Multipleksowe profilowanie cytokin stymulowanych splenocytów myszy przy użyciu cytometrycznej platformy testów immunologicznych opartych na kulkach

Summary

Ten protokół opisuje kwantyfikację wielu celów cytokin jednocześnie w supernatantach hodowli tkankowej pobranych ze stymulowanych mysich splenocytów przy użyciu platformy testów immunologicznych opartych na multipleksie i cytometru przepływowego.

Abstract

Testy immunologiczne oparte na koralikach wykorzystują tę samą podstawową zasadę, co testy immunologiczne kanapkowe. Kulki wychwytujące, które można rozróżnić na podstawie wielkości i intensywności fluorescencji wewnętrznej allofikocyjaniny (APC), są sprzężone z przeciwciałami specyficznymi dla danego analitu. Następnie wybrany panel zdefiniowanych zestawów kulek wychwytujących jest inkubowany z próbką biologiczną zawierającą docelowe anality specyficzne dla przeciwciał wychwytujących. Dodaje się biotynylowany koktajl przeciwciał detekcyjnych, który prowadzi do powstania kanapek z przeciwciałami wykrywającymi perełki i anality.

Na koniec, dodaje się streptawidynę-fikoerytrynę (SA-PE), która wiąże się z biotynylowanymi przeciwciałami detekcyjnymi, zapewniając intensywność sygnału fluorescencyjnego proporcjonalnie do ilości związanego analitu. Sygnał fluorescencyjny PE regionów kulek specyficznych dla analitu jest oznaczany ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej, a stężenia poszczególnych analitów są oznaczane za pomocą oprogramowania do analizy danych i krzywej wzorcowej wygenerowanej w teście.

W tym eksperymencie używamy mysiego panelu cytokin pomocniczych T, aby jednocześnie określić stężenie 13 oddzielnych celów cytokin w supernatantach do hodowli tkankowych pobranych z mysich splenocytów hodowanych w różnych warunkach stymulujących.

Introduction

W swojej roli rozpuszczalnych cząsteczek sygnałowych, cytokiny pośredniczą w wysoce skoordynowanych i wieloczynnikowych procesach, które regulują odpowiedzi immunologiczne gospodarza. Ulegają one ekspresji na wszystkich etapach procesu zapalnego, od jego zainicjowania do ustąpienia, i regulują złożoną sieć interakcji, która obejmuje ich własną syntezę oraz syntezę receptorów komórkowych¹. Ta sieć komunikacyjna jest złożona ze złożonością, która wykracza poza synergiczne lub antagonistyczne relacje, które mogą istnieć między poszczególnymi komponentami. Rzeczywiście, wiadomo, że wiele cytokin ma nadmiarowe lub przynajmniej częściowo nakładające się funkcje^2,3.

Zintegrowane podejścia do biologii systemowej, które jednocześnie określają ilościowo wiele analitów cytokin, obecnie dostarczają coraz bardziej wszechstronnego zrozumienia unikalnych cytokinomów, które koordynują reakcje immunologiczne leżące u podstaw wielu stanów chorobowych4^,5. Te stany chorobowe obejmują uogólnione stany zapalne po raka, stany neurodegeneracyjne i choroby układu krążenia^6,7,8,9.

Takie sieci cytokin mogą być skutecznie badane za pomocą testów immunologicznych opartych na koralikach LEGENDplex. Testy te opierają się na tej samej zasadzie, co test immunoenzymatyczny typu sandwich (ELISA) i wykorzystują mikrosfery kodowane fluorescencją z przeciwciałami wychwytującymi węzłencyjnie przyłączonymi do ich powierzchni. Przeciwciała te są unieruchomione na powierzchniach znacznie mniejszych niż te wymagane przez tradycyjne formaty ELISA. Umożliwia to wykonywanie takich testów przy znacznie mniejszej objętości próbki, przy jednoczesnym zmniejszeniu niespecyficznego wiązania i zapewnieniu multipleksowanej analizy kilku analitów.

Test opisany w tym protokole wykorzystuje tę technologię do ilościowego oznaczania do 13 celów jednocześnie. Dane z tego testu można uzyskać za pomocą szerokiej gamy powszechnie dostępnych cytometrów przepływowych i w przeciwieństwie do innych dostępnych testów nie wymaga użycia dedykowanego oprzyrządowania specyficznego dla testu. Dzięki rozszerzającemu się katalogowi zwalidowanych paneli analitowych, testy te zostały wykorzystane w kilku trwających projektach badań biomedycznych^10,11,12,13.

Aby zademonstrować łatwość i użyteczność formatu testu, w tym eksperymencie używamy panelu cytokin T pomocniczych myszy do ilościowego oznaczania 13 oddzielnych stężeń cytokin z supernatantów z hodowli tkankowej uzyskanych z mysich splenocytów hodowanych w wielu warunkach stymulujących. Oprócz supernatantów do hodowli tkankowych test ten można również przeprowadzić przy użyciu próbek surowicy lub osocza.

Protocol

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami NIH zawartymi w Przewodniku do opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez IACUC w BioLegend.

