Method Article

Wygodna metoda ekstrakcji i analizy za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej neuroprzekaźników katecholaminy i ich metabolitów

DOI:

10.3791/56445

⸱

March 1st, 2018

 ,  ,  ,  , 
1School of Public Health of Southeast University, Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 3School of Public Health, Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy, Nanjing Foreign Language School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy wygodną ekstrakcję do fazy stałej w połączeniu z wysokociśnieniową chromatografią cieczową (HPLC) z detekcją elektrochemiczną (ECD) do jednoczesnego oznaczania trzech neuroprzekaźników monoaminowych i dwóch ich metabolitów w moczu niemowląt. Identyfikujemy również metabolit MHPG jako potencjalny biomarker do wczesnej diagnostyki uszkodzeń mózgu u niemowląt.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekstrakcja i analiza neuroprzekaźników katecholaminowych w płynach biologicznych ma ogromne znaczenie w ocenie funkcji układu nerwowego i powiązanych chorób, ale ich precyzyjny pomiar jest nadal wyzwaniem. Opisano wiele protokołów pomiaru neuroprzekaźników za pomocą różnych instrumentów, w tym wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC). Istnieją jednak niedociągnięcia, takie jak skomplikowana operacja lub trudne do wykrycia wiele celów, których nie da się uniknąć, a obecnie dominującą techniką analizy jest nadal HPLC w połączeniu z czułą detekcją elektrochemiczną lub fluorymetryczną, ze względu na jej wysoką czułość i dobrą selektywność. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół wstępnego leczenia i wykrywania katecholamin za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z detekcją elektrochemiczną (HPLC-ECD) w rzeczywistych próbkach moczu niemowląt, przy użyciu elektroprzędzonych nanowłókien kompozytowych składających się z polimerowego eteru koronowego z polistyrenem jako adsorbentem, znanego również jako metoda ekstrakcji do fazy stałej z włóknami w upakowanych włóknach (PFSPE). Pokazujemy, w jaki sposób próbki moczu można łatwo wstępnie oczyścić za pomocą kolumny fazy stałej wypełnionej nanowłóknami oraz jak anality w próbce mogą być szybko wzbogacane, desorbowane i wykrywane w systemie ECD. PFSPE znacznie upraszcza procedury obróbki wstępnej próbek biologicznych, pozwalając na skrócenie czasu, kosztów i zmniejszenie utraty celów.

Ogólnie rzecz biorąc, ta praca ilustruje prosty i wygodny protokół ekstrakcji do fazy stałej sprzężony z systemem HPLC-ECD do jednoczesnego oznaczania trzech neuroprzekaźników monoaminowych (noradrenaliny (NE), epinefryny (E), dopaminy (DA)) i dwóch ich metabolitów (3-metoksy-4-hydroksyfenyloglikol (MHPG) i kwas 3,4-dihydroksy-fenylooctowy (DOPAC)) w moczu niemowląt. Ustalony protokół zastosowano do oceny różnic w katecholaminach w moczu i ich metabolitach między niemowlętami wysokiego ryzyka z okołoporodowym uszkodzeniem mózgu a zdrowymi osobami z grupy kontrolnej. Analiza porównawcza wykazała istotną różnicę w MHPG w moczu między obiema grupami, co wskazuje, że metabolity katecholamin mogą być ważnym markerem kandydującym do wczesnej diagnozy przypadków zagrożonych uszkodzeniem mózgu u niemowląt.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuroprzekaźniki katecholaminy i zawartość ich metabolitów w płynach ustrojowych mogą wpływać na funkcje neuronalne i w dużym stopniu wpływać na równowagę stanów reakcji na bodziec1. Nieprawidłowości mogą powodować różne choroby, takie jak pheochromacytoma, ganglioneuroma, neuroblastoma i zaburzenia neurologiczne1,2. Ekstrakcja i oznaczanie katecholamin w płynach ustrojowych ma znaczenie dla diagnozowania odpowiednich chorób. Jednak katecholaminy w próbkach biologicznych występują w niskich stężeniach i łatwo się utleniają. Co więcej, są one bardzo trudne do elucji ze względu na dużą ilość zakłóceń w medium3. W związku z tym jednoczesne wykrywanie katecholamin w płynach biologicznych nadal stanowi wyzwanie.

