Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Całościowe oczyszczanie i barwienie organów kwiatowych Arabidopsis i krzemianek

17.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56441

⸱

12 kwietnia 2018

 ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, Zurich-Basel Plant Science Center, University of Zurich

W tym artykule

Podsumowanie

W tym protokole opisujemy techniki prawidłowego preparowania kwiatów i krzemionek Arabidopsis, niektóre podstawowe techniki oczyszczania oraz wybrane procedury barwienia dla obserwacji struktur rozrodczych na całej powierzchni.

Streszczenie

Ze względu na swoje potężne narzędzia do molekularnych badań genetycznych, Arabidopsis thaliana jest jednym z najbardziej znanych gatunków modelowych w biologii roślin, a zwłaszcza w biologii rozrodu roślin. Jednak analizy morfologiczne, anatomiczne i ultrastrukturalne roślin tradycyjnie obejmują czasochłonne procedury osadzania i cięcia w przypadku jasnego pola, skanowania i mikroskopii elektronowej. Niedawny postęp w konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej, najnowocześniejsze komputerowe analizy mikroskopowe 3D oraz ciągłe doskonalenie technik molekularnych, które mają być stosowane na minimalnie przetworzonych próbkach montowanych w całości, doprowadziły do zwiększonego zapotrzebowania na opracowywanie wydajnych i minimalnych technik przetwarzania próbek. W tym protokole opisujemy techniki prawidłowego preparowania kwiatów i krzemionek Arabidopsis, podstawowe techniki oczyszczania oraz niektóre procedury barwienia do obserwacji struktur rozrodczych w całości.

Wprowadzenie

Kwiaty są jednymi z najważniejszych organów definiujących rośliny okrytozalążkowe. Rośliny kwitnące pojawiły się około 90-130 milionów lat temu1, i zróżnicowały się tak szybko, że ich gwałtowne pojawienie się zostało opisane jako "obrzydliwa tajemnica" przez Karola Darwina2. Zainteresowania badaczy roślin w zakresie rozwoju kwiatów są różnorodne. Niektóre badania koncentrowały się na zrozumieniu ewolucyjnego pochodzenia kwiatu jako całości lub ewolucji określonych właściwości anatomicznych, strukturalnych i funkcjonalnych kwiatów3,4,5,6. Duża zmienność formy i struktury kwiatów, a także zależne od nich sposoby rozmnażania płciowego i bezpłciowego sprawiają, że kwiat ma bardzo złożoną strukturę. Doprowadziło to do różnorodnych wysiłków mających na celu scharakteryzowanie anatomii i cech strukturalnych organów kwiatowych przy użyciu technik mikroskopii świetlnej i elektronowej, które można połączyć z badaniami genetycznymi i molekularnymi7. Ponadto, jako źródło owoców i nasion, kwiaty mają ogromne znaczenie w żywieniu ludzi i zwierząt. W związku z tym charakterystyka rozwoju kwiatów i owoców ma wiele implikacji dla badań stosowanych, w tym dla bezpieczeństwa żywnościowego dla stale rosnącej populacji ludzkiej i strategii ochrony środowiska w zmieniającym się środowisku8,9,10.

Rozwój kwiatów u Arabidopsis rozpoczyna się od indukcji kwitnienia i przekształcenia merystemu wegetatywnego w merystem kwiatostanu (grupy kwiatów). Zawiązki kwiatowe są inicjowane bocznie na boku kwiatostanu meristem11. Zawiązki narządów kwiatowych tworzą się stopniowo w koncentrycznych okółkach od zewnątrz do środka kwiatu i ostatecznie przekształcają się w działki, płatki, pręciki i słupki7. Te narządy kwiatowe spełniają różne role odżywcze, ochronne i funkcjonalne (np. przyciąganie zapylaczy) u różnych gatunków roślin, przy czym narządy płciowe podtrzymują rozwój gametofitów męskich i żeńskich, odpowiednio12,13. Z kolei gametofity różnicują parę gamet męskich (plemniki) i żeńskich (komórka jajowa i komórka centralna), które łączą się po podwójnym zapłodnieniu, tworząc następne pokolenie, zygotę i pierwotne bielmo, końcową tkankę wspierającą rozwój zarodka14,15. Rozwój owoców i nasion wspomaga wzrost, dojrzewanie i zachowanie zarodka, a ostatecznie jego rozproszenie. Przeprowadzono szeroko zakrojone badania w celu scharakteryzowania rozwoju kwiatów i zarodków u różnych gatunków roślin, zwłaszcza u gatunku modelowego Arabidopsis7,16,17.