Rysunek 1: Podsumowanie procedury oznaczania płytek filtracyjnych. Protokół przeprowadzania testu przy użyciu płytek filtracyjnych jest przedstawiony jako diagram przedstawiający kluczowe składniki testu i etapy inkubacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie próbki biologicznej

UWAGA: Wybrane miejsce anatomiczne i objętość pobrania krwi jest pozostawione do uznania każdego badacza z osobna i nie będzie miało wpływu na wynik testu. Jednak po ich uzyskaniu z próbkami należy postępować zgodnie z poniższymi krokami.

1. Przygotowanie próbek surowicy
   1. Pobrać żądaną objętość krwi do preferowanej probówki do pobrania krwi i pozostawić ją do krzepnięcia przez co najmniej 30 minut.
   2. Odwirowywać próbkę przez 10 minut przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej.
   3. Natychmiast usunąć surowicę i oznaczenie zawartości lub podać porcję do probówek do mikrowirówek z polipropylenu i przechowywać próbki w temperaturze ≤ -20 °C.
2. Przygotowanie próbek osocza
   1. Pobrać żądaną objętość krwi za pomocą probówek do pobierania krwi pokrytych kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA).
   2. Wirować przez 10 minut przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej w ciągu 30 minut od pobrania.
   3. Natychmiast usunąć osocze i oznaczenie zawartości lub porcjować do probówek do mikrowirówek z polipropylenu i przechowywać próbki w temperaturze ≤ -20 °C.
3. Przygotowanie próbek supernatantu do kultur tkankowych
   1. Odwirować próbkę przez 10 minut w temperaturze 1 500 x g w temperaturze 4 °C w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń.
   2. Zebrać supernatant i natychmiast oznaczyć lub podwielokrotność do probówek do mikrowirówek z polipropylenu i przechowywać w temperaturze ≤ -20 °C.
4. Rozmrażanie zamrożonych próbek biologicznych
   1. Całkowicie rozmrozić wszystkie wcześniej zamrożone próbki biologiczne na lodzie i krótko odwirować przed użyciem. Unikaj więcej niż 2 cykli zamrażania/rozmrażania.
      UWAGA: Próbki użyte w tym protokole uzyskano poprzez hodowlę mysich splenocytów BALB/c (1 x 10⁶ komórek w temperaturze 37 °C + 5% CO₂ w różnych warunkach: niestymulowane, LPS (100 ng / ml), αCD3 (1 μg / ml powlekane płytką) + αCD28 (1 μg / ml rozpuszczalne), PMA (20 ng / ml) + jonomycyna (500 ng / ml). Supernatanty hodowlane zebrano po 48 godzinach i przetworzono zgodnie z opisem w sekcji 1.3.

2. Przygotowanie odczynnika

1. Przygotowanie wstępnie zmieszanych kulek unieruchomionych przeciwciałami
   1. Wstępnie zmieszaną butelkę z kulkami należy poddać sonifikacji przez 1 minutę w kąpieli sonikołacyjnej w temperaturze pokojowej, a następnie wirować przez 30 s przed użyciem. Jeśli kąpiel sonicyjna nie jest dostępna, należy wydłużyć czas wirowania do 1 minuty.
2. Przygotowanie buforu do płukania
   1. Doprowadź 20x bufor do płukania (20x PBS z 1% Tween-20) dostarczony z zestawem do temperatury pokojowej i wiruj, aby wprowadzić wszystkie sole do roztworu.
   2. Rozcieńczyć 25 ml 20x buforu do płukania w 475 ml wody dejonizowanej. Niewykorzystaną porcję przechowywać w temperaturze od 2 °C do 8 °C przez okres do jednego miesiąca.
3. Przygotowanie matrycy B (do stosowania wyłącznie z próbkami surowicy i osocza)
   1. Dodać 5,0 ml buforu testowego (PBS z 1% BSA) dołączonego do zestawu do butelki zawierającej liofilizowaną matrycę B. Odczekać co najmniej 15 minut do całkowitego rozpuszczenia, a następnie dobrze wymieszać. Resztki rozpuszczonej matrycy B można przechowywać w temperaturze ≤ -70 °C przez okres do jednego miesiąca.

3. Przygotowanie standardowe

UWAGA: Każdy analit w tym panelu ma najwyższe standardowe stężenie 10 000 pg/ml.

1. Dodać 250 μl buforu testowego, aby rozpuścić liofilizowany standardowy koktajl cytokin Th dla myszy. Wymieszać przez krótkie wirowanie i pozostawić fiolkę w temperaturze pokojowej na 10 minut.
2. Przenieś standardowy koktajl do polipropylenowej probówki wirówkowej oznaczonej "C7". Będzie to używane jako najwyższy standard.
3. Oznacz 6 probówek do mikrowirówek z polipropylenu jako C6, C5, C4, C3, C2 i C1.
4. Dodać 75 μl buforu testowego do każdej z tych probówek.
5. Przenieś 25 μl najwyższej klasy C7 do probówki C6 i dobrze wymieszaj, wirując. Będzie to standard C6.
6. Kontynuuj wykonywanie seryjnych rozcieńczeń 1:4, używając nowej końcówki pipety dla każdej probówki, aby dodać 25 μl poprzedniego wzorca do 75 μl buforu testowego w następnej najniższej probówce wzorcowej, a następnie wirować w celu uzyskania wzorców C5, C4, C3, C2 i C1. Użyj buforu testowego jako wzorca 0 pg/ml (C0).

