Multipleksowe profilowanie cytokin stymulowanych splenocytów myszy przy użyciu cytometrycznej platformy testów immunologicznych opartych na kulkach

Podsumowanie

Ten protokół opisuje kwantyfikację wielu celów cytokin jednocześnie w supernatantach hodowli tkankowej pobranych ze stymulowanych mysich splenocytów przy użyciu platformy testów immunologicznych opartych na multipleksie i cytometru przepływowego.

Streszczenie

Testy immunologiczne oparte na koralikach wykorzystują tę samą podstawową zasadę, co testy immunologiczne kanapkowe. Kulki wychwytujące, które można rozróżnić na podstawie wielkości i intensywności fluorescencji wewnętrznej allofikocyjaniny (APC), są sprzężone z przeciwciałami specyficznymi dla danego analitu. Następnie wybrany panel zdefiniowanych zestawów kulek wychwytujących jest inkubowany z próbką biologiczną zawierającą docelowe anality specyficzne dla przeciwciał wychwytujących. Dodaje się biotynylowany koktajl przeciwciał detekcyjnych, który prowadzi do powstania kanapek z przeciwciałami wykrywającymi perełki i anality.

Na koniec, dodaje się streptawidynę-fikoerytrynę (SA-PE), która wiąże się z biotynylowanymi przeciwciałami detekcyjnymi, zapewniając intensywność sygnału fluorescencyjnego proporcjonalnie do ilości związanego analitu. Sygnał fluorescencyjny PE regionów kulek specyficznych dla analitu jest oznaczany ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej, a stężenia poszczególnych analitów są oznaczane za pomocą oprogramowania do analizy danych i krzywej wzorcowej wygenerowanej w teście.

W tym eksperymencie używamy mysiego panelu cytokin pomocniczych T, aby jednocześnie określić stężenie 13 oddzielnych celów cytokin w supernatantach do hodowli tkankowych pobranych z mysich splenocytów hodowanych w różnych warunkach stymulujących.

Wprowadzenie

W swojej roli rozpuszczalnych cząsteczek sygnałowych, cytokiny pośredniczą w wysoce skoordynowanych i wieloczynnikowych procesach, które regulują odpowiedzi immunologiczne gospodarza. Ulegają one ekspresji na wszystkich etapach procesu zapalnego, od jego zainicjowania do ustąpienia, i regulują złożoną sieć interakcji, która obejmuje ich własną syntezę oraz syntezę receptorów komórkowych¹. Ta sieć komunikacyjna jest złożona ze złożonością, która wykracza poza synergiczne lub antagonistyczne relacje, które mogą istnieć między poszczególnymi komponentami. Rzeczywiście, wiadomo, że wiele cytokin ma nadmiarowe lub przynajmniej częściowo nakładające się funkcje^2,3.

Zintegrowane podejścia do biologii systemowej, które jednocześnie określają ilościowo wiele analitów cytokin, obecnie dostarczają coraz bardziej wszechstronnego zrozumienia unikalnych cytokinomów, które koordynują reakcje immunologiczne leżące u podstaw wielu stanów chorobowych4^,5. Te stany chorobowe obejmują uogólnione stany zapalne po raka, stany neurodegeneracyjne i choroby układu krążenia^6,7,8,9.

Takie sieci cytokin mogą być skutecznie badane za pomocą testów immunologicznych opartych na koralikach LEGENDplex. Testy te opierają się na tej samej zasadzie, co test immunoenzymatyczny typu sandwich (ELISA) i wykorzystują mikrosfery kodowane fluorescencją z przeciwciałami wychwytującymi węzłencyjnie przyłączonymi do ich powierzchni. Przeciwciała te są unieruchomione na powierzchniach znacznie mniejszych niż te wymagane przez tradycyjne formaty ELISA. Umożliwia to wykonywanie takich testów przy znacznie mniejszej objętości próbki, przy jednoczesnym zmniejszeniu niespecyficznego wiązania i zapewnieniu multipleksowanej analizy kilku analitów.

Test opisany w tym protokole wykorzystuje tę technologię do ilościowego oznaczania do 13 celów jednocześnie. Dane z tego testu można uzyskać za pomocą szerokiej gamy powszechnie dostępnych cytometrów przepływowych i w przeciwieństwie do innych dostępnych testów nie wymaga użycia dedykowanego oprzyrządowania specyficznego dla testu. Dzięki rozszerzającemu się katalogowi zwalidowanych paneli analitowych, testy te zostały wykorzystane w kilku trwających projektach badań biomedycznych^10,11,12,13.

Aby zademonstrować łatwość i użyteczność formatu testu, w tym eksperymencie używamy panelu cytokin T pomocniczych myszy do ilościowego oznaczania 13 oddzielnych stężeń cytokin z supernatantów z hodowli tkankowej uzyskanych z mysich splenocytów hodowanych w wielu warunkach stymulujących. Oprócz supernatantów do hodowli tkankowych test ten można również przeprowadzić przy użyciu próbek surowicy lub osocza.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami NIH zawartymi w Guide for the Care and Use of Laboratory Animals i zostały zatwierdzone przez IACUC w BioLegend.

Rycina 1: Podsumowanie procedury analizy z wykorzystaniem płytek filtrujących. Protokół przeprowadzania analizy z użyciem płytek filtrujących został przedstawiony w formie diagramu obrazującego kluczowe komponenty analizy oraz etapy inkubacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

1. Przygotowanie próbek biologicznych

UWAGA: Wybór miejsca anatomicznego oraz objętości pobieranej krwi pozostaje do uznania każdego badacza i nie wpłynie na wynik analizy. Jednakże, po ich pobraniu, próbki należy traktować zgodnie z poniższymi krokami.