Pojawiły się opinie pokazujące, że katecholaminy w moczu mogą być miarą stresu, a ich poziomy są ważnymi markerami biologicznymi reagującymi na stymulację dotykową u noworodków5. Według badań, wszystkie niemowlęta, które ucierpiały z powodu wcześniaków, są narażone na ryzyko uszkodzenia mózgu4,5,6, a uraz może powodować nieprawidłowe uwalnianie katecholamin i powiązanych substancji do płynów. Istnieją zaawansowane techniki rezonansu magnetycznego, które mogą wykryć uszkodzenie mózgu we wcześniejszych fazach7,8. Jednak w ciągu pierwszych 48 godzin nieprawidłowy proces neurorozwojowy spowoduje trwałe uszkodzenie mózgu, które nie będzie widoczne na obrazach medycznych11. Poza tym wysokie koszty i ograniczone zasoby instrumentów, wraz z innymi czynnikami, uniemożliwiają wszystkim oddziałom neonatologicznym dostęp do tych specjalistycznych technik neuroobrazowania. Jednak zastosowanie łatwo dostępnych i praktycznych biomarkerów (takich jak katecholaminy i ich metabolity) może przezwyciężyć te niedociągnięcia, a badania przesiewowe biomarkera w płynach ludzkich mogą pomóc we wczesnej diagnozie uszkodzenia mózgu i doprowadzić do szybkiej identyfikacji noworodków wymagających neuroprotekcji9. Katolaminy w moczu mogą być łatwym i oczywistym wskaźnikiem, ze względu na bezpośrednią korelację między ilością ich uwalnianych do płynów a funkcją neuroaktywności.

Wśród płynów biologicznych, próbki płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) i osocza nie są łatwe do zdobycia za pomocą istniejących procedur traumatycznych, a także bardzo trudno jest pozbyć się zakłóceń spowodowanych białkiem adhezyjnym i innymi zanieczyszczeniami, co prowadzi do kłopotliwego i czasochłonnego procesu pobierania próbek, który nie nadaje się do wielokrotnego wykrywania. Również w przypadku dzieci prawie niemożliwe jest pobranie próbek w traumatyczny sposób. Dlatego pobieranie próbek moczu jest lepsze niż inne formy pobierania próbek, ponieważ jest nieinwazyjne, łatwe w obsłudze i może być wykonywane wielokrotnie. Próbki moczu są obfite i łatwe do przechowywania oraz wykazują ogromne zalety w porównaniu z innymi formami próbek biologicznych.

Główne metody ilościowego oznaczania katecholamin w płynach biologicznych obejmują testy radioenzymatyczne10, testy immunoenzymatyczne i sorbentowe11, woltamperometria12 i spektrometria termiczna soczewek13. Istnieją jednak niedociągnięcia, takie jak skomplikowane operacje i trudne do wykrycia wiele celów. Obecnie dominującą techniką analizy jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)14, w połączeniu z czułą elektrochemią15 lub detekcją fluorymetryczną16, ze względu na jej wysoką czułość i dobrą selektywność. Dzięki technologii tandemowej spektrometrii mas, takiej jak chromatografia cieczowa / spektrometria mas (LC / MS) i chromatografia cieczowa / spektrometria mas / spektrometria mas (LC / MS / MS), analiza i kwantyfikacja neuroprzekaźników może osiągnąć wysoką dokładność i swoistość17,18. Jednak technika MS wymaga drogiego oprzyrządowania, a także znacznie wykwalifikowanej siły roboczej, co sprawia, że metoda ta jest trudna do uniwersalnego zastosowania w większości konwencjonalnych laboratoriów. Systemy HPLC-ECD są powszechnie wyposażone w większość konwencjonalnych i klinicznych laboratoriów, a zatem stały się powszechnym i dobrym wyborem dla grup badawczych do oznaczania chemicznego, ale wymagają, aby próbka wprowadzana do systemu była czysta i miała objętość w mikroskali19. Dlatego bardzo ważne jest oczyszczenie i zagęszczenie próbki przed analizą. Klasyczną metodą etapu oczyszczania jest ekstrakcja ciecz-ciecz14,15,20 i ekstrakcja w fazie stałej off-line, w tym aktywowana kolumna tlenku glinu21,22 i kompleksowanie difenylboranu (DPBA)23,24,25,26.