4. Rozcieńczenie próbki

UWAGA: Wstępne eksperymenty pilotażowe z użyciem tego testu z wieloma rozcieńczeniami mogą być wymagane w celu określenia najbardziej odpowiedniego współczynnika rozcieńczenia dla określonego zestawu próbek biologicznych. Odpowiedni współczynnik rozcieńczenia pozwoli na obliczenia stężenia dla próbki, które mieszczą się w granicach krzywej wzorcowej. Poniższe kroki mają charakter orientacyjny i mogą wymagać empirycznego określenia w zależności od rodzaju próbki.

1. Rozcieńczyć próbki surowicy lub osocza 2-krotnie buforem do oznaczania (np. rozcieńczyć 50 μl próbki 50 μl buforu do oznaczania) w polipropylenowych probówkach wirówkowych.
   UWAGA: Jeśli wymagane jest dalsze rozcieńczanie próbki, rozcieńczenia należy przeprowadzać za pomocą matrycy B zamiast buforu testowego, aby zapewnić dokładny pomiar. Dodanie próbek surowicy lub osocza bez rozcieńczenia spowoduje niską dokładność testu i może zatkać płytkę filtracyjną. Macierz B składa się z połączonej surowicy myszy pozbawionej endogennych celów testu. Jest stosowany jako rozcieńczalnik do próbek surowicy lub osocza, aby uniknąć efektów matrycy, o których wiadomo, że wpływają na czułość analityczną testów immunologicznych.
2. Badać próbki sklarowanych nad natryskiem do hodowli komórkowych bez rozcieńczania.
   UWAGA: Poziomy analitu mogą się znacznie różnić w zależności od próbki. W razie potrzeby rozcieńczyć próbki sklarowanego osadu, stosując świeże przygotowanie odpowiadającego im podłoża do hodowli komórkowych lub buforu do oznaczania.

5. Procedura testowa

UWAGA: Test może być przeprowadzony na polipropylenowych płytkach filtracyjnych, mikro probówkach FACS lub mikropłytkach V-bottom. Procedura oznaczania płytek filtracyjnych jest zalecana ze względu na dobrą konsystencję próbki do próbki, solidność testu i łatwość obsługi. Ta procedura wymaga jednostki filtracji próżniowej do mycia (dostarczonej przez użytkownika końcowego).

1. Przed użyciem należy odczekać, aż wszystkie odczynniki ogrzeją się do temperatury pokojowej (20 - 25 °C).
2. Umieść płytkę filtracyjną na odwróconej pokrywie płytki przez cały czas podczas przygotowania do testu i etapów inkubacji, tak aby spód płytki nie dotykał żadnych powierzchni, ponieważ może to spowodować wyciek.
3. Utrzymuj płytkę w pozycji pionowej podczas całej procedury testowania, w tym etapów mycia, aby uniknąć utraty kulek.
4. Trzymaj płytkę w ciemności lub owiń folią aluminiową na wszystkich etapach inkubacji.
5. Uruchom wszystkie wzorce i próbki jako duplikaty, ułożone na płycie w kolejności sekwencyjnej.
6. Wstępnie zwilż płytkę filtracyjną, dodając 100 μl 1x buforu do płukania do każdej studzienki i pozostaw na 1 minutę w temperaturze pokojowej (jeśli używasz mikropłytki z dnem filtra).
7. Usunąć objętość bufora za pomocą kolektora próżniowego (5 - 10 s). Nie przekraczaj 10 " Hg próżni. Zetrzyj nadmiar buforu do mycia od spodu talerza, dociskając talerz do stosu czystych ręczników papierowych. Umieść płytkę na odwróconej pokrywie płyty.
   UWAGA: Kroki 5.1 - 5.2 można pominąć, jeśli przeprowadza się test przy użyciu mikropłytki V-bottom lub mikroprobówek FACS.
8. W przypadku próbek supernatantu z hodowli komórkowych dodać 25 μl buforu testowego do wszystkich studzienek. Dodać 25 μl każdego wzorca do studzienek wzorcowych. Dodać 25 μl każdej próbki do dołków na próbki.
9. W celu pomiaru próbek surowicy lub osocza dodać 25 μl matrycy B do studzienek wzorcowych. Dodać 25 μl buforu do oznaczania do dołków na próbki. Dodać 25 μl każdego wzorca do studzienek wzorcowych. Dodać 25 μl każdej rozcieńczonej próbki surowicy lub osocza do dołków na próbki.
10. Mieszaj koraliki przez 30 sekund. Dodaj 25 μl zmieszanych kulek do każdej studzienki, potrząsając butelką z koralikami z przerwami, aby uniknąć osiadania koralików. Ostateczna objętość powinna wynosić 75 μl w każdym dołku po dodaniu kulek.
11. Uszczelnij płytkę za pomocą uszczelniacza do płyt. Owiń całą płytę, w tym odwróconą pokrywę talerza, folią aluminiową. Umieść płytkę na wytrząsarce do płytek, zabezpiecz ją i potrząsaj z prędkością około 500 obr./min przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Aby zapobiec wyciekom, nie należy wywierać nadciśnienia na uszczelniacz do płyt.
12. Nie odwracając, umieść płytkę na kolektorze próżniowym i zastosuj próżnię jak poprzednio i dodaj 200 μl 1x buforu płuczącego do każdej studzienki.
13. Usunąć zawartość studzienek na płytce testowej przez filtrację próżniową. Nadmiar buforu do mycia zetrzyj z dna talerza wkładką chłonną lub ręcznikami papierowymi. Powtórz ten krok jeszcze raz.
    UWAGA: Jeśli test jest wykonywany przy użyciu mikropłytki V-bottom lub mikroprobówek FACS, pomiń kroki 5.12 i 5.13. Zamiast tego odwirować płytkę o sile 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć supernatant za pomocą pipety wielokanałowej.
14. Dodać 25 μl przeciwciał wykrywających (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki.
15. Uszczelnij płytkę świeżym uszczelniaczem do płyt. Owiń całą płytę, w tym odwróconą pokrywę talerza, folią aluminiową.
16. Umieścić płytkę na wytrząsarce do płytek i wstrząsać z prędkością około 500 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
17. Bez odkurzania dodaj 25 μl odczynnika SA-PE bezpośrednio do każdej studzienki. Rozcieńczanie odczynnika nie jest konieczne.
18. Uszczelnij płytkę świeżym uszczelniaczem do płyt. Owiń całą płytę, w tym odwróconą pokrywę talerza, folią aluminiową.
19. Umieść płytkę na wytrząsarce do płytek i potrząsaj z prędkością około 500 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
20. Powtórz krok 5.13 powyżej.
21. Dodaj 200 μl 1x buforu do płukania do każdej studzienki. Ponownie zawieś koraliki na wytrząsarce talerzy na 1 minutę.
22. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś próbki z płytki filtracyjnej do probówek FACS, aby odczytać próbki z cytometru przepływowego.
    UWAGA: Objętość próbki można zwiększyć z 200 μl do 300 μl, dodając dodatkowe 100 μl 1x buforu do płukania do każdej probówki, aby uniknąć wyschnięcia próbki. W razie potrzeby próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C, chronione przed światłem i analizowane następnego dnia. Jednak długotrwałe przechowywanie próbki może prowadzić do zmniejszenia sygnału.