1. Przygotowanie próbek surowicy
   1. Pobrać pożądaną objętość krwi do odpowiedniej probówki i pozostawić do skrzepnięcia na co najmniej 30 min.
   2. Wirować próbkę przez 10 min przy 1,000 x g w temperaturze pokojowej.
   3. Odsączyć surowicę i bezzwłocznie przeprowadzić analizę lub przenieść do polipropylenowych probówek do mikrocentryfugi i przechowywać próbki w temperaturze ≤ -20 °C.
2. Przygotowanie próbek osocza
   1. Pobrać pożądaną objętość krwi do probówek do pobierania krwi powlekanych kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA).
   2. Wirować przez 10 min przy 1,000 x g w temperaturze pokojowej w ciągu 30 min od pobrania.
   3. Odsączyć osocze i bezzwłocznie przeprowadzić analizę lub przenieść do polipropylenowych probówek do mikrocentryfugi i przechowywać próbki w temperaturze ≤ -20 °C.
3. Przygotowanie próbek nadsączu z hodowli tkankowych
   1. Wirować próbkę przez 10 min przy 1,500 x g w temperaturze 4 °C w celu usunięcia komórek i resztek komórkowych.
   2. Zebrać nadsącz i bezzwłocznie przeprowadzić analizę lub przenieść do polipropylenowych probówek do mikrocentryfugi i przechowywać w temperaturze ≤ -20 °C.
4. Rozmrażanie zamrożonych próbek biologicznych
   1. Całkowicie rozmrozić wcześniej zamrożone próbki biologiczne na lodzie i krótko wymieszać w wirówce typu vortex przed użyciem. Unikać więcej niż 2 cykli zamrażania/rozmrażania.
      UWAGA: Próbki użyte w tym protokole uzyskano poprzez hodowlę splenocytów myszy BALB/c (1 x 10⁶ komórek w 37 °C + 5% CO₂ w różnych warunkach: niepobudzone, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µg/mL powleczone płytkę) + αCD28 (1 µg/mL rozpuszczalne), PMA (20 ng/mL) + jonomycyna (500 ng/mL). Nadsącza z hodowli zebrano po 48 h i przetworzono zgodnie z opisem w sekcji 1.3.

2. Przygotowanie odczynników

1. Przygotowanie gotowych kulek z unieruchomionymi przeciwciałami
   1. Butelkę z gotowymi kulkami poddać sonikacji przez 1 min w kąpieli ultradźwiękowej w temperaturze pokojowej, a następnie mieszać w wstrząsarze Vortex przez 30 s przed użyciem. W przypadku braku kąpieli ultradźwiękowej wydłużyć czas mieszania w wstrząsarzu do 1 min.
2. Przygotowanie buforu do mycia
   1. Dostarczony w zestawie 20x Bufor do mycia (20x PBS z 1% Tween-20) doprowadzić do temperatury pokojowej i wymieszać w wstrząsarzu Vortex, aż wszystkie sole się rozpuszczą.
   2. 25 mL 20x Buforu do mycia rozcieńczyć w 475 mL wody dejonizowanej. Niewykorzystaną część przechowywać w temperaturze od 2 °C do 8 °C przez maksymalnie jeden miesiąc.
3. Przygotowanie Matrycy B (wyłącznie do próbek surowicy i osocza)
   1. Do butelki zawierającej liofilizowaną Matrycę B dodać 5,0 mL Buforu do analizy (PBS z 1% BSA) dołączonego do zestawu. Odczekać co najmniej 15 min do całkowitej rekonstytucji, a następnie wymieszać w wstrząsarzu Vortex. Pozostałą zrekonstytuowaną Matrycę B można przechowywać w temperaturze ≤ -70 °C przez maksymalnie jeden miesiąc.

3. Przygotowanie standardów

UWAGA: Każdy anality w tym panelu ma najwyższe stężenie standardu wynoszące 10,000 pg/mL.

1. Dodaj 250 µL Buforu do Analizy (Assay Buffer), aby zrekonstytuować liofilizowany Koktajl Standardów Cytokin mysich Th. Wymieszaj, krótko wirując w wirówce vorteksowej, a następnie pozostaw fiolkę w temperaturze pokojowej na 10 min.
2. Przenieś koktajl standardów do polipropylenowej probówki do mikrowirówki oznaczonej jako „C7”. Będzie ona służyć jako standard najwyższego stężenia.
3. Oznacz 6 polipropylenowych probówek do mikrowirówki jako C6, C5, C4, C3, C2 i C1.
4. Do każdej z tych probówek dodaj 75 µL Buforu do Analizy (Assay Buffer).
5. Przenieś 25 µL standardu najwyższego stężenia C7 do probówki C6 i dokładnie wymieszaj za pomocą vorteksu. Będzie to standard C6.
6. Kontynuuj wykonywanie rozcieńczeń seryjnych w stosunku 1:4, używając nowej końcówki do pipety dla każdej probówki; dodawaj 25 µL poprzedniego standardu do 75 µL Buforu do Analizy (Assay Buffer) w probówce kolejnego, niższego standardu, a następnie wymieszaj w wirówce vorteksowej, aby otrzymać standardy C5, C4, C3, C2 i C1. Jako standard 0 pg/mL (C0) zastosuj Bufor do Analizy (Assay Buffer).