Wczesne analizy mikroskopowe rozwoju kwiatów opierały się na czasochłonnym przetwarzaniu próbek i technikach obserwacji, takich jak osadzanie i cięcie parafiny lub żywicy, w połączeniu z mikroskopią świetlną lub elektronową. Te tradycyjne techniki mikroskopowe były często stosowane w połączeniu z molekularnymi badaniami genetycznymi, takimi jak analizy mikroskopowe mutantów, lokalizacja RNA przez hybrydyzację in situ lub immunodetekcja białek. Niedawny postęp w szerokokątnej i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej, w najnowocześniejszych komputerowych analizach obrazów 3D oraz ciągłe udoskonalanie metod molekularnych, które można stosować na minimalnie przetworzonych próbkach w całości, doprowadziły do zapotrzebowania na wydajne i minimalne techniki przetwarzania próbek, które są preferencyjnie podatne na analizy ilościowe. W ostatnich latach poczyniono znaczne postępy w opracowywaniu technik oczyszczania całych okazów zwierząt. Nadają one próbce przezroczystość za pomocą wodnych odczynników na bazie mocznika lub cukru (np. SCALE, SeeDB, CUBIC)18,19,20, albo selektywnie usuwając lipidy (przy użyciu detergentu SDS) po zanurzeniu próbek w stabilnych hydrożelach; usuwanie lipidów można osiągnąć albo przez dyfuzję bierną (np. zmodyfikowany protokół CLARITY21, PACT-PARS-RIMS22) lub aktywnie przez elektroforezę (oryginalny protokół CLARITY23 i ACT-PRESTO24). Zachęceni tym szybkim postępem, pojawiają się również pewne techniki pochodne do stosowania u roślin.

W tym artykule poświęconym modelowi Arabidopsis, opisujemy procedurę prawidłowego rozcinania pąków kwiatowych, kwiatów i młodych krzemionek oraz oczyszczania całych próbek do różnych procedur barwienia i obserwacji przy użyciu klasycznej lub najnowszej metody oczyszczania opartej na SDS. Podano przykłady barwienia skrobią, modzelą i chromatyną. Chociaż procedury te mogą wymagać dalszych ulepszeń i adaptacji, gdy są stosowane w odniesieniu do innych gatunków, mamy nadzieję, że przygotują one grunt pod dalsze badania nad tymi prostymi, ale krytycznymi metodami, które są punktem wyjścia wielu projektów badawczych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Fiksacja kwiatów i krzemionki

  1. Zbieraj kwiaty i łuski z roślin zsynchronizowanych przy otwarciu pierwszego kwiatu.
    UWAGA: W zastosowanych tutaj warunkach eksperymentalnych rośliny zaczynają kwitnąć około 21 dni po przesadzeniu z płytek Murashige i Skoog (MS) do gleby. Nasiona są stratyfikowane przez 3–4 dni w temperaturze 4 °C i kiełkowane/hodowane na płytkach MS w temperaturze 22 °C/16 h światła i 18 °C/8 godzin ciemności przez 8 do 10 dni, przed przesadzeniem sadzonek na glebę bogatą w składniki odżywcze w doniczkach utrzymywanych w tych samych warunkach (Rysunek 1). Liczba powtórzeń zależy od konkretnego celu badania, ale zaleca się co najmniej 5 kwiatostanów (z 5 pojedynczych roślin) dla każdego zabiegu. Jeśli jednostką doświadczalną są kwiaty, zaleca się co najmniej 10 kwiatów na powtórzenie.
  2. Wytnij kwiatostany lub kwiaty (Rysunek 1E-H) za pomocą małych nożyczek (np. nożyczek do paznokci) i natychmiast umieść je w probówce do mikrowirówki (do utrwalania pojedynczego kwiatostanu/kwiatu) lub stożkowej probówce (do zbiorczych mocowań) zawierającej świeżo wykonane utrwalacze Carnoya, metanol/kwas octowy lub FPA50 (w zależności od zastosowania, patrz poniżej) na lodzie.
    UWAGA: Próbki powinny być całkowicie zanurzone w utrwalaczu.
  3. Pozostawić tkankę w utrwalaczu na 4 godziny do nocy w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Infiltracja próżniowa może być stosowana w celu przyspieszenia penetracji utrwalacza do tkanki, ale może to być szkodliwe dla zachowania struktury tkanki. Autorzy nie stosują infiltracji próżniowej.
  4. Usunąć utrwalacz, dodać tyle 70% etanolu, aby pokryć próbki, i przywrócić je do temperatury 4 °C na co najmniej 24 godziny; próbki mogą pozostawać w tym roztworze przez czas nieokreślony. Po usunięciu etanolu przejdź natychmiast do następnego kroku; albo rozwarstwienie, albo oczyszczenie SDS.