6. Ustawienie cytometru przepływowego

UWAGA: Aby generować wiarygodne dane, cytometr przepływowy musi być odpowiednio skonfigurowany przed akwizycją danych. Proces ten będzie się różnił pod pewnymi względami dla poszczególnych użytkowników, w zależności od konfiguracji konkretnego urządzenia, na którym przeprowadzany jest test. Poniżej omówiono uogólniony proces konfiguracji cytometru zdolnego do pomiaru PE i APC i wyposażonego zarówno w laser 488, jak i 633 nm.

1. Uruchom cytometr przepływowy i oprogramowanie do akwizycji zgodnie z instrukcjami producenta dostarczonymi z przyrządem.
2. Utwórz wykres punktowy z FSC (rozproszenie do przodu) na osi X i SSC (rozproszenie boczne) dla osi Y. Ustaw FSC i SSC w trybie liniowym.
3. Utwórz drugi wykres punktowy z PE na osi X i APC na osi Y. Ten wykres powinien być ustawiony na tryb wyświetlania oparty na logarytmie.
4. Wiruj fiolkę z surowymi kulkami zawartą w zestawie przez 30 sekund, aby ponownie zawiesić koraliki. Koraliki te zawierają wewnętrzny barwnik APC i składają się z populacji o dwóch rozmiarach.
5. Przenieś 400 μl surowych kulek do nowej probówki FACS.
6. Ustaw natężenie przepływu cytometru przepływowego na niskie.
7. Uruchom surowe koraliki, ostrożnie dostosowując wzmocnienie i napięcie dla FSC i SSC, tak aby populacje tych koralików o obu rozmiarach były widocznie oddzielone i łatwe do zabramkowania.
8. Dostosuj próg FSC, aby wykluczyć niepożądane zdarzenia (np. zanieczyszczenia lub pęcherzyki powietrza).
9. Na wykresie FSC i SSC narysuj bramę, która obejmuje wszystkie populacje koralików.
   UWAGA: Surowe koraliki zawierają populacje koralików o dwóch rozmiarach, mniejsze obszary "Koralików A" i większe obszary "Koraliki B".
10. Wyświetl populacje bramkowanych ściegów z wykresu FSC i SSC na drugim wykresie kropkowym z PE na osi X i APC na osi Y.
11. Dostosuj napięcie PMT dla kanału fluorescencji APC tak, aby sygnał APC dla wszystkich populacji koralików miał medianę intensywności fluorescencji (MFI) mieszczącą się w przedziale od 1 x 10¹ do 5 x 10³.
12. Obracaj fiolkę z kulkami PE przez 30 sekund, aby ponownie zawiesić kulki.
13. Przenieś 400 μl kulek PE do nowej probówki FACS.
14. Zastąp rurkę z surowymi kulkami z cytometru przepływowego rurką z kulkami PE.
15. Dostosuj napięcie lampy fotopowielacza (PMT) dla ustawienia kanału fluorescencji PE tak, aby MFI kulek PE mieściło się w zakresie specyficznym dla partii, który znajduje się na fiolce z kulkami PE.
    UWAGA: Koraliki konfiguracyjne PE zawierają koraliki o jednym rozmiarze populacji (tylko koraliki A).

7. Akwizycja danych

UWAGA: Dokładne procedury związane z pozyskiwaniem danych na danym instrumencie mogą się różnić i zależą od specyfikacji konfiguracji cytometru i używanego oprogramowania interfejsu. Poniższe instrukcje mają zatem na celu podkreślenie wymaganych kroków, które należy podjąć w teście, niezależnie od cytometru zastosowanego w teście.