Myeongho Lee et al. od 2007 roku używają żywicy polimerowej modyfikowanej chemicznie eterem koronowym jako adsorbentu do selektywnej ekstrakcji katecholamin z ludzkiego moczu27. Również w 2006 roku Haibo He i wsp. Zademonstrowano łatwe podejście do syntezy sorbentu do ekstrakcji powinowactwa do boronianu poprzez wykorzystanie funkcjonalizowanego nanomagnetycznego wielościennego oligomerycznego silseskwioksanu (POSS) kompozytu nanomagnetycznego i zastosowanie go do wzbogacania katecholamin w ludzkim moczu (noradrenaliny, epinefryny i izoprenaliny)28. Wykorzystali również nanomateriały do wykonania prac, wykorzystując technologię zwaną nano-elektroprzędzeniem i formując polimerowy materiał włóknisty w nanoskali. Proces elektroprzędzenia może dostosować średnicę, morfologię i wyrównanie przestrzenne produktu poprzez kontrolowanie napięcia roboczego i zmianę zawartości roztworu przędzalniczego wraz z innymi parametrami29. W porównaniu z konwencjonalnym wkładem SPE, elektroprzędzone nanowłókna doskonale nadają się do ekstrakcji i wzbogacania docelowych analitów ze złożonej matrycy, ponieważ są wyposażone w wysokie proporcje powierzchni do objętości, aby adsorbować anality z wysoką wydajnością i wykazują łatwiejsze do kontrolowania właściwości chemiczne powierzchni, co pozwala na wygodne przyłączanie związków docelowych. Te właściwości sprawiają, że są dobrym wyborem dla adsorbentów SPE, znacznie zmniejszając ilość rozpuszczalnika w fazie stałej i desorpcji30,31,32,33. W przypadku katecholamin w próbkach moczu, elektroprzędzone nanowłókna złożone z apolimerowego eteru koronowego z polistyrenem (PCE-PS) użyto do selektywnej ekstrakcji trzech katecholamin (NE, E i DA)34. W pracy wskazano, że selektywny eter koronowy adsorbuje cele NE, E i DA, co opiera się na jego prawidłowej geometrii wiązania katecholamin poprzez tworzenie wiązań wodorowych. Wyniki skutecznie pokazały, że materiał jest eterem koronowym, usuwając inne związki zakłócające zawarte w próbkach biologicznych. Zainspirowani tym raportem, opracowano nowatorską metodę selektywnej ekstrakcji katecholamin przy użyciu elektroprzędzonych kompozytowych nanowłókien składających się z PCE-PS.

W tym artykule metoda opisana wcześniej34 została ulepszona i wykorzystana nie tylko do skutecznej analizy E, NE i DA, ale także ich metabolitów, MHPG i DOPAC, w moczu. Badamy również nowe możliwości dla mechanizmu procesu adsorpcji. Metoda wykazuje zadowalającą skuteczność ekstrakcji i selektywność dla pięciu analitów, a metoda została zweryfikowana w analizie moczu niemowląt wysokiego ryzyka z okołoporodowym uszkodzeniem mózgu i zdrowych osób z grupy kontrolnej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzyskano świadomą zgodę rodziców i uzyskano zgodę instytucjonalnej komisji rewizyjnej na badanie. Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z kodeksem etycznym Światowego Stowarzyszenia Lekarzy (Deklaracja Helsińska) dla eksperymentów z udziałem ludzi. Opiekunowie wszystkich uczestników wyrazili pisemną zgodę na włączenie do badania. Uzyskano również zgodę komisji etycznej od szpitala Zhongda, powiązanego z Uniwersytetem Południowo-Wschodnim.