2. Sekcja pod mikroskopem stereoskopowym

  1. Umieść świeżo przygotowany 70% etanol w szkiełku zegarmistrza umieszczonym na małej szalce Petriego dla podparcia.
  2. Umieść kwiatostan/kwiat/krzemionkę na tym świeżo przygotowanym utrwalaczu i wypreparuj pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą kleszczy i strzykawki z igłą.
    1. Użyj szkła zegarmistrzowskiego lub podobnego urządzenia, które pozwala na całkowite pokrycie próbek etanolem (zalecane) do preparowania kwiatostanów i do rozrywania organów kwiatowych dojrzałych kwiatów (na tym etapie można wyciąć działki, płatki i pręcik), aby uniknąć ryzyka wyschnięcia próbek.
  3. Wypreparuj krzemionki i małe pąki kwiatowe na szkiełku, jak opisano poniżej.
    1. Odłóż na bok szkiełko zegarmistrza z wstępnie przetworzonymi próbkami i użyj zwykłego szkiełka do ostatecznego rozbioru.
    2. Przenieś interesującą Cię próbkę na szkiełko i dodaj 10 μl świeżego 70% etanolu. Pracuj szybko nad końcowym rozbieraniem i w razie potrzeby dodaj 10 μl etanolu, aby próbka była wilgotna bez nadmiaru płynu.
    3. Informacje na temat uwalniania ziaren pyłku z pręcików znajdują się w kroku 5.1. W przypadku preparowania owocolistków i zalążków postępuj zgodnie z procedurą opisaną w Rysunek 2. Procedura ta ma zastosowanie do wszystkich etapów rozwoju owocolistka, w tym do etapu rozwoju zielonych krzemianków.
      UWAGA: Nie należy dodawać etanolu, jeśli w wyniku przenoszenia próbek pozostała wystarczająca ilość etanolu; Analizowanie bardzo małych próbek jest znacznie łatwiejsze w minimalnej ilości cieczy. Na zjeżdżalni należy zawsze trzymać tylko interesujące nas narządy (działki, płatki, pręciki, owocolistki, zalążki, nasiona lub ziarna pyłku). Procedura ta zapewni jednolitą grubość między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym, odpowiadającą grubości badanego narządu, co skutkuje większą jednorodnością, a tym samym skutecznością w badaniach mikroskopowych (większa liczba docelowych próbek w tej samej płaszczyźnie ogniskowej).
  4. Użyj małego kawałka bibuły, aby wchłonąć i usunąć jak najwięcej etanolu. Szybko przejdź do następnego kroku (sekcja 3, 4 lub 6), zanim próbka wyschnie.

3. Oczyszczanie na bazie hydratu chloralu i kombinowane oczyszczanie-barwienie

UWAGA: Najlepsze wyniki dla oczyszczania na bazie hydratów chloralu uzyskuje się przy użyciu stałego materiału FPA50.

  1. Umieścić 20 μl roztworu klarującego (hydrat chloralu/glicerol, zmodyfikowana pożywka Hoyera, roztwory Herra 41/2 lub Herr's IKI-41/2) na szkiełku zawierającym próbkę. Używając pary strzykawek z igłami podskórnymi, ustaw próbki zgodnie z potrzebami, zmniejszając przestrzeń między nimi i odwracając te, w których narząd zainteresowania jest skierowany w dół. Usunąć wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza za pomocą igły.
  2. Opuść szkiełko nakrywkowe na boki i delikatnie je ułóż, bardzo delikatnie dociskając, i poczekaj, aż roztwór czyszczący wypełni przestrzeń pomiędzy. W razie potrzeby dodać minimalną ilość roztworu czyszczącego, aby wypełnić całą przestrzeń pod szkiełkiem nakrywkowym.
  3. Umieść szkiełko na uchwycie szkiełka i pozostaw je pod wyciągiem. Do obserwacji mikroskopowych należy przystąpić po upływie co najmniej 4 godzin i w ciągu kolejnych 4–5 dni.

4. Połączone barwienie Alexandra i oczyszczanie pylników przez Herr's 41/2

UWAGA: Oryginalny protokół Alexandra opiera się na uwalnianiu ziaren pyłku na szkiełku przed barwieniem. Skuteczną i bardziej pouczającą, zmodyfikowaną procedurą barwienia i oczyszczania Alexandra jest barwienie dojrzałych ziaren pyłku w dojrzałych, ale nierozwarstwiających się pylnikach.