4. Rozcieńczanie próbki

UWAGA: W celu określenia najodpowiedniejszego współczynnika rozcieńczenia dla konkretnego zestawu próbek biologicznych może być konieczne przeprowadzenie wstępnych eksperymentów pilotażowych z wykorzystaniem tego testu przy zastosowaniu wielu rozcieńczeń. Prawidłowy współczynnik rozcieńczenia pozwoli na obliczenie stężenia w próbce mieszczącego się w granicach krzywej wzorcowej. Poniższe kroki stanowią wytyczne i mogą wymagać empirycznego doprecyzowania w zależności od rodzaju próbki.

1. Próbki surowicy lub osocza rozcieńczyć 2-krotnie buforem do analizy (Assay Buffer) (np. 50 µL próbki rozcieńczyć 50 µL buforu do analizy) w polipropylenowych probówkach do mikrocentryfugi.
   UWAGA: Jeśli wymagane jest dalsze rozcieńczenie próbek, należy je przeprowadzić przy użyciu Matrix B zamiast buforu do analizy, aby zapewnić dokładny pomiar. Dodanie próbek surowicy lub osocza bez rozcieńczenia spowoduje niską dokładność analizy i może doprowadzić do zapchania płytki filtrującej. Matrix B składa się z puli surowicy mysiej pozbawionej endogennych celów analizy. Jest on stosowany jako rozcieńczalnik próbek surowicy lub osocza w celu uniknięcia efektów macierzy, o których wiadomo, że wpływają na czułość analityczną testów immunoenzymatycznych.
2. Próbki nadsączu z hodowli komórkowych badać bez rozcieńczania.
   UWAGA: Poziomy anality mogą znacznie różnić się w zależności od próbki. W razie potrzeby rozcieńczyć próbki nadsączu, używając świeżo przygotowanej, odpowiadającej im pożywki do hodowli komórkowej lub buforu do analizy (Assay Buffer).

5. Procedura analizy

UWAGA: Analizę można przeprowadzić w polipropylenowych płytkach filtracyjnych, probówkach do mikro FACS lub mikropłytkach z dnem w kształcie litery V. Zaleca się stosowanie procedury z płytką filtracyjną ze względu na dobrą powtarzalność między próbkami, stabilność analizy oraz łatwość obsługi. Ta procedura wymaga jednostki filtracji próżniowej do przemywania (zapewnianej przez użytkownika końcowego).

1. Przed użyciem należy doprowadzić wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej (20 - 25 °C).
2. Podczas przygotowania testu i etapów inkubacji płytę filtrującą należy zawsze ustawiać na odwróconej pokrywie płyty, aby dno płyty nie dotykało żadnych powierzchni, co mogłoby spowodować wyciek.
3. Przez cały czas trwania procedury analitycznej, w tym podczas etapów płukania, płytę należy trzymać w pozycji pionowej, aby uniknąć utraty kulek.
4. Podczas wszystkich etapów inkubacji płytę należy przechowywać w ciemności lub owinąć folią aluminiową.
5. Wszystkie standardy i próbki należy nanosić w dwóch powtórzeniach, rozmieszczając je na płycie w kolejności sekwencyjnej.
6. Płytę filtrującą należy uprzednio zwilżyć, dodając 100 µL 1x Wash Buffer do każdego dołka i pozostawiając ją na 1 min w temperaturze pokojowej (w przypadku użycia mikropłyty z filtrem na dnie).
7. Objętość buforu należy usunąć za pomocą kolektora próżniowego (5 - 10 s). Nie należy przekraczać podciśnienia 10 " Hg. Nadmiar Wash Buffer z dna płyty należy osuszyć, dociskając płytę do stosu czystych ręczników papierowych. Płytę należy umieścić na odwróconej pokrywie płyty.
   UWAGA: Kroki 5.1 - 5.2 można pominąć, jeśli test jest wykonywany przy użyciu mikropłyty z dnem w kształcie litery V lub mikroprobówek FACS.
8. W przypadku próbek nadnadczynu z hodowli komórkowych, do wszystkich dołków należy dodać 25 µL Assay Buffer. Do dołków ze standardami należy dodać 25 µL każdego standardu. Do dołków z próbkami należy dodać 25 µL każdej próbki.
9. W celu pomiaru próbek surowicy lub osocza, do dołków ze standardami należy dodać 25 µL Matrix B. Do dołków z próbkami należy dodać 25 µL Assay Buffer. Następnie do dołków ze standardami należy dodać 25 µL każdego standardu, a do dołków z próbkami 25 µL każdej rozcieńczonej próbki surowicy lub osocza.
10. Zmieszane kulki należy wstrząsać w vortexie przez 30 s. Do każdego dołka należy dodać 25 µL zmieszanych kulek, okresowo wstrząsając butelką z kulkami, aby zapobiec ich osiadaniu. Po dodaniu kulek końcowa objętość w każdym dołku powinna wynosić 75 µL.
11. Płytę należy zamknąć uszczelniaczem do płyt. Całą płytę, włącznie z odwróconą pokrywą, należy owinąć folią aluminiową. Płytę należy umieścić na wstrząsarce do płyt, zabezpieczyć i wstrząsać z prędkością około 500 rpm przez 2 h w temperaturze pokojowej. Aby zapobiec wyciekom, nie należy wywierać nadmiernego nacisku na uszczelniacz płyty.
12. Nie odwracając płyty, należy ją umieścić na kolektorze próżniowym, zastosować podciśnienie jak wcześniej i dodać 200 µL 1x wash buffer do każdego dołka.
13. Zawartość dołków płyty analitycznej należy usunąć poprzez filtrację próżniową. Nadmiar buforu piorącego z dna płyty należy osuszyć za pomocą podkładki chłonnej lub ręczników papierowych. Krok ten należy powtórzyć jeszcze raz.
    UWAGA: Jeśli test jest wykonywany przy użyciu mikropłyty z dnem w kształcie litery V lub mikroprobówek FACS, należy pominąć kroki 5.12 i 5.13. Zamiast tego płytę należy wirować z prędkością 1,000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć nadsącz za pomocą pipety wielokanałowej.
14. Do każdego dołka należy dodać 25 µL przeciwciał detekcyjnych (patrz Tabela Materiałów).
15. Płytę należy zamknąć nowym uszczelniaczem. Całą płytę, włącznie z odwróconą pokrywą, należy owinąć folią aluminiową.
16. Płytę należy umieścić na wstrząsarce i wstrząsać z prędkością około 500 rpm przez 1 h w temperaturze pokojowej.
17. Bez stosowania próżni należy dodać 25 µL odczynnika SA-PE bezpośrednio do każdego dołka. Rozcieńczanie odczynnika nie jest konieczne.
18. Płytę należy zamknąć nowym uszczelniaczem. Całą płytę, włącznie z odwróconą pokrywą, należy owinąć folią aluminiową.
19. Płytę należy umieścić na wstrząsarce i wstrząsać z prędkością około 500 rpm przez 30 min w temperaturze pokojowej.
20. Należy powtórzyć powyższy krok 5.13.
21. Do każdego dołka należy dodać 200 µL 1x Wash Buffer. Kulki należy resuspender na wstrząsarce do płyt przez 1 min.
22. Za pomocą pipety wielokanałowej należy przenieść próbki z płyty filtrującej do probówek FACS w celu odczytu próbek na cytometrze przepływowym.
    UWAGA: Objętość próbki można zwiększyć z 200 µL do 300 µL, dodając dodatkowe 100 µL 1x Wash Buffer do każdej probówki, aby zapobiec wyschnięciu próbki. W razie potrzeby próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc je przed światłem, i przeanalizować następnego dnia. Jednak długotrwałe przechowywanie próbek może prowadzić do zmniejszenia sygnału.