1. Przygotowanie kolumn i roztworów potrzebnych do ekstrakcji i oznaczania katecholamin

  1. Przygotuj kolumnę PFSPE. Podzielić 1-2 mg nanowłókien PCE-PS na 5-6 podwielokrotności i za pomocą cienkiego stalowego pręta o średnicy 0,5 mm wcisnąć je w uporządkowany sposób na końcu końcówki pipety o objętości 200 μl.
  2. Przygotować sztuczny mocz, ważąc 2,427 g mocznika, 0,034 g kwasu moczowego, 0,09 g kreatyniny, 0,297 g cytrynianu trisodowego, 0,634 g chlorku sodu, 0,45 g chlorku potasu, 0,161 g chlorku amonu, 0,089 g dwuwodnego chlorku wapnia, 0,1 g siedmiowodnego siarczanu magnezu, 0,034 g wodorowęglanu sodu, 0,003 g szczawianu sodu, 0,258 g siarczanu sodu, 0,1 g diwodorofosforanu sodu, i 0,011 g wodorofosforanu disodowego i rozpuść powyższe chemikalia w 200 ml wody dejonizowanej.
  3. Przygotować roztwór podstawowy boranu difenylu (DPBA) o stężeniu 2 mg/ml, rozpuszczając 2 mg tego związku w 1 ml wody destylowanej. Przechowywać roztwór w ciemności w temperaturze 4 °C.
  4. Analit standardowy
    UWAGA: Struktura chemiczna i właściwości katecholamin są niestabilne i łatwo ulegają rozkładowi. Proces przygotowania norm musi być bardzo szybki i musi zapobiegać ekspozycji na bezpośrednie działanie promieni słonecznych.
    1. Odważyć 1,0 mg bromowodorku NE, E, DA, MHPG, DOPAC i wzorca wewnętrznego bromowodorku 3,4-dihydroksybenzyloaminy DHBA w oddzielnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Przed użyciem rozcieńczyć roztwór DHBA w wodzie do 100 ng/ml.
    2. Przygotowane wzorce należy oscylować w ciemności z dużą prędkością, aż anality całkowicie się rozpuszczą. Jest to stado podstawowe; przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do kilku tygodni.
    3. Przygotuj wtórne zapasy analitu 1,000 ng / ml. Dla NE, E, DA, DOPAC i MHPG przenieść 5 μl każdego pierwotnego analitu do 4,975 μl wody destylowanej w probówce wirówkowej o pojemności 5 ml i przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Codziennie przygotowuj te roztwory na świeżo. W przypadku DHBA przenieść 5 μl wywaru pierwotnego do 4,995 μl wody destylowanej w probówce wirówkowej o pojemności 5 ml i przechowywać w ciemności oddzielnie w temperaturze 4 °C.
    4. Dokonać dalszych rozcieńczeń z wtórnym analitem w celu utworzenia krzywej wzorcowej (np. Tabela uzupełniająca 2). Roztwory przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C i codziennie przygotowywać świeże.
    5. Przetestuj optymalne napięcie detektora ECD przy użyciu standardowej kolby o odpowiednim stężeniu. Zmieniaj napięcie, aby znaleźć wartość, w której anality mają najlepszy wygląd piku.
  5. Przygotować eluant zawierający 30% kwasu fosforowego, 15% acetonitrylu i 55% wody destylowanej. Na 10 ml rozpuszczalnika eluantu użyj 5,5 ml wody destylowanej i dodaj kropla po kropli do wody 1,5 ml acetonitrylu i 3 ml kwasu fosforowego.

2. Przygotowanie prawdziwych próbek moczu i faza ruchoma

  1. Poproś matki, aby zebrały pierwszy poranny mocz swoich niemowląt za pomocą aseptycznych kubków na mocz. Przenieść próbki do probówek polipropylenowych i natychmiast oznaczyć etykietą. Następnie należy przechowywać próbki w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
  2. Wirować i odwirowywać próbki moczu o masie 1 510 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT), aby pozbyć się większości zakłóceń spowodowanych cząstkami stałymi. Odrzuć osad i zbierz supernatanty do dalszych eksperymentów. W celu skutecznej ekstrakcji analitów należy przystąpić do obróbki wstępnej PFSPE (krok 3) natychmiast po odwirowaniu.
  3. Przygotowanie fazy mobilnej
    1. Przygotuj czystą butelkę, co najmniej 1 l. Skład fazy ruchomej jest wymieniony w tabeli uzupełniającej 1; dla 1 l fazy ruchomej odmierzyć do butelki 6,7242 g kwasu cytrynowego, 93,06 mg soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 7,02 g monometalicznego ortofosforanu sodu, 404,5 mg soli sodowej kwasu 1-heptanosulfonowego i 3,5 g hydratu sodu. Dodaj 40 ml acetonitrylu i wody destylowanej do 1,000 ml. Mieszać i wibrować ultradźwiękowo przez 15 minut, aż cała materia w roztworze się rozpuści.
    2. Za pomocą pH-metru ze szklaną elektrodą dostosować wartość pH fazy ruchomej do 4,21 za pomocą nasyconego roztworu wodorotlenku sodu.
    3. Przefiltruj fazę ruchomą za pomocą mikroporowatej membrany z polifluorku winylidenu 0,45 μm i próżniowego urządzenia ssącego, aby pozbyć się zanieczyszczeń.
    4. Użyj wibracji ultradźwiękowych przez 15 minut, aby odgazować fazę ruchomą za każdym razem przed użyciem.

