeroko stosowane są również organizmy inne niż ssaki, takie jak C. elegans. Modele oceny toksykologicznej u zwierząt innych niż ssaki są korzystne nie tylko ze względu na kwestie etyczne zwierząt, ale także ze względu na ich wygodę i użyteczność, biorąc pod uwagę opłacalność, łatwość konserwacji, szybkość i odtwarzalność1,2,3,4.
C. elegans, robak okrągły glebowy, był wykorzystywany jako zwierzę modelowe w różnych podstawowych i stosowanych badaniach biologicznych i chemicznych. Jest to przezroczysty nicień o długości 1 mm, który jest po prostu utrzymywany w stałym lub płynnym pożywce wzrostowej nicieni (NGM) karmionej szczepem bakteryjnym Escherichia coli OP50. C. elegans ma krótki cykl życiowy, a C. elegans typu dzikiego N2 składa około 300 jaj. Dlatego można go łatwo rozmnażać i wykorzystać jako materiały eksperymentalne3,4,5. C. elegans jest również szeroko stosowany w badaniach toksykologicznych wielu leków i zanieczyszczeń środowiska6,7,8,9.
Ponieważ wiele leków przeciwnowotworowych celuje w szybko dzielące się komórki rakowe, mogą one również uszkadzać szybko dzielące się normalne komórki, takie jak szpik kostny, nabłonek jelitowy i komórki mieszków włosowych. Na przykład leki przeciwnowotworowe hamujące topoizomerazę są ukierunkowane na proces replikacji DNA komórek rakowych; W związku z tym hamują również szybko dzielące się normalne komórki. Każdy żywy organizm ma topoizomerazy, a te inhibitory topoizomerazy najprawdopodobniej wpływają na ekosystemy środowiskowe6,10,11. W związku z tym platforma oceny toksykologicznej leków z wykorzystaniem zwierzęcia modelowego jest cenna zarówno dla opracowywania leków, jak i oceny ryzyka środowiskowego.
W tym artykule opisujemy szczegółowe protokoły testowania toksyczności etopozydu, który jest klinicznym środkiem przeciwnowotworowym ukierunkowanym na topoizomerazę II, jako modelowej toksycznej substancji chemicznej u C. elegans. W tym celu opiszemy metodę pomiaru wielkości ciała i całkowitej liczby jaj składanych u C. elegans traktowanych etopozydem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Cały eksperyment musi być przeprowadzony w czystym, odizolowanym laboratorium utrzymywanym w temperaturze 20 °C z niskim zapyleniem i z minimalizacją zanieczyszczeń podczas pracy z robakami i bakteriami. W tym celu eksperymenty muszą być przeprowadzane pod płomieniem lampy alkoholowej lub przy użyciu czystej ławki.
1. Utrzymanie C. elegans i przygotowanie jaj do testu chemicznego
- Utrzymuj C. elegans N2 (var. Bristol) na płytce agarowej NGM karmionej żywym E. coli OP50 w temperaturze 20 °C12,13.
- Przygotuj jaja zsynchronizowane z wiekiem, korzystając z roztworu wybielacza5, lub metody składania jaj w czasie6,14,15.
UWAGA: Przed przygotowaniem jaj należy pokryć płytkę NGM zawierającą etopozyd inaktywowanym termicznie E. coli OP50, jak opisano poniżej. Inaktywowana termicznie E. coli OP50 służy do minimalizacji aktywności metabolicznej E. coli6,16.
2. Przygotowanie inaktywowanej termicznie E. coli OP50 do karmienia C. elegans podczas badania toksyczności
- Przygotować 500 ml pożywki z podwójnym tryptonem drożdżowym (DYT) zgodnie z opisem w Tabeli 1 i zaszczepić pojedynczą kolonię E. coli OP50 hodowaną na płytce agarowej Luria-Bertani (LB)5.
- Inkubować E. coli OP50 w inkubatorze z wytrząsaniem przez 14 godzin w temperaturze 37 °C i przy prędkości 150 obr./min.
- Po odwirowaniu przez 30 minut w temperaturze 3,220 x g i temperaturze 20 °C, usunąć całe sklarowane nad osadem podłoże DYT i dodać wstępną mieszaninę 25 ml buforu S, 250 μl 1 MMgSO4 i 25 μL 5 mg/ml cholesterolu (rozpuszczonego w etanolu). Wszystkie te roztwory są sterylne.
- Ponownie zawieś bakterie i przenieś je do jednorazowej plastikowej probówki o pojemności 50 ml.
- W celu inaktywacji termicznej inkubować ponownie zawieszoną E. coli OP50 w łaźni wodnej przez 30 minut w temperaturze 65 °C.
- Schłodzić do temperatury pokojowej i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Można go przechowywać przez okres do jednego miesiąca.
3. Przygotowanie płytek NGM zawierających 1% DMSO lub etopozyd 750 μM
- Przygotuj dwie czyste szklane butelki o pojemności 200 ml. Do jednej butelki dodać 0,6 g NaCl, 0,5 g peptonu, 3,4 g agaru i 195 ml wody destylowanej oraz mieszadło magnetyczne. Dodaj mieszadło magnetyczne do drugiej pustej butelki.