6. Konfiguracja cytometru przepływowego

UWAGA: Aby uzyskać wiarygodne dane, cytometr przepływowy musi zostać odpowiednio skonfigurowany przed rozpoczęciem akwizycji danych. Proces ten będzie się w pewnym stopniu różnić dla poszczególnych użytkowników, w zależności od konfiguracji konkretnego instrumentu, na którym wykonywany jest pomiar. Poniżej opisano ogólny proces konfiguracji cytometru zdolnego do pomiaru PE i APC, wyposażonego w lasery 488 oraz 633 nm.

1. Uruchom cytometr przepływowy oraz oprogramowanie do akwizycji danych zgodnie z instrukcjami producenta dołączonymi do urządzenia.
2. Utwórz wykres kropkowy (dot plot) z FSC (rozproszenie przednie) na osi X i SSC (rozproszenie boczne) na osi Y. Ustaw FSC i SSC w trybie liniowym.
3. Utwórz drugi wykres kropkowy z PE na osi X i APC na osi Y. Ten wykres powinien być ustawiony w trybie wyświetlania logarytmicznego.
4. Wymieszaj w wirówce (vortex) fiolkę z surowymi kuleczkami (raw beads) dołączonymi do zestawu przez 30 s, aby resuspendować kuleczki. Kuleczki te zawierają wewnętrzny barwnik APC i składają się z dwóch populacji rozmiarów.
5. Przenieś 400 µL surowych kuleczek do nowej probówki FACS.
6. Ustaw niską prędkość przepływu w cytometrze przepływowym.
7. Przeprowadź pomiar surowych kuleczek, ostrożnie regulując wzmocnienie (gain) i napięcie dla FSC i SSC, tak aby obie populacje rozmiarów tych kuleczek były wyraźnie oddzielone i łatwe do wyznaczenia w bramce (gate).
8. Dostosuj próg FSC, aby wykluczyć niepożądane zdarzenia (t.j. zanieczyszczenia lub pęcherzyki powietrza).
9. Na wykresie FSC vs. SSC wyznacz bramkę obejmującą wszystkie populacje kuleczek.
   UWAGA: Surowe kuleczki zawierają dwie populacje rozmiarów: mniejsze regiony „kuleczek A” oraz większe „kuleczki B”.
10. Wyświetl wybrane w bramce populacje kuleczek z wykresu FSC vs. SSC na drugim wykresie kropkowym z PE na osi X i APC na osi Y.
11. Dostosuj napięcie PMT dla kanału fluorescencji APC tak, aby sygnał APC dla wszystkich populacji kuleczek miał medianę intensywności fluorescencji (MFI) mieszczącą się w przedziale od 1 x 10¹ do 5 x 10³.
12. Wymieszaj w wirówce (vortex) fiolkę z kuleczkami kalibracyjnymi PE przez 30 s, aby resuspendować kuleczki.
13. Przenieś 400 µL kuleczek PE do nowej probówki FACS.
14. Zastąp probówkę z surowymi kuleczkami w cytometrze przepływowym probówką z kuleczkami PE.
15. Dostosuj napięcie lampy fotopowielaczowej (PMT) dla ustawienia kanału fluorescencji PE tak, aby MFI kuleczek PE mieściło się w zakresie specyficznym dla danej partii, podanym na fiolce z kuleczkami PE.
    UWAGA: Kuleczki kalibracyjne PE zawierają kuleczki jednej wielkości populacji (tylko „kuleczki A”).

