Opisujemy tutaj technikę, która łączy mutagenezę transpozonów z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji i ilościowego określenia transpozonów mutantów leptospiralnych w tkankach po wyzwaniu chomików. Protokół ten może być stosowany do badań przesiewowych mutantów pod kątem przeżycia i rozprzestrzeniania się u zwierząt, a także może być stosowany w badaniach in vitro.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie równoległe w celu pomiaru sprawności Leptospira interrogans Mutanty insercji transpozonów podczas infekcji złotego chomika syryjskiego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W tym manuskrypcie opisujemy technikę sekwencjonowania transpozonów (Tn-Seq) w celu identyfikacji i ilościowego określenia mutantów Leptospira interrogans, które zmieniły swoją przydatność podczas infekcji złotych chomików syryjskich. Tn-Seq łączy losową mutagenezę transpozonów z mocą technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Zwierzęta są poddawane próbie pobrania puli mutantów transpozonów (pula wejściowa), a następnie pobraniu krwi i tkanek kilka dni później w celu zidentyfikowania i ilościowego określenia liczby mutantów w każdym narządzie (pule wyjściowe). Pule wyjściowe są porównywane z pulą wejściową w celu oceny dopasowania in vivo każdego mutanta. Takie podejście umożliwia badania przesiewowe dużej puli mutantów u ograniczonej liczby zwierząt. Z niewielkimi modyfikacjami protokół ten można przeprowadzić z dowolnym zwierzęcym modelem leptospirozy, modelami żywiciela rezerwuarowego, takimi jak szczury i modelami ostrej infekcji, takimi jak chomiki, a także z badaniami in vitro. Tn-Seq stanowi potężne narzędzie do badań przesiewowych w kierunku mutantów z wadami sprawności in vivo i in vitro.
Wprowadzenie
Identyfikacja genów wirulencji dla niektórych bakterii, takich jak Leptospira spp., jest trudna ze względu na ograniczoną liczbę dostępnych narzędzi genetycznych. Jednym z powszechnie stosowanych podejść jest stworzenie kolekcji mutantów poprzez losową mutagenezę transpozonów, a następnie identyfikację miejsca insercji w każdym mutancie i testowanie wirulencji poszczególnych mutantów transpozonów w modelu zwierzęcym. Takie podejście jest czasochłonne, kosztowne i wymaga dużej liczby zwierząt.
Gdy po raz pierwszy opracowano losową mutagenezę dla patogenu Leptospira interrogans, geny odpowiedzialne za wirulencję zostały zide....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
OSTROŻNIE: Patogenne szczepy Leptospira spp. muszą być przetwarzane zgodnie z procedurami poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej (PPE). Wszystkie manipulacje z patogennymi Leptospira spp. muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
1. Tworzenie biblioteki mutantów transpozonowych15
- Transfer transpozonu do Leptospira gat.. poprzez konjugację (Rycina 1)
- Zaszczepić objętość hodowli patogennej w fazie wykładn....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Tworzenie biblioteki mutantów transpozonych u L. interrogans poprzez koniugację wymaga zastosowania jednostki filtracyjnej, jak pokazano na Rysunku 1. Z każdego procesu kojarzenia odzyskano 100-200 transkonjugantów.
Miejsce insercji transpozonu identyfikuje się w każdym mutancie poprzez sekwencjonowanie produktu PCR uzyskanego za pomocą półlosowej reakcji PCR, która celuje w koniec transpoz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż wyniki naszego eksperymentu pilotażowego dla chomików z prowokacją dootrzewnową z 42 mutantami L. interrogans są przedstawione17, spodziewamy się, że większe pule mutantów mogą być badane przez Tn-Seq. Ponieważ częstość transkoniugantów jest niska (100-200 transkoniugantów/krycie), konieczne jest kilka kryć, aby wygenerować wystarczającą liczbę mutantów do dużych eksperymentów Tn-Seq. Utrzymanie dużej liczby mutantów w płynnych kulturach stanowi wyzwanie logistyczne, z którym nale.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Veterans Affairs Merit Award (dla D.A.H.) oraz grant National Institute of Health R01 AI 034431 (dla D.A.H.).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Siarczan kanamycyny z Streptomyces kanamyceticus | Sigma-Aldrich | K4000 | |
| Kwas 2,6-diaminopimeliczny | Sigma-Aldrich | D1377 | |
| Spektynomycyna dichlorowodorek pentahydrat | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Axio Lab A1 z kondendensem ciemnego pola | Zeiss | 490950-001-000 | |
| Zestaw do oczyszczania krwi i tkanek DNeasy | Qiagen | 69504/69506 | |
| MinElute PCR Purification | Qiagen | 28004/28006 | |
| QIAquick PCR zestaw do oczyszczania | Qiagen | 28104/28106 | |
| Model 505 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-505 | |
| 2,5-calowy róg kubkowy | Fisher Scientific | FB-4625 | |
| Koralik Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | Krok 3.1.2.4 |
| Końcowa deoksynukleotydylotransferaza | Promega | M828C | |
| Master mix Phusion | Thermo Scientific | F531 | Przygotowanie bibliotek genomicznych, krok 3.4. |
| DreamTaq Master Mix | Thermo Scientific | K9011/K9012 | Identyfikacja miejsca wprowadzenia transpozonu, krok 1.2. |
| dCTP | Thermo Scientific | R0151 | |
| ddCTP | Affymetrix/ USBProducts | 77112 | |
| T100 Termocykler | BioRad | 1861096 | |
| Qubit 2.0 fluorometr | Invitrogen | Q32866 | krok 3.6. |
| Zestaw testowy Qubit dsDNA HS | Invitrogen | Q32851/Q32854 | krok 3.6. |
| Technologie żywotności | probówek do testów kubitowych | Q32856 | krok 3.6. |
| PBS pH 7,2 (1X) | Gibco | 20012-027 20012-050 | |
| Jednorazowy skalpel No10 | Feather | 2975#10 | |
| Plastikowe probówki K2 EDTA 2 ml | Vacutainer 367841 | ||
| strzykawka BD U-100 z 26G x ½ ” igły | BD vacutainer | 329652 | wyzwanie IP, krok 2.2.1. |
| 3 ml strzykawka z końcówką Luer-Lok | Vacutainer BD | 309657 | Nakłucie serca, krok 2.4.2. |
| Vacutainer BD | z igłą 25G X 5/8" | 305901 | Nakłucie serca, krok 2.4.2. |
| Podstawa ze szkła spiekanego 25 mm z korkiem | EMD Millipore | XX1002502 | System filtracji, krok 1.1.7. |
| Aluminiowy zacisk sprężynowy 25 mm | EMD Millipore | XX1002503 | System jednostki filtracyjnej, krok 1.1.7. |
| Lejek ze szkła borokrzemianowego o pojemności 15 ml | EMD Millipore | XX1002514 | System filtracji, krok 1.1.7. |
| Kolba Erlenmeyera z ramieniem bocznym o pojemności 125 ml | EMD Millipore | XX1002505 | System jednostki filtracyjnej, krok 1.1.7. |
| Filtr octanowo-celulozowy VVPP (wielkość porów 0,1 mm; średnica 25 mm) | EMD Millipore | VVLP02500 |
Bibliografia
- Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
- Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