  1. Wybieraj świeżo zebrane pąki kwiatowe, które mają się otworzyć z nierozwarstwiającymi się pylnikami.
    UWAGA: Nie bierz młodszych pąków kwiatowych, ponieważ barwienie Alexandra jest przeznaczone dla dojrzałych ziaren pyłku i nie barwi skutecznie niedojrzałych ziaren pyłku. Zaleca się minimum 5 kwiatów na zabieg zebranych z różnych roślin i kwiatostanów.
  2. Przygotuj 96-dołkową płytkę z wystarczającą ilością roztworu Alexandra, aby zanurzyć pączek kwiatowy. Odsłoń pylniki, usuwając działki kielicha i płatki i zanurz je w roztworze Alexandra. Próbki należy przechowywać pod wyciągiem przez 1–3 godziny.
  3. Zastąp roztwór Alexandra roztworem Herra 41/2 i umieść płytkę wielodołkową z powrotem pod wyciągiem w celu inkubacji przez noc.
  4. Za pomocą kleszczy delikatnie przesuń oczyszczone pąki kwiatowe na nową szkiełko. Ponieważ może dojść do pewnego przeniesienia roztworu Alexandra, użyj bibuły, aby usunąć jak najwięcej roztworu czyszczącego.
  5. Wypreparuj pręciki i usuń wszystkie inne tkanki. Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi w sekcji 3, używając roztworu Herra 41/2.

5. Usuwanie egzyny z ziaren pyłku

UWAGA: Zalecamy użycie utrwalacza Carnoya do barwienia DAPI.

  1. Postępuj zgodnie z procedurami utrwalania i rozwarstwiania opisanymi w punktach 1 i 2. Do tej pory na szkiełku powinien znajdować się od jednego do wielu pręcików w minimalnej ilości 70% etanolu.
  2. Użyj bibuły, aby usunąć nadmiar etanolu i dodaj 5–10 μl roztworu DAPI. Używając kilku strzykawek z igłami, uwolnij ziarna pyłku w tej niewielkiej ilości roztworu (np. użyj jednej strzykawki do unieruchomienia pręcika, a drugiej do uwolnienia ziaren pyłku). Dodaj kolejne 5 μl DAPI, jeśli roztwór wyschnie.
  3. Usunięcie wszystkich zanieczyszczeń z pręcika jest krytycznym krokiem, tak aby między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym pozostały tylko ziarna pyłku.
  4. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku z próbką, opuszczając je na boki i dodaj minimalną ilość roztworu DAPI wymaganą do wypełnienia przestrzeni. Połóż palec wskazujący na szkiełku nakrywkowym i bez zbytniego zgniatania wykonuj szybki, stanowczy i krótki ruch ślizgowy.
    UWAGA: Aby ocenić niezbędną siłę i amplitudę ruchu ślizgowego, krok ten należy przećwiczyć kilka razy, sprawdzając wyniki za każdym razem pod mikroskopem.
  5. W razie potrzeby dodać roztwór DAPI i umieścić szkiełko w wilgotnym pudełku w ciemności w temperaturze 4 °C na 15 minut do 1 godziny. Przystąpić do obserwacji próbek pod wpływem fluorescencji szerokokątnej lub mikroskopii konfokalnej w ciągu 24 godzin. Spróbuj połączyć tę procedurę z czyszczeniem SDS, aby sprawdzić, czy można uzyskać dalszą poprawę.

6. Oczyszczanie dodecylosiarczanu sodu (SDS)

UWAGA: W zależności od analizowanego organu kwiatowego i umiejętności badacza w zakresie preparowania bardzo miękkich i małych okazów, zabieg SDS może być przeprowadzony przed (dla doświadczonych badaczy) lub po etapie sekcji (dla mniej doświadczonych badaczy) na materiale utrwalonym metanolem i kwasem octowym.