3. Ekstrakcja PFSPE i analiza HPLC

  1. Aktywuj nanowłókna. Przeciśnij kolejno 100 μl metanolu i 100 μl wody przez kolumnę PFSPE za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml w powolny, kroplowy sposób.
  2. Zmieszać 100 μl próbki moczu ze 100 μl roztworu DPBA 2 mg/ml i 30 μl 100 ng/ml roztworu DHBA (IS, wzorzec wewnętrzny) w probówce EP o pojemności 0,5 ml, a następnie przenieść zmieszany roztwór do kolumny PFSPE. Przecisnąć zmieszany roztwór próbki przez kolumnę PFSPE za pomocą gazoszczelnej plastikowej strzykawki o pojemności 5 ml, wykorzystując siłę ciśnienia powietrza.
  3. Wypłukać kolumnę trzykrotnie, ładując 100 μl roztworu DPBA (2 mg/ml) do kolumny SPE i powoli przepychać roztwór przez wkład pod ciśnieniem powietrza za pomocą gazoszczelnej plastikowej strzykawki o pojemności 5 ml.
  4. Załadować 50 μl eluantu na kolumnę PFSPE i przepchnąć go przez kolumnę, zbierając eluat za pomocą probówki EP o pojemności 0,5 ml.
  5. Włącz odgazowywacz HLPC, aby odgazować powietrze w systemie. Przed przystąpieniem do analizy próbek system powinien pracować przez ponad 0,5 godziny z fazą ruchomą w celu zrównoważenia i zmniejszenia hałasu linii podstawowej. Patrz Tabela Uzupełniająca 1 przedstawiająca parametry ustawień systemu HPLC.
  6. Pobrać próbkę 20 μl eluatu za pomocą automatycznego próbnika, a następnie wstrzyknąć ją do systemu HPLC-ECD.
  7. Po zakończeniu przebiegów wyłącz komórkę detektora za pomocą interfejsu detektora. NIE wyłączaj ogniwa za pomocą przełącznika z tyłu detektora, ponieważ może to spowodować uszkodzenie instrumentu.
  8. Ręcznie zmień skład fazy ruchomej na 10% metanolu i 90% wody. Biegnij przez co najmniej 30 minut. Następnie ręcznie zmień fazę ruchomą na metanol klasy HPLC. Uruchom przez około 15 minut, aby chronić system w metanolu. Niewykonanie tego kroku zgodnie z zalecanym czasem pracy może spowodować uszkodzenie kolumny i detektora. Wyłącz przepływ, a następnie wyłącz odgazowywacz.

4. Ekstrakcja wkładów z kwasem fenyloboronowym (PBA)

Procedury ekstrakcji kartridży PBA były podobne do schematu w Kumar et al. (2011)25. Wszystkie roztwory są przepychane przez kartridże PBA (100 mg, 1 mL) za pomocą powietrza wtłaczanego przez strzykawkę.

  1. Kondycjonować wkład kolejno 1 ml wody acetonitrylowej (v/v) o proporcji 80:20 zawierającej 1% kwas mrówkowy i 1 ml 50 mM buforu fosforanowego (pH 10).
  2. Przecisnąć zbuforowaną próbkę moczu (1 ml moczu i 2 ml buforu fosforanowego, pH 8,5) przez wkład PBA.
  3. Przemyć wkład 1 ml buforu acetonitrylowo-fosforanowego o stężeniu 50:50 v/v (10 mM, pH 8,5).
  4. Eluować wkład za pomocą 1 ml wody acetonitrylowej (80:20 v/v) zawierającej 1% kwas mrówkowy.