1. Sprawdź, czy natężenie przepływu cytometru jest nadal ustawione na niskie.
2. Ustaw liczbę zdarzeń ściegu, które mają zostać pobrane, na około 300 na analit. W przypadku panelu 13-plex jest to równoznaczne z uzyskaniem 3,900 zdarzeń połączonych z obu populacji wielkości koralików (koraliki A+B).
3. Wirować każdą próbkę przez 5 s przed analizą.
4. Odczytywanie próbek. Podczas odczytu próbek należy najpierw ustawić cytometr przepływowy w trybie konfiguracji i poczekać, aż populacja kulek ustabilizuje się przed przełączeniem w tryb akwizycji.
5. Używaj prostych nazw z ciągłą numeracją plików danych, aby ułatwić analizę danych.
6. Eksportuj tylko zdarzenia bramkowane (regiony ściegu A + B), a nie zdarzenia łączne.
7. Przechowuj wszystkie pliki FCS w tym samym folderze dla każdego testu. Jeśli uruchamiasz wiele testów, utwórz osobny folder dla każdego testu.

8. Przejdź do analizy danych

UWAGA: Pliki FCS wygenerowane na cytometrze przepływowym powinny być analizowane za pomocą oprogramowania do analizy danych, które można pobrać za darmo¹⁴.

1. Zainstaluj oprogramowanie do analizy danych na komputerze.
2. Przenieś wszystkie pliki testu FCS do komputera, na którym znajduje się oprogramowanie analityczne.
3. Podłącz klucz sprzętowy klucza licencyjnego (dołączony do zestawu) do portu USB komputera.
4. Uruchom oprogramowanie do analizy danych.
5. Kliknij niebieski przycisk "Dodaj pliki" znajdujący się u góry ekranu.
6. Przejdź do folderu zawierającego pliki FCS z testu w wyświetlonym oknie podręcznym.
7. Kliknij i przeciągnij wszystkie pliki testowe FCS z wyskakującego okienka na ekran oprogramowania. Wszystkie pliki powinny teraz pojawić się na liście.
8. Kliknij zielony przycisk "Dalej" w prawym dolnym rogu wyświetlacza. Kliknij lewym przyciskiem myszy i przytrzymaj, aby przeciągnąć małe niebieskie przyciski krzywej standardowej (od C7 do C0) do odpowiadających im plików FCS z listy, aby zdefiniować krzywą standardową.
9. Kliknij zielony przycisk "Dalej" w prawym dolnym rogu wyświetlacza, aby otworzyć wyskakujące okienko bramkowania.
10. Po lewej stronie okna bramkowania wprowadź nazwy docelowych analitów w regionach ściegu A i B oraz powiązany z nimi identyfikator kulki (znajdujący się w instrukcji dołączonej do testu) w porządku rosnącym.
11. Wybierz narzędzie do bramkowania z górnej części wyskakującego okienka i użyj go, aby narysować 2 bramki na wykresie FSC vs. SSC, jedną wokół koralików A, a drugą wokół koralików B.
12. Zapoznaj się z wykresami punktowymi APC i PE, które pojawiają się poniżej wykresu FSC i SSC. W koralikach A (lewy wykres) będzie 6 pasm analitu i 7 pasm analitu w koralikach B (prawy wykres).
    UWAGA: Bramy można przerysować ręcznie, wybierając narzędzie gumki u góry i klikając w celu usunięcia danej bramy. Następnie można wybrać narzędzie do bramkowania i użyć go do ręcznego zastosowania bramki do żądanego obszaru pasma.
13. Kliknij zielony przycisk "OK", aby zamknąć wyskakujące okienko bramkowania i powrócić do listy plików FCS.
14. Zdefiniuj wszelkie rozcieńczenia, które zostały wykonane na próbkach biologicznych, klikając prawym przyciskiem myszy na dany plik, wybierając z menu "Dilution Fold" i wprowadź poprawną wartość.
15. Kliknij zielony przycisk "Uruchom" w prawym dolnym rogu wyświetlacza, aby wygenerować krzywe standardowe dla testu i obliczyć stężenia nieznanych próbek biologicznych.

Results

Ten protokół pokazuje, jak można wykorzystać platformę immunologiczną opartą na koralikach do jednoczesnego ilościowego oznaczania profili cytokin z próbek biologicznych za pomocą cytometru przepływowego. Próbki biologiczne użyte w tym przykładzie były supernatantami do hodowli komórkowych z mysich splenocytów, które wcześniej inkubowano w różnych warunkach aktywacji, chociaż format testu został również zatwierdzony do użytku z próbkami surowicy lub osocza.