  1. Użyj szkła zegarmistrza, wklęsłego szkiełka lub probówki mikrowirówkowej do inkubacji wypreparowanych lub niewypreparowanych próbek w 1% roztworze SDS i 0,2 N NaOH przez noc w temperaturze pokojowej.
  2. Z urządzeniem należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ próbka jest bardzo miękka i ma przezroczysty wygląd. Spłucz kilkakrotnie wodą.
    UWAGA: Resztki roztworu SDS mogą prowadzić do wytrącania się podczas dodawania roztworu barwiącego, np. błękitu anilinowego.
  3. W przypadku próbek niepoddanych preparacji należy postępować zgodnie z procedurą preparacji opisaną w sekcji 2, używając wody zamiast 70% etanolu. Po wycięciu pożądanej tkanki usuń wszelkie resztki i zanieczyszczenia oraz nadmiar wody bibułą, a następnie dodaj 20–40 μl roztworu barwiącego i przejdź do kroku 6.5.
  4. W przypadku próbek wypreparowanych ostrożnie wyjmij próbkę z roztworu myjącego i umieść ją na czystym szkiełku, a następnie dodaj 20–40 μl roztworu barwiącego.
  5. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku, opuszczając je na boki. Uważaj, aby nie zgnieść preparatu. Jeśli tkanka jest zbyt miękka, umieść cienki separator między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym w jego rogach (np. taśma lub złamane szkiełko nakrywkowe), pozostawiając przestrzeń przypominającą komorę między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym, tak aby szkiełko nakrywkowe nie zgniatało próbki.
  6. Umieścić wszystkie szkiełka w wilgotnym pudełku, przykryć je folią aluminiową i umieścić w temperaturze 4 °C na co najmniej 1 godzinę. W ciągu 24 godzin należy przystąpić do obserwacji preparatu za pomocą fluorescencji szerokokątnej lub mikroskopii konfokalnej
    7. .

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Arabidopsis należy do rodziny kapustowatych (Brassicaceae), wytwarzając kwiatostany z obupłciowych kwiatów ułożonych w baldach (Rycina 1). Każdy kwiat posiada cztery działki kielicha, cztery płatki korony, sześć pręcików (cztery długie i dwa krótkie) oraz zrośnięty zalążek składający się z dwóch wrodzenie zrośniętych słupków (Rycina 1F-H) ułożonych w czterech koncentrycznych kręgach25