7. Pozyskiwanie danych

UWAGA: Dokładne procedury związane z pozyskiwaniem danych na danym urządzeniu mogą się różnić i zależą od specyfikacji konfiguracji cytometru oraz używanego oprogramowania interfejsu. Poniższe instrukcje mają zatem na celu podkreślenie niezbędnych kroków, które należy podjąć w analizie, niezależnie od cytometru zastosowanego w badaniu.

1. Upewnij się, że szybkość przepływu cytometru jest nadal ustawiona na niską.
2. Ustaw liczbę zdarzeń kulek do pozyskania na około 300 na analityt. W przypadku panelu 13-pleks odpowiada to pozyskaniu łącznie 3900 zdarzeń z obu populacji rozmiarów kulek (kulek A+B).
3. Przed analizą wymieszaj każdą próbkę na wortexie przez 5 s.
4. Odczytaj próbki. Podczas odczytu próbek najpierw ustaw cytometr przepływowy w trybie konfiguracji (setup mode) i poczekaj, aż populacja kulek się ustabilizuje, przed przełączeniem w tryb akwizycji.
5. Używaj prostych nazw z kolejnym numerowaniem dla plików danych, aby ułatwić analizę danych.
6. Eksportuj tylko zdarzenia bramkowane (regiony kulek A + B), a nie całkowitą liczbę zdarzeń.
7. Przechowuj wszystkie pliki FCS z każdego testu w tym samym folderze. W przypadku przeprowadzania wielu testów utwórz osobny folder dla każdego z nich.

8. Przejdź do analizy danych

UWAGA: Pliki FCS wygenerowane przez cytometr przepływowy powinny zostać przeanalizowane przy użyciu oprogramowania do analizy danych, które można pobrać bezpłatnie¹⁴.

1. Zainstaluj oprogramowanie do analizy danych na komputerze PC.
2. Przenieś wszystkie pliki FCS z analizy na komputer, na którym znajduje się oprogramowanie analityczne.
3. Podłącz klucz licencyjny USB (zawarty w zestawie) do portu USB komputera.
4. Uruchom oprogramowanie do analizy danych.
5. Kliknij niebieski przycisk „Add Files” znajdujący się w górnej części ekranu.
6. W wyświetlonym oknie wyskakującym przejdź do folderu zawierającego pliki FCS z analizy.
7. Kliknij i przeciągnij wszystkie pliki FCS z analizy z okna wyskakującego do okna oprogramowania. Wszystkie pliki powinny teraz pojawić się na liście.
8. Kliknij zielony przycisk „Next” w prawym dolnym rogu ekranu. Kliknij lewym przyciskiem myszy i przytrzymaj, aby przeciągnąć małe niebieskie przyciski krzywej wzorcowej (od C7 do C0) do odpowiadających im plików FCS z listy w celu zdefiniowania krzywej wzorcowej.
9. Kliknij zielony przycisk „Next” w prawym dolnym rogu ekranu, aby otworzyć okno wyskakujące do bramkowania (gating).
10. Po lewej stronie okna bramkowania wpisz nazwy celów analitycznych dla regionów kulek A i B oraz przypisane do nich identyfikatory kulek (bead ID, znalezione w instrukcji dołączonej do analizy) w kolejności rosnącej.
11. Wybierz narzędzie do bramkowania z górnej części okna wyskakującego i użyj go do narysowania dwóch bramek na wykresie FSC vs. SSC: jednej wokół kulek A i drugiej wokół kulek B.
12. Przejrzyj wykresy rozrzutu APC vs. PE, które pojawią się poniżej wykresu FSC vs. SSC. W kulkach A (lewy wykres) widocznych będzie 6 pasm analitycznych, a w kulkach B (prawy wykres) 7 pasm analitycznych.
    UWAGA: Bramki można przerysować ręcznie, wybierając narzędzie gumki na górze i klikając w celu usunięcia danej bramki. Następnie można wybrać narzędzie do bramkowania i ręcznie zastosować bramkę do pożądanego regionu pasma.
13. Kliknij zielony przycisk „OK”, aby zamknąć okno wyskakujące do bramkowania i powrócić do listy plików FCS.
14. Zdefiniuj wszelkie rozcieńczenia wykonane w próbkach biologicznych, klikając prawym przyciskiem myszy na dany plik, wybierając z menu opcję „Dilution Fold” i wpisując odpowiednią wartość.
15. Kliknij zielony przycisk „Run” w prawym dolnym rogu ekranu, aby wygenerować krzywe wzorcowe dla analizy i obliczyć stężenia w nieznanych próbkach biologicznych.

Wyniki

Niniejszy protokół demonstruje, w jaki sposób platforma do immunoanalizy oparta na koralikach może być wykorzystana do jednoczesnego oznaczania ilościowego profili cytokin w próbkach biologicznych przy użyciu cytometru przepływowego. Próbki biologiczne użyte w tym przykładzie stanowiły nadsączki z kultur komórkowych splenocytów myszych, które wcześniej inkubowano w różnych warunkach aktywujących, choć format analizy został również zwalidowany do użytku z próbkami surowicy lub osocza.