Dane wygenerowane z testu są wykorzystywane do konstruowania standardowych krzywych dla wszystkich analitów w panelu multipleksowym. Oprogramowanie do analizy danych klasyfikuje każdy konkretny analit na podstawie unikalnego rozmiaru ściegu i intensywności APC, a następnie określa je ilościowo za pomocą reportera PE. Zakresy dynamiki, jak również czułość testu, są demonstrowane po wykreśleniu na skali logarytmicznej w Rysunek 2A. Oprogramowanie wykorzystuje dane testowe i 5-parametrowy algorytm dopasowania krzywej do dokładnego obliczenia nie tylko stężeń analitów w próbkach biologicznych dostarczonych przez użytkownika, ale także granic wykrywalności zarówno na górnym, jak i dolnym końcu wszystkich krzywych standardowych (tabela 1). Format opisany w tym protokole zapewnia również wysoką precyzję testu. W Rysunek 2B i 2C przedstawiono dane przedstawiające zmienność wewnątrz testu każdego analitu. Dwa oddzielne standardowe stężenia białka (wysokie i niskie) analizowano w jednym teście z 16 powtórzeniami dla każdej próbki. Rysunek 2C i 2D reprezentują zmienność między testami docelowych analitów z trzech niezależnych testów. Podobnie jak w przypadku precyzyjnych eksperymentów wewnątrztestowych, wysokie i niskie standardowe stężenia analizowano z 3 powtórzeniami w każdym z niezależnych eksperymentów. Minimalna zmienność w obliczonym stężeniu docelowych białek jest wyraźnie widoczna.

Aby zademonstrować przydatność testów cytometrycznych opartych na koralikach w badaniu profili ekspresji cytokin, mysie splenocyty były inkubowane w różnych warunkach aktywacji. Oprócz niestymulowanej kontroli, komórki inkubowano również z LPS, przeciwciałami anty-CD3 / anty-CD28 lub 12-mirystynianem 13-octanu forbolu i jonomycyną. Supernatanty z hodowli komórkowych pobrano 48 godzin później i oznaczono przy użyciu panelu cytokin pomocniczych T myszy. Wyniki kwantyfikacji z tego eksperymentu są przedstawione w Rysunek 3, a wpływ warunków stymulacji na stężenia cytokin jest wyraźnie nakreślony.

Opisane powyżej wyniki są typowe, o ile eksperymentator posiada dobrą technikę laboratoryjną i postępuje zgodnie z dostarczonym protokołem testu. Źródła błędów w tym formacie testu mogą wynikać z odchyleń w czasie inkubacji, objętości odczynników, płukania lub z niewłaściwych ustawień PMT w cytometrze przepływowym używanym do analizy próbek. W Rysunek 4A wykres punktowy z udanego testu pokazuje 2 odrębne populacje koralików, które są wyraźnie zdefiniowane. Można to porównać do Rysunek 4B, gdzie słabe mycie i przestrzeganie protokołu doprowadziło do zagregowania koralików, które rozmywają dwie populacje. Ponadto, jak dowodzą szczątki w lewym dolnym kwadrancie, całkowite zdarzenia cytometryczne zostały wyeksportowane do analizy, a nie preferowany format tylko zdarzeń bramkowanych. Właściwa konfiguracja cytometru ma kluczowe znaczenie dla generowania wiarygodnych danych w tym teście. W Rysunek 4C prawidłowe ustawienia PMT pozwalają na rozdzielczość każdego z 6 analitów w kanale klasyfikacyjnym APC. Niewłaściwe ustawienia PMT spowodują, że dane będą podobne do tych przedstawionych w Rysunek 4D, gdzie kanał APC ma populacje ściegów o nakładających się intensywnościach klasyfikacji. Spowoduje to unieważnienie testu, ponieważ niemożliwe będzie obliczenie stężeń analitu bez jasno określonych populacji kulek testowych.

Rysunek 2: Standardowe zakresy krzywych i precyzja oznaczania. (A) Reprezentatywna krzywa wzorcowa wygenerowana przy użyciu panelu cytokin pomocniczych T myszy. Dla każdego testu należy przeprowadzić krzywą wzorcową. (B-C) Precyzja wewnątrz testu. Dwie próbki o różnych stężeniach białek docelowych (wysokie i niskie) analizowano w jednym teście z 16 powtórzeniami dla każdej próbki. Dane są przedstawiane jako średnia + odchylenie standardowe. (D-E) Precyzja między testami. Dwie próbki o różnych stężeniach białek docelowych (wysokie i niskie) analizowano w trzech niezależnych testach z 3 powtórzeniami dla każdej próbki. Dane są przedstawiane jako średnia + odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Kwantyfikacja reprezentatywnych wyników. Mysie śledzionecyty (1 x 10⁶ komórek) hodowano w temperaturze 37 °C + 5% CO₂ w różnych warunkach: niestymulowane, LPS (100 ng / ml), αCD3 (1 μg / ml powlekane płytką) + αCD28 (1 μg / ml rozpuszczalne), PMA (20 ng / ml) + jonomycyna (500 ng / ml). Supernatanty hodowlane zebrano po 48 godzinach, a następnie oznaczono ilościowo za pomocą panelu cytokin pomocniczych T myszy. Wyraźnie widoczne są zróżnicowane profile ekspresji cytokin w odpowiedzi na warunki stymulacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wyniki testów zakończonych powodzeniem i niepowodzeniem. (A) Udane testy będą miały różne populacje kulek dla populacji mikrosfery. (B) Nieudane testy będą miały słabą separację populacji, agregacje kulek i zbyt wiele zebranych zdarzeń. (C) Pomyślne testy mają jasno określone intensywności w kanale fluorescencji klasyfikacji, które są łatwe do bramkowania i ilościowego określenia. (D) Nieudane testy będą miały słabo oddzielone i intensywność klasyfikacji, które nakładają się na wiele populacji koralików, co utrudnia kwantyfikację. Wielu z tych błędów można uniknąć poprzez staranne przestrzeganie protokołu testu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt. pkt. pkt.