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istnienie wielu pąków kwiatowych w jednym kwiatostanie rzodkiewnika, obejmujących wszystkie etapy rozwoju kwiatów, stwarza wyjątkową okazję do badań mających na celu scharakteryzowanie efektu zabiegu lub cechy rozwojowej jednocześnie na różnych etapach rozwoju kwiatów. Dobrym punktem odniesienia między różnymi pojedynczymi roślinami jest otwarcie pierwszego kwiatu głównego kwiatostanu. Rośliny traktuje się w taki sposób, aby kwitnienie było w jak największym stopniu zsynchronizowane (np. 3–4-dniowa stra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Uniwersytet w Zurychu, grant IEF Marie Curie (grant nr. TransEpigen-254797 do A.H.), Advanced Grant Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (grant nr. MEDEA-250358 do U.G.) oraz projekt badawczo-rozwojowy (grant MecanX dla U.G.) z SystemsX.ch, Szwajcarskiej Inicjatywy w Biologii Systemów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
< strong> Odczynniki i materiały< / strong>
EthanolScharlauET00102500
Acetic AcidApplichemA3686,2500100% klasa biologii molekularnej
Lodowaty kwas octowySigma-Aldrich320099Biologia molekularna Metanol
ScharlauME03062500
Roztwór formaldehyduSigma-AldrichF1635
Kwas propionowySigma-Aldrich81910-250 ml
Hydrat chloraluSigma-Aldrich15307
GlicerolRoth3783.1
Guma arabskaFluka51198
Kwas mlekowyFluka69773
FenolSigma-Aldrich77607-250MLUżyliśmy płynnego fenolu (użyj gęstości, aby znaleźć wymaganą objętość dla swojego roztworu)
Olejek goździkowySigma-AldrichC8392-100ML
XyleneRoth4436.1
JodFluka57665
Jodek potasuMerck5043
Zieleń malachitowaFluka63160
Kwas fuksynowyFluka84600
Pomarańczowy GSigma7252
Dodecylosiarczan soduSigma-AldrichL3771Biologia molekularna
Klasa Wodorotlenek soduSigma-Aldrich71690
Dwuwodorofosforan soduApplichemA1047,1000
Fosforan sodu dwuzasadowySigma-AldrichS9763-1KG
Fosforan potasuSigma-Aldrich04347
Aplikacja EDTAA2937,1000
CalcofluorSigmaF6259Rozjaśniacz fluorescencyjny 28
AuraminaChroma10120
DAPISigmaD9542toksyczny
Triton-X-100SigmaT8787
Błękit anilinowyMerck1275
MS mediumCarolina19-57030
Podłoże bogate w składniki odżywczeEinheitserdeED73
SzkiełkoBrak konkretnej marki
15 ml probówki wirówkowe FalconVWR62406-200
Dumond KleszczeActimed0208-5SPSF-PS
KleszczeDUMONT BIOLOGY0108-5
StrzykawkaBDBD Plastipak 3000131 ml
Igła do preparatuBDMicrolance 304000
Szkiełka mikroskopoweThermo Scientific10143562CEkrawędzie cięte
Szkiełka nakrywkoweThermo ScientificDV40008
Wilgotne pudełkoPlastikowe pudełko z wilgotnym ręcznikiem papierowym i ślizgowymi wspornikami wewnątrz
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's)Absolutny etanol: lodowaty kwas octowy, 3:1 (ml:ml)
Metanol/kwas octowy utrwalacz50 % (v/v) metanol, 10 % (v/v) lodowaty kwas octowy w wodzie dejonizowanej
FPA50 utrwalaczFormalina, kwas propionowy, 50% etanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Roztwory czyszczące
Hydrat chloralu/glicerolHydrat chloralu : glicerol : woda, 8:1:2 (g:ml:ml). Może być stosowany na wszystkich etapach rozwoju kwiatów oraz do rozwoju krzemionki za pomocą mikroskopii DIC. Najlepszym utrwalaczem jest modyfikowana
Hoyerarabek na bazie formaliny FPA50 7,5 g, hydrat chloralu 100 g, glicerol 5 ml, woda 30 ml. Może być stosowany na wszystkich etapach rozwoju kwiatów oraz do rozwoju krzemionki za pomocą mikroskopii DIC. Najlepszym utrwalaczem jest FPA50 na bazie formaliny
Herr's 4½ płynKwas mlekowy, hydrat chloralu, kryształy fenolu, olejek goździkowy, ksylen; 2:2:2:2:1, wagowo. Może być stosowany na wszystkich etapach rozwoju kwiatów (szczególnie do rozwoju pręcików) oraz do rozwoju krzemionki za pomocą mikroskopii DIC. Najlepszym utrwalaczem jest