Dane uzyskane z analizy są wykorzystywane do stworzenia krzywych wzorcowych dla wszystkich analitów w panelu multipleksowym. Oprogramowanie do analizy danych klasyfikuje każdy konkretny analit na podstawie unikalnego rozmiaru kuleczki i intensywności APC, a następnie kwantyfikuje go przy użyciu reportera PE. Zakresy dynamiczne, a także czułość analizy, zostały przedstawione na wykresie w skali logarytmicznej na Rysunku 2A. Oprogramowanie wykorzystuje dane z analizy oraz algorytm dopasowania krzywej 5-parametrowej do dokładnego obliczenia nie tylko stężeń analitów w dostarczonych przez użytkownika próbkach biologicznych, ale także granic wykrywalności zarówno dla górnego, jak i dolnego zakresu wszystkich krzywych wzorcowych (Tabela 1). Format opisany w niniejszym protokole zapewnia również bardzo wysoką precyzję analizy. Na Rysunku 2B oraz 2C przedstawiono dane obrazujące zmienność wewnątrzanalizy dla każdego analitu. W jednej analizie przebadano dwa oddzielne stężenia białek wzorcowych (wysokie i niskie), wykonując 16 powtórzeń dla każdej próbki. Rysunek 2C oraz 2D przedstawiają zmienność międzyanalizową docelowych analitów z trzech niezależnych analiz. Podobnie jak w eksperymentach dotyczących precyzji wewnątrzanalizy, wysokie i niskie stężenia wzorcowe analizowano w 3 powtórzeniach w każdym z niezależnych doświadczeń. Wyraźnie widoczna jest minimalna zmienność obliczonego stężenia białek docelowych.

Aby zademonstrować użyteczność cytometrycznych testów opartych na koralikach w badaniu profili ekspresji cytokin, splenocyty mysie inkubowano w różnych warunkach aktywujących. Oprócz niepobudzonej kontroli, komórki inkubowano również z LPS, przeciwciałami anty-CD3/anty-CD28 lub forbolu 12-mirystynianem 13-octanem i jonomycyną. Nadnadkrawki z hodowli komórkowych zebrano po 48 h i poddano analizie z wykorzystaniem panelu cytokin dla mysich limfocytów T pomocniczych. Wyniki ilościowe z tego eksperymentu przedstawiono na Rysunku 3, gdzie wyraźnie zarysowano wpływ warunków stymulacji na stężenia cytokin.

Opisane powyżej wyniki są typowe, pod warunkiem że osoba przeprowadzająca eksperyment stosuje poprawną technikę laboratoryjną i przestrzega dostarczonego protokołu analizy. Źródła błędów w tym formacie analizy mogą wynikać z odchyleń w czasach inkubacji, objętościach odczynników, procesie płukania lub z nieprawidłowych ustawień PMT w cytometrze przepływowym wykorzystanym do analizy próbek. Na Rysunku 4A wykres rozproszenia z pomyślnie przeprowadzonej analizy pokazuje 2 wyraźnie zdefiniowane, odrębne populacje kuleczek. Można to zestawić z Rysunkiem 4B, gdzie niewystarczające płukanie i nieprzestrzeganie protokołu doprowadziły do powstania agregatów kuleczek, które zacierają granice między dwiema populacjami. Ponadto, co potwierdza obecność debris w lewym dolnym kwadrancie, do analizy wyeksportowano całkowitą liczbę zdarzeń z cytometru, zamiast preferowanego formatu obejmującego wyłącznie zdarzenia bramkowane. Prawidłowa konfiguracja cytometru jest kluczowa dla uzyskania wiarygodnych danych w tej analizie. Na Rysunku 4C właściwe ustawienia PMT pozwalają na rozdzielenie każdego z 6 analitów w kanale klasyfikacji APC. Nieprawidłowe ustawienia PMT doprowadzą do uzyskania danych podobnych do tych przedstawionych na Rysunku 4D, gdzie w kanale APC populacje kuleczek mają nakładające się intensywności klasyfikacji. Unieważni to wynik analizy, ponieważ obliczenie stężeń analitów będzie niemożliwe bez wyraźnie zdefiniowanych populacji kuleczek analitycznych.

Rysunek 2: Zakresy krzywych wzorcowych i precyzja analizy. (A) Reprezentatywna krzywa wzorcowa wygenerowana przy użyciu panelu cytokin pomocniczych mysich limfocytów T. Krzywa wzorcowa musi być wyznaczana przy każdym badaniu. (B-C) Precyzja wewnątrzanalizy. Dwie próbki o różnych stężeniach białek docelowych (wysokim i niskim) przeanalizowano w jednym badaniu, wykonując 16 powtórzeń dla każdej próbki. Dane przedstawiono jako średnia + odchylenie standardowe. (D-E) Precyzja międzyanalizami. Dwie próbki o różnych stężeniach białek docelowych (wysokim i niskim) przeanalizowano w trzech niezależnych badaniach, wykonując 3 powtórzenia dla każdej próbki. Dane przedstawiono jako średnia + odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3: Ilościowe określenie reprezentatywnych wyników. Splenocyty mysie (1 x 10⁶ komórek) hodowano w temperaturze 37 °C + 5% CO₂ w różnych warunkach: bez stymulacji, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µg/mL naniesione na płytkę) + αCD28 (1 µg/mL rozpuszczalne), PMA (20 ng/mL) + jonomycyna (500 ng/mL). Nadnadkłady hodowlane zebrano po 48 h, a następnie poddano analizie ilościowej przy użyciu panelu cytokin pomocniczych mysich limfocytów T. Wyraźnie widoczne są zróżnicowane profile ekspresji cytokin w odpowiedzi na warunki stymulacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4: Wyniki z testów udanych i nieudanych. (A) Udane testy wykażą wyraźne populacje kulek dla populacji mikrosfer. (B) Nieudane testy wykażą słabą separację populacji, agregaty kulek oraz zbyt dużą liczbę zarejestrowanych zdarzeń. (C) Udane testy charakteryzują się wyraźnie zdefiniowanymi intensywnościami w kanale fluorescencji klasyfikacyjnej, które są łatwe do wyznaczania bramkowania i kwantyfikacji. (D) Nieudane testy wykażą słabo rozdzielone intensywności klasyfikacyjne, które nakładają się na wiele populacji kulek, co utrudnia kwantyfikację. Wielu z tych błędów można uniknąć dzięki ścisłemu przestrzeganiu protokołu testu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