	Krzywa standardowa			Czułość (pg/mL)
Analit	Dopasuj formułę	CV	Czynnik R2	Min.	Max.
IFN-γ	5-P.log(4,43, 14,40, 0,54, 9,11, 0,01)	1,77%	0,99	2.1	18105.0
Ił-5	5-P.log(4,36, 12,68, 0,64, 5,73, 0,36)	1,32%	1	Pytanie 1.9	Numer katalogowy: 14514.0
TNF-α	5-P.log(4,36, 11,63, 0,79, 5,45, 0,37)	1,48%	0,99	Pytanie 1.9	20109.0
IŁ-2	5-P.log(4,46, 12,62, 0,78, 5,07, 0,34)	1,34%	1	Pytanie 1.9	25109.0
IŁ-6	5-P.log(4,58, 11,66, 0,64, 5,77, 0,37)	1,70%	0,99	2.0	7022.0
Ił-4	5-P.log(4,27, 12,23, 0,62, 5,72, 0,36)	1,36%	1	2.0	13273.0
IŁ-10	5-P.log(4,67, 11,65, 1,20, 6,28, 0,61)	1,81%	0,99	2.2	5190.0
IŁ-9	5-P.log(4,32, 13,86, 0,86, 5,90, 0,45)	1,82%	1	Pytanie 1.9	12602.0
IŁ-17A	5-P.log(4,06, 14,03, 0,47, 6,52, 0,32)	0.99%	1	2.0	12285.0
Ił-17F	5-P.log(4,52, 12,15, 0,61, 5,52, 0,34)	0.92%	1	2.0	Numer katalogowy: 14841.0
IŁ-21	5-P.log(4,90, 8,03, 1,77, 4,74, 1,11)	0.79%	1	9,0	12943.0
IŁ-22	5-P.log(4,57, 12,56, 0,63, 6,06, 0,39)	1,16%	1	2.0	6408.0
IŁ-13	5-P.log(4,40, 11,44, 0,22, 3,19, 1,45)	1,11%	1	2.1	16728.0

Tabela 1: Standardowe dopasowanie krzywej i czułość testu. Oprogramowanie do analizy danych wykorzystano do wygenerowania krzywych standardowych dla wszystkich analitów zawartych w teście multipleksowym. Ta w pełni zautomatyzowana analiza wykorzystuje solidny 5-parametrowy algorytm dopasowania krzywej do wzorców serii rozcieńczeń z testu, a także została wykorzystana do zdefiniowania czułości testu przy użyciu teoretycznych granic wykrywalności.

Discussion

Format testu opisany w tym protokole może zapewnić solidną kwantyfikację rozpuszczalnych profili mediatorów w próbkach biologicznych, pod warunkiem, że eksperymentator ma dobrą technikę laboratoryjną i przestrzega zalecanego protokołu.

Istnieje kilka kluczowych kroków, które należy wykonać, aby zagwarantować wiarygodne wyniki. Po pierwsze, należy dopuścić do rozpuszczenia wzorców rekombinowanych w buforze do oznaczania przez zalecany pełny czas, a następnie jedynie po rozcieńczeniu w probówkach polipropylenowych. Rurki polistyrenowe mogą sprzyjać przyleganiu białek do ścianki rurek, co może prowadzić do niskich sygnałów podczas generowania krzywej standardowej. Po drugie, kluczowe znaczenie ma prawidłowe wstrząsanie podczas etapów inkubacji. Bez odpowiedniego mieszania właściwości wiązania kulek testowych mogą być poważnie utrudnione. Ponadto wymagane jest również odpowiednie mycie między etapami inkubacji. Eksperymentator musi zapewnić, że nadmiar odczynników zostanie usunięty ze studzienek przed rozpoczęciem następnego kroku w protokole. Należy również zoptymalizować ustawienia przyrządów dla cytometru przepływowego używanego do badania kulek testowych. W szczególności należy dostosować ustawienia PMT, aby zapewnić odpowiednią separację ściegów i szerokie zakresy dynamiki dla krzywych standardowych. Wreszcie, tuż przed analizą na cytometrze, kulki muszą zostać zawirowane, aby zapewnić prawidłowe zawieszenie i uniknąć tworzenia się agregatów, które mogą zniekształcić wyniki.

Protokół ten może być potencjalnie zmodyfikowany w celu analizy homogenatów tkankowych, a także typów próbek omówionych w tym manuskrypcie, pod warunkiem, że badacz jest skłonny zoptymalizować swój protokół lizy przed wykonaniem dużych, pełnych testów płytkowych. Rzeczywista technika będzie się oczywiście różnić w zależności od rodzaju tkanki; jednak ogólnie rzecz biorąc, w protokole należy stosować bufor o neutralnym pH zawierający fizjologiczne stężenia soli jonowych, bez chemikaliów denaturujących i najlepiej bez detergentów. Jeśli konieczne jest użycie detergentu, stężenie detergentu niejonowego powinno być utrzymywane na minimalnym poziomie (np. nie więcej niż 1%). Bufor powinien również zawierać wystarczającą ilość inhibitorów proteazy, aby zapobiec proteolitycznej degradacji białek docelowych. Niezależnie od zastosowanego protokołu lizy, końcowe preparaty powinny zostać odwirowane w celu usunięcia cząstek stałych przed analizą.