SDS/NaOHRozcieńczyć SDS i roztwór podstawowy NaOH do 1% SDS / 0,2 N NaOH (10x rozcieńczenie). Na wszystkie etapy rozwoju kwiatów i krzemionek. Najlepszym utrwalaczem jest utrwalacz metano/kwas octowy; Można również użyć pozostałych dwóch utrwalaczy. Może być łączony z kalkofluorem, auraminą, DAPI i roztworem do barwienia błękitem anilinowym.
SDS, roztwór10 % (w/v) dodecylosiarczan sodu. Rozpuścić 10 g dodecylosiarczanu sodu w 80 ml wody dejonizowanej i uzupełnić do 100 ml wodą dejonizowaną.
podstawowy NaOH2 N roztwór NaOH: rozpuścić 4 g NaOH w 40 ml wody dejonizowanej i uzupełnić do 100 ml wodą dejonizowaną
Połączone roztwory czyszczące i barwiące
Herr's IKI-4½Do standardu 4½ (łącznie 9 g) dodaj: 100 mg jodu, 500 mg jodku potasu. To rozwiązanie oczyszczające może być stosowane na wszystkich etapach rozwoju kwiatów oraz do rozwoju krzemionki, zarówno w celu zwiększenia kontrastu, jak i scharakteryzowania dynamiki skrobi. Użyj FPA50 do analizy strukturalnej i utrwalacza Carnoya do ilościowej analizy skrobi.
Alkohol etylowy barwienia Alexandra(1% w 95% EtOH) 1 ml, kwas fuksynowy (1% w ddH2O) 5ml, pomarańczowy G (1% w ddH2O) 0,5ml, fenol 5g, hydrat chloralu 5g, lodowaty kwas octowy 2ml, glicerol 25ml . To oczyszczanie/barwienie samodzielnie lub w połączeniu z Herr's 4½ Roztwór może być stosowany do oceny poronienia pyłku w kwiatach z dojrzałymi i trójkomórkowymi ziarnami pyłku. Stosuje się go na świeżo zmielonym materiale nieutrwalonym.
Roztwory barwiące
Calcofluor roztwórCalcofluor 0,007% w wodzie (g:ml). Pierwotnie używany jako rozjaśniacz optyczny. Może być stosowany do barwienia celulozy, karboksylowanych polisacharydów i kalozy w ścianach komórkowych. Często używany do barwienia wnętrza ziarna pyłku. Z tym roztworem można stosować wszystkie trzy utrwalacze.
RoztwórAuraminy Auramina 0,01% w wodzie (g:ml). Ten lipofilowy barwnik fluorescencyjny może być stosowany między innymi do barwienia skórek, cutyny i egzyny. Wszystkie trzy utrwalacze mogą być używane z tym roztworem Mieszanina
kalkofluoru i aurynyRoztwór auryny : roztwór Calcofluor, 3:1. Może być stosowany do łączonego barwienia za pomocą obu roztworów. Inne proporcje można określić przy zachowaniu mniejszej proporcji kalkofluoru w stosunku do auraminy.
RoztwórDAPI DAPI 0,4 ug/ml, 0,1 M bufor fosforanu sodu (pH 7), 0,1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. Roztwór ten może być stosowany do barwienia rozprzestrzeniania się chromosomów podczas mejozy męskiej i żeńskiej oraz jąder komórkowych dowolnej tkanki. Często używany do badania rozwoju ziarna pyłku. Carnoy's i metanol/kwas octowy są najlepszymi utrwalaczami dla tego roztworu. Utrwalacze na bazie formaldehydu, takie jak FPA50, mogą zakłócać barwienie. Wzbudzenie w promieniowaniu UV i maksymalna emisja około 461 nm.
Bufor fosforanu sodu (0,1 M)Receptor protonowy: 0,2 M Na2HPO4, donor protonów: 0,2 M NaH2PO4, stosunek donora protonów / receptora protonowego: 1,364 (dla pH 7)
Roztwór0,1% (w/v) błękit anilinowy, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glicerol. Roztwór ten może być stosowany do barwienia kalozy i celulozy w wielu stadiach rozwoju (np. osadzanie się kalozy u samców i samic teradów, czopy kalozy w łagiewkach pyłkowych). Wzbudzenie w promieniowaniu UV i maksymalna emisja około 455. Może być również wzbudzony przy długości fali 514 nm z emisją na czerwono w celu barwienia zawartości komórek.
zegarmistrzowskie Utrwalacz guma oczyszczający roztwór FPA50 na bazie formaliny podstawowy Roztwór 95% 10ml, zieleń malachitowa błękitu anilinowego