	Krzywa wzorcowa			Czułość (pg/mL)
Analit	Wzór dopasowania	CV	R2	Min.	Maks.
IFN-γ	5-P.log(4,43, 14,40, 0,54, 9,11, 0,01)	1.77%	0.99	2.1	18105.0
IL-5	5-P.log(4,36, 12,68, 0,64, 5,73, 0,36)	1.32%	1	1.9	14514.0
TNF-α	5-P.log(4,36, 11,63, 0,79, 5,45, 0,37)	1.48%	0.99	1.9	20109.0
IL-2	5-P.log(4,46, 12,62, 0,78, 5,07, 0,34)	1.34%	1	1.9	25109.0
IL-6	5-P.log(4,58, 11,66, 0,64, 5,77, 0,37)	1.70%	0.99	2.0	7022.0
IL-4	5-P.log(4,27, 12,23, 0,62, 5,72, 0,36)	1.36%	1	2.0	13273.0
IL-10	5-P.log(4,67, 11,65, 1,20, 6,28, 0,61)	1.81%	0.99	2.2	5190.0
IL-9	5-P.log(4.32, 13.86, 0.86, 5.90, 0.45)	1.82%	1	1.9	12602.0
IL-17A	5-P.log(4,06, 14,03, 0,47, 6,52, 0,32)	0.99%	1	2.0	12285.0
IL-17F	5-P.log(4.52, 12.15, 0.61, 5.52, 0.34)	0.92%	1	2.0	14841.0
IL-21	5-P.log(4,90, 8,03, 1,77, 4,74, 1,11)	0.79%	1	9.0	12943.0
IL-22	5-P.log(4,57, 12,56, 0,63, 6,06, 0,39)	1.16%	1	2.0	6408.0
IL-13	5-P.log(4,40, 11,44, 0,22, 3,19, 1,45)	1.11%	1	2.1	16728.0

Tabela 1: Dopasowanie krzywej wzorcowej i czułość testu. Oprogramowanie do analizy danych zostało wykorzystane do wygenerowania krzywych wzorcowych dla wszystkich analitów zawartych w teście multipleksowym. Ta w pełni zautomatyzowana analiza stosuje odporny algorytm dopasowania krzywej 5-parametrycznej do standardów z serii rozcieńczeń z testu i została również wykorzystana do określenia czułości testu przy użyciu teoretycznych granic wykrywalności.

Dyskusja

Format testu opisany w tym protokole może zapewnić solidną kwantyfikację rozpuszczalnych profili mediatorów w próbkach biologicznych, pod warunkiem, że eksperymentator ma dobrą technikę laboratoryjną i przestrzega zalecanego protokołu.

Istnieje kilka kluczowych kroków, które należy wykonać, aby zagwarantować wiarygodne wyniki. Po pierwsze, należy dopuścić do rozpuszczenia wzorców rekombinowanych w buforze do oznaczania przez zalecany pełny czas, a następnie jedynie po rozcieńczeniu w probówkach polipropylenowych. Rurki polistyrenowe mogą sprzyjać przyleganiu białek do ścianki rurek, co może prowadzić do niskich sygnałów podczas generowania krzywej standardowej. Po drugie, kluczowe znaczenie ma prawidłowe wstrząsanie podczas etapów inkubacji. Bez odpowiedniego mieszania właściwości wiązania kulek testowych mogą być poważnie utrudnione. Ponadto wymagane jest również odpowiednie mycie między etapami inkubacji. Eksperymentator musi zapewnić, że nadmiar odczynników zostanie usunięty ze studzienek przed rozpoczęciem następnego kroku w protokole. Należy również zoptymalizować ustawienia przyrządów dla cytometru przepływowego używanego do badania kulek testowych. W szczególności należy dostosować ustawienia PMT, aby zapewnić odpowiednią separację ściegów i szerokie zakresy dynamiki dla krzywych standardowych. Wreszcie, tuż przed analizą na cytometrze, kulki muszą zostać zawirowane, aby zapewnić prawidłowe zawieszenie i uniknąć tworzenia się agregatów, które mogą zniekształcić wyniki.

Protokół ten może być potencjalnie zmodyfikowany w celu analizy homogenatów tkankowych, a także typów próbek omówionych w tym manuskrypcie, pod warunkiem, że badacz jest skłonny zoptymalizować swój protokół lizy przed wykonaniem dużych, pełnych testów płytkowych. Rzeczywista technika będzie się oczywiście różnić w zależności od rodzaju tkanki; jednak ogólnie rzecz biorąc, w protokole należy stosować bufor o neutralnym pH zawierający fizjologiczne stężenia soli jonowych, bez chemikaliów denaturujących i najlepiej bez detergentów. Jeśli konieczne jest użycie detergentu, stężenie detergentu niejonowego powinno być utrzymywane na minimalnym poziomie (np. nie więcej niż 1%). Bufor powinien również zawierać wystarczającą ilość inhibitorów proteazy, aby zapobiec proteolitycznej degradacji białek docelowych. Niezależnie od zastosowanego protokołu lizy, końcowe preparaty powinny zostać odwirowane w celu usunięcia cząstek stałych przed analizą.