- Obie butelki należy sterylizować w autoklawie przez 15 minut w temperaturze 121 °C, a następnie schłodzić je w łaźni wodnej przez 30 minut w temperaturze 55 °C.
- Dodać 0,2 ml 1 M CaCl2, 0,2 ml 5 mg/ml cholesterolu, 0,2 ml 1 MMgSO4 i 5 ml 1 M KPO4 (wszystkie te roztwory są sterylne), a następnie wymieszać je mieszając magnetycznie na gorącej płycie w temperaturze 55 °C.
- Podziel zmieszaną pożywkę NGM na dwie butelki o tej samej objętości (100 ml każda). Następnie dodaj 1 ml DMSO do jednej butelki, ponownie wymieszaj za pomocą mieszania magnetycznego. Drugą butelkę należy przechowywać w łaźni wodnej w temperaturze 55 °C do następnego etapu. Podwielokrotność 3 ml pożywki zawierającej DMSO na każdą szalkę Petriego o wymiarach 35 x 10mm2. Na tym etapie można wykonać około 33 płyt NGM zawierających DMSO.
- Wymieszać drugą butelkę za pomocą mieszadła magnetycznego, dodać 1 ml 75 mM etopozydu (bulion rozpuszczony w DMSO), ponownie wymieszać i powtórzyć procedurę podwielokrotności (krok 3.4). Na tym etapie można wykonać około 33 płytek NGM zawierających etopozyd (750 μM).
UWAGA: W skorelowanym poprzednim artykule6, przetestowaliśmy 0, 250, 500 i 1,000 μM etopozydu. Na podstawie tych danych wybraliśmy w tym artykule dawkę etopozydu wynoszącą 750 μM. - Schłodzić płytki NGM zawierające chemikalia do temperatury pokojowej, pozostawiając je w temperaturze pokojowej na około 3 godziny i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
UWAGA: W przypadku chemikaliów wrażliwych na światło należy blokować światło, aby zminimalizować rozkład wywołany światłem.
UWAGA: Opcjonalnie należy wykonać normalną płytkę NGM bez chemikaliów do testu składania jaj, który można przeprowadzić przy użyciu dwóch różnych warunków obróbki chemicznej, jak opisano poniżej. - Dodać 100 μl inaktywowanej termicznie E. coli OP50 (jak opisano w sekcji 2) i rozprowadzić na każdej płytce NGM. Pozostawić do wyschnięcia na noc w inkubatorze C. elegans w temperaturze 20 °C do przeprowadzenia testu chemicznego.
4. Pomiar wzrostu C. elegans
- Przenieś zsynchronizowane z wiekiem jaja C. elegans na płytkę NGM uzupełnioną 1% DMSO lub etopozydem 750 μM.
- Inkubować C. elegans w inkubatorze w temperaturze 20 °C przez 4 dni. Obserwuj robaki za pomocą mikroskopu stereoskopowego i codziennie rób zdjęcia mikroskopowe. Zwykle 20-krotne powiększenie (soczewka obiektywowa 1X, powiększenie 2X zoom i 10-krotna soczewka okularowa) jest odpowiednie do obserwacji wzrostu C. elegans. Wykonaj również obraz mikroskopowy mikrometru stolikowego mikroskopu w celu kalibracji rozmiaru ślimaka.
UWAGA: Głód wpływa na test toksyczności. Dlatego nakarm się wystarczającą ilością bakterii lub na początku dostosuj liczbę przenoszonych jaj C. elegans. Obserwuj do 3 dni, aby wykluczyć możliwość głodu. - Zmierz długość ciała C. elegans poddanych działaniu DMSO lub etopozydu w każdym punkcie czasowym za pomocą oprogramowania ImageJ.
UWAGA: Do każdego pomiaru próbki wystarczy 50 robaków do analizy statystycznej.- W ImageJ otwórz obraz mikrometru na stoliku mikroskopu ("Plik" → "Otwórz").
UWAGA: Obraz mikrometru i obrazy robaka (krok 4.2) muszą mieć to samo powiększenie. - Przeciągnij linię o długości 1 000 μm na obrazie kalibracji mikrometru za pomocą narzędzia "Linia prosta".
- Kliknij "Analizuj" → "Ustaw skalę" i wprowadź 1,000 i μm odpowiednio w polach "Znana odległość" i "Jednostka długości". Zaznacz "Globalne" i kliknij "OK".
- Otwórz obrazy robaka ("Plik" → "Otwórz"). Narysuj linię wzdłuż cechy każdego robaka za pomocą narzędzia "Linia odręczna". Uzyskaj dane dotyczące długości ciała, klikając "Analizuj" → "Zmierz".
- Powtórz te kroki dla 50 robaków.
- W ImageJ otwórz obraz mikrometru na stoliku mikroskopu ("Plik" → "Otwórz").