Bibliografia

  1. Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. The origin and early diversification of angiosperms. Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).
  2. Friedman, W. E. The meaning of Darwin's 'abominable mystery'. Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).
  3. Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z. In search of the first flower: A Jurassic angiosperm, Archaefructus, from Northeast China. Science. 282 (5394), 1692-1695 (1998).
  4. Mulcahy, D. L. The rise of the angiosperms: a genecological factor. Science. 206 (4414), 20-23 (1979).
  5. Friedman, W. E., Moore, R. C., Purugganan, M. D. The evolution of plant development. Am J Bot. 91 (10), 1726-1741 (2004).
  6. Endress, P. K. Angiosperm floral evolution: morphological developmental framework. Advances in botanical research Volume 44: Developmental genetics of the flower. Soltis, D., Soltis, P., Leebens-Mack, J. , Academic Press. 1-61 (2006).
  7. Alvarez-Buylla, E. R., et al. Flower development. Arabidopsis Book. 8, 30127(2010).
  8. Beddington, J. Food security: contributions from science to a new and greener revolution. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 365 (1537), 61-71 (2010).
  9. Godfray, H. C., et al. Food security: The challenge of feeding 9 billion people. Science. 327 (5967), 812-818 (2010).
  10. Burkle, L. A., Alarcón, R. The future of plant-pollinator diversity: understanding interaction networks across time, space, and global change. Am J Bot. 98 (3), 528-538 (2011).
  11. Meyerowitz, E. M., et al. A genetic and molecular model for flower development in Arabidopsis thaliana. Dev Suppl. 1, 157-167 (1991).
  12. Hafidh, S., Fíla, J., Honys, D. Male gametophyte development and function in angiosperms: a general concept. Plant Reprod. 29 (1-2), 31-51 (2016).
  13. Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: common concepts and developmental flexibility in sexual and asexual reproduction. Development. 142 (2), 229-241 (2015).
  14. Sprunck, S., Dresselhaus, T. Three cell fusions during double fertilization. Cell. 161 (4), 708-709 (2015).
  15. Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Curr Biol. 26 (3), R125-R139 (2016).
  16. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
  17. Roeder, A. H., Yanofsky, M. F. Fruit development in Arabidopsis. Arabidopsis Book. 4, e0075(2006).
  18. Hama, H., et al. Scale, a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  19. Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB. a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  20. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  21. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  22. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  23. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
  24. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Sci Rep. 6, 18631(2016).
  25. Endress, P. K. Evolution and floral diversity: the phylogenetic surroundings of Arabidopsis and Antirrhinum. Int J Plant Sci. 153 (3, Part 2), S106-S122 (1992).
  26. Reyes-Olalde, J. I., Zuñiga-Mayo, V. M., Chávez Montes, R. A., Marsch-Martínez, N., de Folter, S. Inside the gynoecium: at the carpel margin. Trends Plant Sci. 18 (11), 644-655 (2013).
  27. Hill, J. P., Lord, E. M. Floral development in Arabidopsis thaliana: a comparison of the wild type and the homeotic pistillata mutant. Can J Bot. 67 (10), 2922-2936 (1989).
  28. Sessions, R. A., Zambryski, P. C. Arabidopsis gynoecium structure in the wild type and in ettin mutants. Development. 121 (5), 1519-1532 (1995).
  29. Schneitz, K., Hülskamp, M., Pruitt, R. E. Wild-type ovule development in Arabidopsis thaliana: a light microscope study of cleared whole-mount tissue. Plant J. 7 (5), 731-749 (1995).
  30. Sundberg, E., Ferrándiz, C. Gynoecium patterning in Arabidopsis: a basic plan behind a complex structure. Annual Plant Reviews Volume 38: Fruit Development and Seed Dispersal. Østergaard, L. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 35-69 (2009).
  31. Meinke, D. W. 10 seed development in Arabidopsis thaliana. Cold Spring Harbor Monograph Archive. 27, 253-295 (1994).
  32. Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring Harbour, N.Y. (2002).
  33. Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. Am J Bot. 58 (8), 785-790 (1971).
  34. Alexander, M. P. A versatile stain for pollen fungi, yeast and bacteria. Stain Technol. 55 (1), 13-18 (1980).
  35. Herr, J. M. Jr Applications of a new clearing technique for the investigation of vascular plant morphology. J Elisha Mitchell Sci Soc Chapel Hill N C. 88 (3), 137-143 (1972).
  36. Herr, J. M. Clearing techniques for the study of vascular plant tissues in whole structures and thick sections. Tested studies for laboratory teaching. Proceedings of the Fifth Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE). Goldman, C. A., Hauta, P. L., O'Donnell, M. A., Andrews, S. E., van der Heiden, R. 5, Toronto, Ontario, Canada. 63-84 (1993).
  37. Colcombet, J., Boisson-Dernier, A., Ros-Palau, R., Vera, C. E., Schroeder, J. I. Arabidopsis somatic embryogenesis receptor kinases1 and 2 are essential for tapetum development and microspore maturation. Plant Cell. 17 (12), 3350-3361 (2005).
  38. Heslop-Harrison, J., Heslop-Harrison, Y., Shivanna, K. R. The evaluation of pollen quality and a further appraisal of the fluorochromatic (FCR) test procedure. Theor Appl Genet. 67 (4), 367-379 (1984).
  39. Stone, J. L., Thomson, J. D., Dent-Acosta, S. J. Assessment of pollen viability in handpollination experiments: A review. Amer J Bot. 82 (9), 1186-1197 (1995).
  40. Dafni, A., Firmage, D. Pollen viability and longevity: practical, ecological and evolutionary implications. Plant Syst Evol. 222 (1-4), 113-132 (2000).
  41. Lora, J., Testillano, P. S., Risueño, M. C., Hormaza, J. I., Herrero, M. Pollen development in Annona cherimola Mill. (Annonaceae). Implications for the evolution of aggregated pollen. BMC Plant Biol. 9, 129(2009).
  42. Ross, K. J., Fransz, P., Jones, G. H. A light microscopic atlas of meiosis in Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 4 (7), 507-516 (1996).
  43. Park, S. K., Howden, R., Twell, D. The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollen1 disrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate. Development. 125 (19), 3789-3799 (1998).
  44. Haseloff, J. Old botanical techniques for new microscopes. BioTechniques. 34 (6), 1174-1182 (2003).
  45. Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
  46. Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiol. 172 (4), 2388-2402 (2016).
  47. Crane, C. F., Carman, J. G. Mechanisms of apomixis in Elymus rectisetus from eastern Australia and New Zealand. Am J Bot. 74 (4), 477-496 (1987).
  48. Young, B. A., Sherwood, R. T., Bashaw, E. C. Cleared-pistil and thick-sectioning techniques for detecting aposporous apomixis in grasses. Can J Bot. 57 (15), 1668-1672 (1979).
  49. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142, 4168-4179 (2015).
  50. Warner, C. A., et al. An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with Fluorescence Microscopy. Plant Phys. 166, 1684-1687 (2014).
  51. Hasegawa, J., Sakamoto, Y., Nakagami, S., Aida, M., Sawa, S., Matsunaga, S. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant Cell Physiol. 57 (3), 462-472 (2016).
  52. Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A Versatile Optical Clearing Protocol for Deep Tissue Imaging of Fluorescent Proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS ONE. 11 (8), e0161107(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Disekcja kwiatu Arabidopsismikroskopia konfokalnabarwienie wodzianem chloraluroztw r Alexandraroztw r HerraSDS wodorotlenek sodubarwienie DAPIanaliza organ w kwiatowychbadanie ziaren py ku
Całościowe oczyszczanie i barwienie organów kwiatowych Arabidopsis i krzemianek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.