5. Identyfikacja i kwantyfikacja katecholamin

  1. Liniowości
    1. Rozcieńczyć drugorzędowe anality sztucznym moczem do sześciu stężeń (1,5, 3, 12, 25, 50 i 100 ng/ml); objętość rozcieńczenia sztucznego moczu jest zgodna z tabelą uzupełniającą 2. Wykonaj trzy równoległe próbki o każdym stężeniu, aby uzyskać 18 roztworów eksperymentalnych analitu do skonstruowania krzywych kalibracyjnych.
    2. Rozcieńczyć zapas wtórny DHBA sztucznym moczem 10-krotnie, aby uzyskać 100 ng / ml eksperymentalnego roztworu.
    3. Poddać wstępnej obróbce wszystkie roztwory analitu z ppkt 5.1.1, zgodnie z krokiem 3 (procedury ekstrakcji PFSPE). Podobnie jak w kroku 3, wstrzyknąć 20 μl każdego odpowiedniego eluatu do systemu HPLC-ECD, aby uzyskać chromatogram HPLC.
    4. Skonstruuj krzywe kalibracyjne pięciu analitów, wykreślając stosunek powierzchni piku (cele/IS) jako oś Y do stosunku stężeń (cele/IS) jako oś X, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 1.
  2. Wartości LOD i LOQ dla czułości
    1. Wstrzyknąć 20 μl ślepej próby sztucznego moczu do systemu HPLC-ECD (jak w kroku 3), aby uzyskać chromatogram HPLC próbki.
    2. Na chromatogramie z ppkt 5.2.1 zebrać 11 wartości sygnału ślepej próby i obliczyć wartość średnią Xb oraz odchylenie standardowe Sb. Obliczyć minimalny sygnał substancji, który można wykryć przy pewnym poziomie ufności, XL, jako XL = Xb+K*Sb (K jest współczynnikiem określonym przez poziom ufności, Sb odzwierciedla poziom hałasu metody pomiarowej i poziom hałasu maszyny). Zatem LOD = (XL-X b)/S = (K*Sb)/S (S oznacza wartość nachylenia krzywej roboczej).
    3. Zdefiniuj S/N 3:1 (K=3) jako granicę wykrywalności (LOD) i S/N 10:1 (K=10) jako granicę oznaczalności (LOQ).
  3. Oceń odzysk
    1. Przygotuj prawdziwe i wzbogacone próbki moczu. Rozcieńczyć drugorzędowe anality prawdziwym moczem do trzech stężeń (5, 50, 100 ng/ml), aby uzyskać wzbogacone próbki moczu. Przygotować trzy równoległe próbki dla każdego roztworu analitu. Policz zwiększone stężenie jako ilość docelowych związków wzbogaconych w próbce moczu. Zdefiniuj tę wartość jako As.
    2. Rozcieńczyć materiał DHBA do 100 ng/ml, jak w kroku 5.1.2.
    3. Przetwarzać każdy roztwór próbki z ppkt 5.3.1 zgodnie z etapem 3 (procedury ekstrakcji PFSPE) i wstrzykiwać 20 μl każdego odpowiedniego eluantu do systemu HPLC-ECD w celu uzyskania wyniku chromatogramu. Wartość analitów będzie liczona jako ilość związków docelowych określona ilościowo w próbce moczu wzbogaconej. Zdefiniuj tę wartość jako At.
    4. Wstrzyknąć 20 μl próbki moczu do systemu HPLC-ECD (jak w kroku 3), aby uzyskać wynik chromatogramu. Wartość analitów będzie liczona jako początkowa ilość związków docelowych określona ilościowo w próbce moczu. Zdefiniuj tę wartość jako Ai.
    5. Obliczyć ilość związków docelowych w próbkach na podstawie równania krzywej standardowej. Procentowy odzysk szacuje się jako metodologiczny odzysk % = (At - Ai) × 100/(As). Wartości średnie przedstawiono w tabeli 1.
  4. Oceń niedokładność
    1. Przygotować wzbogacone próbki sztucznego moczu o stężeniach 5, 50 i 100 ng/ml, jak w kroku 5.3.1. Przygotować sześć równoległych próbek dla każdego roztworu analitu. Codziennie przygotowuj świeże próbki eksperymentalne.
    2. Rozcieńczyć zapas DHBA do 100 ng/ml, jak w kroku 5.1.2.
    3. Oceń precyzję śróddzienną (n=6). Poddać każdy roztwór próbki w ppkt. 5.4.1 zgodnie z krokiem 3 i wstrzyknąć 20 μl każdego odpowiedniego eluantu do układu HPLC-ECD w celu uzyskania chromatogramu. Wykonaj tę samą operację sześć razy tego samego dnia.
    4. Obliczyć ilość związków docelowych w próbkach na podstawie równania krzywej standardowej. Przy tym samym stężeniu tego samego związku względne odchylenie standardowe (RSD) sześciu testów w ciągu jednego dnia określa się jako precyzję śróddobową. Wartości średnie przedstawiono w tabeli 1.
    5. Oceń precyzję międzydzienną (n=6). O tej samej porze każdego dnia w ciągu sześciu kolejnych dni przygotować wzbogacone próbki sztucznego moczu o trzech stężeniach 5, 50, 100 ng/ml, jak w ppkt 5.4.1 i 5.4.2, i przetworzyć każdy roztwór próbki analitu zgodnie z krokiem 3.