5. Test składania jaj przez C. elegans
- Jaja zsynchronizowane z wiekiem wysiadywać na płytce NGM zawierającej DMSO lub etopozyd przez 64 godziny (przed pierwszym urodzeniem) aż do stadium młodego dorosłego osobnika w temperaturze 20 °C.
UWAGA: Użycie robaków z eksperymentów pomiaru wzrostu jest opcjonalne. Wygodnie jest wykonać jednocześnie pomiar wzrostu i test składania jaj. - Przenieść 5 dorosłych robaków na nową płytkę NGM bez chemikaliów (warunek 1, obróbka chemiczna w określonym czasie, od stadium jaj do młodego dorosłego osobnika) lub nową płytkę NGM zawierającą tę samą chemiczną obróbkę wstępną (warunek 2, ciągłe narażenie na chemikalia przez cały okres doświadczalny), a następnie inkubować je przez 24 godziny
UWAGA: Zaleca się wykonywanie powtórzeń przy użyciu płytek 3-5 NGM do każdego zabiegu; Powtórzenia te można wykorzystać do analizy statystycznej. - Przenieś na nową płytkę NGM zgodnie z powyższym opisem i policz liczbę jaj każdego dnia. Policz robaki, które wypełzły z domu, umarły i wykluły się wewnętrznie.
- Powtarzaj te kroki, aż robaki przestaną składać jaja, zwykle w ciągu 5 dni.
- Oblicz liczbę jaj złożonych na robaka z każdej płytki i sumuj te wartości codziennie przez 5 dni, aby określić całkowitą liczbę złożonych jaj.
UWAGA: Z obliczeń należy wykluczyć liczbę robaków, które wypełzły i wykluły się wewnętrznie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Leczenie etoposydem (24-96 h) znacząco zahamowało wzrost C. elegans. Po 96 h inkubacji nicienie traktowane etoposydem osiągnęły długość ciała 0,86 mm, podczas gdy nicienie traktowane nośnikiem osiągnęły 1,04 mm (Rycina 1). Zahamowanie wzrostu było również widoczne podczas obserwacji pod mikroskopem stereoskopowym (Rycina 2). Jaja u nicieni traktowanych nośnikiem zaczęły pojawiać się po 72 h inkubacji. Z kolei jaja zaobse...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym artykule opisujemy ocenę toksyczności substancji chemicznych w C. elegans, nicieniu glebowym, na przykładzie etopozydu. W tym celu wykorzystaliśmy dwa warunki eksperymentalne. W pierwszym zestawie C. elegans hodowano na płytkach zawierających etopozyd od jaj do stadium młodego dorosłego osobnika, a następnie robakom pozwolono składać jaja na normalnych płytkach NGM bez chemikaliów. W drugim zestawie eksperymentalnym C. elegans były stale leczone etopozydem przez cały okres eksperymentalny...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez grant badawczy Koreańskiego Instytutu Nauki i Technologii (2E27513) oraz Program Rozwoju Technologii Żywności o Wysokiej Wartości (IPET) finansowany przez Ministerstwo Rolnictwa, Żywności i Spraw Wiejskich (315067-03).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agar | Affymetrix, Stany Zjednoczone | 10906 | |
| Caenorhabditis elegans | N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cholesterol typu dzikiego | |
| Sigma, USA | C3045 | ||
| Dimetylosulfotlenek | Sigma, USA | D2650 | |
| Escherichia coli OP50 | Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC) | ||
| Etopozyd | Sigma, USA | E1383 | |
| Oprogramowanie Image J (wer. 1.4) | Natinoal Institute of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Kamera mikroskopowa | Jenopitk, Progress Gryphax, Niemcy | ||
| Peptone | Merck, USA | 107213 | |
| 35 i razy; 10 mm szalka Petriego | SPL Life Sciences, Korea Południowa | 10035 | |
| 90 & razy; 15 mm szalka Petriego | SPL Life Sciences, Korea Południowa | 10090 | |
| Mikroskop stereoskopowy | Nikon, Japonia | SMZ800N | |
| Ekstrakt drożdżowy | Becton Dickinson, USA | 212750 |
Bibliografia
- Blomme, E. A., Will, Y. Toxicology strategies for drug discovery: present and future. Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).
- Lilienblum, W., et al. Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH). Arch. Toxicol. 82 (4), 211-236 (2008).
- Honnen, S. Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine. Arch. Toxicol. , In Press (2017).
- Hunt, P. R. The C. elegans model in toxicity testing. J. Appl. Toxicol. 37 (1), 50-59 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environ. Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Imanikia, S., et al. The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).
- Guo, X., et al. Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage. Chemosphere. 155, 115-126 (2016).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function. Environ. Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. Lead phytochemicals for anticancer drug development. Front. Plant Sci. 7, 1667(2016).
- Kang, K., et al. A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide. Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. J. Vis. Exp. (27), e1152(2009).
- Weimer, S., et al. D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice. Nat. Commun. 5, 3563(2014).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).
- Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (96), e52445(2015).
- Hahm, J. H., et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat. Commun. 6, 8919(2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321(2015).
- Schmidt, B. Z., et al. In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities. Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).
- Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line. Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