Jeśli chodzi o ograniczenia testu, stężenia docelowych analitów w typach próbek biologicznych mogą się znacznie różnić. Aby prawidłowo określić ilościowo stężenia analitu, muszą one mieścić się w górnej i dolnej wartości krzywej standardowej. Ekstrapolacja wartości krzywej niekoniecznie jest wiarygodna i nie jest zalecana. W związku z tym badacze muszą zoptymalizować rozcieńczenia swoich poszczególnych próbek w eksperymentach pilotażowych przed przeprowadzeniem testu na pełnej płytce. Ponadto staranne przygotowanie próbek biologicznych do oznaczenia ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia tego formatu testu. Próbki, które są lipemiczne, hemolizowane lub zawierają szczątki białka, wpłyną na interakcje przeciwciał antygenowych, które definiują podstawową zasadę tego testu immunologicznego, i spowodują wyniki, które są nieinterpretowalne.

Test ten jest istotny w odniesieniu do istniejących metod oznaczania ilościowego z kilku powodów. Przy prawidłowym uruchomieniu format testu może oznaczać ilościowo do 13 analitów z próbki przy użyciu znacznie mniejszych objętości niż byłoby to wymagane do analizy próbki przy użyciu tradycyjnych testów ELISA. Ten format testu również nie wymaga specjalnego oprzyrządowania do jego przeprowadzenia. Jest to zaleta w porównaniu z innymi dostępnymi na rynku testami immunologicznymi opartymi na kulkach, ponieważ test można przeprowadzić przy użyciu dowolnej liczby powszechnie stosowanych cytometrów przepływowych.

Badania naukowe nad rolą, jaką odgrywają wydzielane czynniki i sieci cytokin w zdrowiu i chorobie, rozwijają się. Format testu opisany w tym manuskrypcie może być cennym narzędziem dla badaczy starających się zrozumieć te wieloaspektowe i złożone zjawiska. Aktywne programy badań biomedycznych zaczynają badać rolę sieci cytokin nie tylko w obszarach takich jak uogólnione zapalenie⁶, ale także w kontekście określonych stanów chorobowych, takich jak miażdżyca, rak i zapalenie nerwów 15,16,17. Niewątpliwie badania w tych dziedzinach będą się rozwijać wraz z rozwojem poszukiwania nowych metod leczenia tych przewlekłych schorzeń. Potrzeba dokładnej i wiarygodnej kwantyfikacji rozpuszczalnych mediatorów związanych z tymi chorobami pozostanie kluczowym priorytetem badawczym.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wirówka Allegra 6R z adapterem nośnika MICROPLUS	366816 redlic Beckman		Do testów LEGENDplex jest uruchamiana w mikroprobówkach, 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V lub U (opcjonalnie)
Panel cytokin LEGENDplex Mouse T helper	BioLegend	740005	Multiplex Immunoassay (13-plex)
Przeciwciało anty-mysie CD3 i epsilon;	BioLegend	100314	Clone 145-2C11, niska endotoksyna, format wolny od azydku
Przeciwciało anty-mysie CD28	BioLegend	102112	Clone 37.51, niska endotoksyna, format wolny od azydków
Pompa próżniowa	EMD Millipore	WP6111560	Do testów LEGENDplex przy użyciu płytek filtracyjnych (zalecane)
Kolektor próżniowy	EMD Millipore	MSVMHTS00	Do testów LEGENDplex przy użyciu płytek filtracyjnych (zalecane)
Sterylne jednorazowe zbiorniki na odczynniki	Fisher Scientific	07-200-130	Lub równoważne
probówki MicroFACS z polipropylenu	Fisher Scientific	11-842-90	Do testów LEGENDplex przeprowadza się w mikroprobówkach, 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V lub U (opcjonalnie)
Zestaw pipet	Fisher Scientific	14-388-100	Cztery rozmiary pipet (0,2-2 i mikro; L, 2-20 i mikro; L, 20-200 i mikro; L, 100-1000 i mikro; L)
Pipeta wielokanałowa	Fisher Scientific	FA10011G	zdolna do dozowania 5 μ L do 200 μ L
Wytrząsarka do mikropłytek	Fisher Scientific 88880023		Lub równoważna
Mikrowirówka	Fisher Scientific	75002410	Lub równoważne
probówki FACS	Fisher Scientific NC9885747		12 x 75 mm z okrągłym dnem
PMA (12-mirystynian 13-octanu forbolu)	Sigma-Aldrich	P8139
Lipopolisacharyd (LPS)	Sigma-Aldrich	L-8274	Escherichia coli O26:B6
Jonomycyna	Sigma-Aldrich	I0634
Myjka ultradźwiękowa Branson B200	Sigma-Aldrich	Z305359	lub równoważne
Probówki do mikrowirówek	Sigma-Aldrich	Z666505	1,5 ml probówki polipropylenowe
Cytometr przepływowy	Różne	Różne	Cytometr wyposażony w pojedynczy laser (488nm niebieski) lub dwa lasery (488nm niebieski lub 532nm zielony + 633nm czerwony) zdolny do odczytu długości fal emisji przy 575nm i 660nm
96-dołkowa płytka polipropylenowa	VWR	82050-662	Do testów LEGENDplex jest uruchamiany w mikroprobówkach, 96-dołkowej płytce V-lub U-bottom (opcjonalnie)