    6. Wstrzyknąć 20 μl każdej odpowiedniej eluatu z ppkt 5.4.5 do systemu HPLC-ECD w celu uzyskania wyników chromatogramu każdego dnia. Obliczyć ilość związków docelowych w próbkach na podstawie równania krzywej standardowej. Precyzja międzydzienna jest wyrażona przez RSD ilości testów z wzbogaconych próbek sztucznego moczu w trzech stężeniach w ciągu sześciu kolejnych dni. Wartości średnie przedstawiono w tabeli 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest prostą i wygodną metodą PFSPE do wstępnego oczyszczania próbek moczu i wzbogacania pięciu katecholamin do wykrywania za pomocą systemu HPLC-ECD; schemat procesu jest pokazany w Rysunek 1. Protokół obejmuje głównie cztery etapy - aktywację, ładowanie, płukanie i elucję - w połączeniu z niewielką ilością nanowłókien PCE-PS i prostym urządzeniem do ekstrakcji do fazy stałej. Morfologię nanowłókien PCE-PS oceniono za pomocą analizatora powierzch...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaproponowana w tym artykule metoda PFSPE może być znacząca i znacząca ze względu na jej szybkość, prostotę i wygodę. Adsorbenty użyte w protokole to elektroprzędzone nanowłókna, które mają wysoki stosunek powierzchni do objętości i adsorbują anality z wysoką wydajnością. Procedura wymaga tylko kilku miligramów nanowłókien i niewielkiej objętości rozpuszczalnika eluantu i nie wymaga etapu odparowywania w celu zagęszczenia analitów. W tym miejscu przedstawiliśmy szczegółowy przegląd protokołu opartego na HPLC-ECD, który p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy zaświadczają, że nie ma konfliktu interesów z żadną organizacją finansową w odniesieniu do materiału omawianego w tym artykule.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauki Chin (nr 81172720, nr 81673230), Program Badań nad Rozwojem Społecznym Departamentu Nauki i Technologii Prowincji Jiangsu (No. BE2016741), Projekt Naukowo-Technologiczny Chińskiej Generalnej Administracji Nadzoru Jakości, Inspekcji i Kwarantanny (2015QK055), Program Projektu Otwartego Kluczowego Laboratorium Rozwoju Dziecka i Nauki o Uczeniu się Ministerstwa Edukacji, Uniwersytet Południowo-Wschodni (CDLS-2016-04). Serdecznie dziękujemy Yuan Song i Ping Liu, którzy pomogli nam w pobraniu próbek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
200 i mikro; L kolumna z końcówkązawierająca nanowłókna
Materiał nanowłókiendo ekstrakcji PFSPE
pręt stalowy (o średnicy około 0,5 mm)wsyp nanowłókna do kolumny
gazoszczelna plastikowa strzykawka (5 ml)skompresuj roztwór na końcu końcówki
metanolSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd67-56-1
ester 2-aminoetylowy kwasu difenyloborynowego (DPBA)Sigma-Aldrich.IncA-106408odczynnik kompleksu
noradrenaliny (NE)Sigma-Aldrich.IncA-9512analit
3-metoksy-4-hydroksyfenyloglikol (MHPG)Sigma-Aldrich.IncH1377analit
epinefryna (E)Sigma-Aldrich.Inc100154-200503analit
3, 4- Kwas dihydroksyfenylooctowy (DOPAC)Sigma-Aldrich.IncD-9128analit
dopamina (DA)Sigma-Aldrich.IncH-8502analit
3, bromowodorek 4-dihydroksybenzyloaminy (DHBA)Sigma-Aldrich.Inc858781etykieta wewnętrzna
acetonitrylSigma-Aldrich.Inc75-05-8elurynat i kwas
fosforowy w fazie ruchomejSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7664-38-2eluriant
kwas moczowySinopharm Chemical ReagentCo., Ltd69-93-2sztuczny mocz
kreatyninaSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd60-27-5mocz
cytrynian trisodowySinopharm Chemical ReagentCo., Ltd6132-04-3sztuczny mocz
KClSinopharm Chemical ReagentCo. , Ltd7447-40-7sztuczny mocz
NH4ClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd12125-02-9sztuczny mocz
NaHCO3Sinopharm Chemical ReagentCo., LtdSWC0140326sztuczny mocz
C2Na2O4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd62-76-0sztuczny mocz
NaSO4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7757-82-6sztuczny mocz
wodorofosforan disodowySinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10039-32-4sztuczny
mocznikmoczu Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd57-13-6sztuczny mocz
NaClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7647-14-5sztuczny mocz
MgSO4.7H2OSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10034-99-8sztuczny mocz
CaCl2Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10035-04-8sztuczny mocz
HClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7647-01-0mocz
kwas cytrynowySinopharm Chemical ReagentCo., Ltd77-92-9sztuczny mocz i faza ruchoma
Sól disodowa EDTASinopharm Chemical ReagentCo., Ltd34124-14-6faza ruchoma
monometaliczny ortofosforan soduSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7558-80-7mocz i faza ruchoma
sól sodowa kwasu 1-heptanosulfonowegoSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd22767-50-6
wodorotlenek soduSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd1310-73-2kolumna
kwasu fenyloboronowego w fazie ruchomej (kolumna PBA)Aglilent12102018ekstrakcji PBA
Inertsil® ODS-3 5 i mikro; m 4,6 razy; Kolumna 150 mmDikma5020-06731Kolumna HPLC do separacji
SHIMADZU SIL-20AC protuberancja AUTOMATYCZNY PRÓBNIKShimadzu Corporation, JaponiaSIL-20ACdo eluriantu
SHIMADZU LC-20AD Wysokowydajna chromatografia cieczowaShimadzu Corporation, JaponiaPompa HPLCLC-20AD
Detektor elektrochemiczny SHIMADZU L-ECD-60AShimadzu Corporation, JaponiaDetektor L-ECD-60Ado analitów
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry SystemMicromeritics, USAanalizator powierzchni i porowatości 
pipety PCE-PS sztuczny sztuczny sztuczny w fazie ruchomej Automatyczny wtrysk