Jeśli chodzi o ograniczenia testu, stężenia docelowych analitów w typach próbek biologicznych mogą się znacznie różnić. Aby prawidłowo określić ilościowo stężenia analitu, muszą one mieścić się w górnej i dolnej wartości krzywej standardowej. Ekstrapolacja wartości krzywej niekoniecznie jest wiarygodna i nie jest zalecana. W związku z tym badacze muszą zoptymalizować rozcieńczenia swoich poszczególnych próbek w eksperymentach pilotażowych przed przeprowadzeniem testu na pełnej płytce. Ponadto staranne przygotowanie próbek biologicznych do oznaczenia ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia tego formatu testu. Próbki, które są lipemiczne, hemolizowane lub zawierają szczątki białka, wpłyną na interakcje przeciwciał antygenowych, które definiują podstawową zasadę tego testu immunologicznego, i spowodują wyniki, które są nieinterpretowalne.

Test ten jest istotny w odniesieniu do istniejących metod oznaczania ilościowego z kilku powodów. Przy prawidłowym uruchomieniu format testu może oznaczać ilościowo do 13 analitów z próbki przy użyciu znacznie mniejszych objętości niż byłoby to wymagane do analizy próbki przy użyciu tradycyjnych testów ELISA. Ten format testu również nie wymaga specjalnego oprzyrządowania do jego przeprowadzenia. Jest to zaleta w porównaniu z innymi dostępnymi na rynku testami immunologicznymi opartymi na kulkach, ponieważ test można przeprowadzić przy użyciu dowolnej liczby powszechnie stosowanych cytometrów przepływowych.

Badania naukowe nad rolą, jaką odgrywają wydzielane czynniki i sieci cytokin w zdrowiu i chorobie, rozwijają się. Format testu opisany w tym manuskrypcie może być cennym narzędziem dla badaczy starających się zrozumieć te wieloaspektowe i złożone zjawiska. Aktywne programy badań biomedycznych zaczynają badać rolę sieci cytokin nie tylko w obszarach takich jak uogólnione zapalenie⁶, ale także w kontekście określonych stanów chorobowych, takich jak miażdżyca, rak i zapalenie nerwów 15,16,17. Niewątpliwie badania w tych dziedzinach będą się rozwijać wraz z rozwojem poszukiwania nowych metod leczenia tych przewlekłych schorzeń. Potrzeba dokładnej i wiarygodnej kwantyfikacji rozpuszczalnych mediatorów związanych z tymi chorobami pozostanie kluczowym priorytetem badawczym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wirówka Allegra 6R z adapterem nośnika MICROPLUS	366816 redlic Beckman		Do testów LEGENDplex jest uruchamiana w mikroprobówkach, 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V lub U (opcjonalnie)
Panel cytokin LEGENDplex Mouse T helper	BioLegend	740005	Multiplex Immunoassay (13-plex)
Przeciwciało anty-mysie CD3 i epsilon;	BioLegend	100314	Clone 145-2C11, niska endotoksyna, format wolny od azydku
Przeciwciało anty-mysie CD28	BioLegend	102112	Clone 37.51, niska endotoksyna, format wolny od azydków
Pompa próżniowa	EMD Millipore	WP6111560	Do testów LEGENDplex przy użyciu płytek filtracyjnych (zalecane)
Kolektor próżniowy	EMD Millipore	MSVMHTS00	Do testów LEGENDplex przy użyciu płytek filtracyjnych (zalecane)
Sterylne jednorazowe zbiorniki na odczynniki	Fisher Scientific	07-200-130	Lub równoważne
probówki MicroFACS z polipropylenu	Fisher Scientific	11-842-90	Do testów LEGENDplex przeprowadza się w mikroprobówkach, 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V lub U (opcjonalnie)
Zestaw pipet	Fisher Scientific	14-388-100	Cztery rozmiary pipet (0,2-2 i mikro; L, 2-20 i mikro; L, 20-200 i mikro; L, 100-1000 i mikro; L)
Pipeta wielokanałowa	Fisher Scientific	FA10011G	zdolna do dozowania 5 μ L do 200 μ L
Wytrząsarka do mikropłytek	Fisher Scientific 88880023		Lub równoważna
Mikrowirówka	Fisher Scientific	75002410	Lub równoważne
probówki FACS	Fisher Scientific NC9885747		12 x 75 mm z okrągłym dnem
PMA (12-mirystynian 13-octanu forbolu)	Sigma-Aldrich	P8139
Lipopolisacharyd (LPS)	Sigma-Aldrich	L-8274	Escherichia coli O26:B6
Jonomycyna	Sigma-Aldrich	I0634
Myjka ultradźwiękowa Branson B200	Sigma-Aldrich	Z305359	lub równoważne
Probówki do mikrowirówek	Sigma-Aldrich	Z666505	1,5 ml probówki polipropylenowe
Cytometr przepływowy	Różne	Różne	Cytometr wyposażony w pojedynczy laser (488nm niebieski) lub dwa lasery (488nm niebieski lub 532nm zielony + 633nm czerwony) zdolny do odczytu długości fal emisji przy 575nm i 660nm
96-dołkowa płytka polipropylenowa	VWR	82050-662	Do testów LEGENDplex jest uruchamiany w mikroprobówkach, 96-dołkowej płytce V-lub U-bottom (opcjonalnie)