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elhwuegi, A. S. Central monoamines and their role in major depression. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 28, 435-451 (2004).
  2. Da, C. F., Ngoabdalla, S., Houzel, J. C., Rehen, S. K. Murine model for Parkinsons disease: From 6-OH dopamine lesion to behavioral test. J. Vis. Exp. (35), e1376(2010).
  3. Varley, H., Gowenlock, A. H. The clinical chemistry of monoamines. Brit. Med. J. 2, 1330(1963).
  4. Wang, X., Rousset, C. I., Hagberg, H., Mallard, C. Lipopolysaccharide-induced inflammation and perinatal brain injury. Semin. Fetal. Neonatal. Med. 11, 343-353 (2006).
  5. Inder, T. E., Volpe, J. J. Mechanisms of perinatal brain injury. Semin. Neonatol. 5, 3-16 (2000).
  6. Miller, S. P., Ferriero, D. M. From selective vulnerability to connectivity: Insights from newborn brain imaging. Trends. Neurosci. 32, 496-505 (2009).
  7. Barkovich, A. J., et al. Proton MR spectroscopy for the evaluation of brain injury in asphyxiated, term neonates. Am. J. Neuroradiol. 20, 1399-1405 (1999).
  8. Liauw, L., van Wezel-Meijler, G., Veen, S., van Buchem, M. A., van der Grond, J. Do apparent diffusion coefficient measurements predict outcome in children with neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy? Am. J. Neuroradiol. 30, 264-270 (2009).
  9. Varsami, M., et al. Inflammation and oxidative stress biomarkers in neonatal brain hypoxia and prediction of adverse neurological outcome: A review. J. Pediatr. Neonat. Individual. Med. 2, e020203(2013).
  10. Cooper, R. L., Walker, R. F. Microradioenzymic assays for the measurement of catecholamines and serotonin. Methods. Enzymol. 103, 483-493 (1983).
  11. Murphy, J. F. The development of enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) for the catecholamines adrenaline and noradrenaline. J. Immunol. Methods. 154, 89-98 (1992).
  12. Jones, S. R., Mickelson, G. E., Collins, L. B., Kawagoe, K. T., Wightman, R. M. Interference by pH and Ca2+ ions during measurements of catecholamine release in slices of rat amygdala with fast-scan cyclic voltammetry. J. Neurosci. Methods. 52, 1-10 (1994).
  13. Sanchismallols, J. M., Villanuevacamañas, R. M., Ramisramos, G. Determination of unconjugated catecholamine in urine as dopamine by thermal lens spectrometry. Analyst. 117, 1367-1371 (1992).
  14. Lan, C., Liu, W. Determination of catecholamines by HPLC-ECD in urine. Medical Laboratory Science and Clinics. , (2007).
  15. Tsunoda, M., Aoyama, C., Ota, S., Tamura, T., Funatsu, T. Extraction of catecholamines from urine using a monolithic silica disk-packed spin column and high-performance liquid chromatography-electrochemical detection. Anal. Methods. 3, 582-585 (2011).
  16. Bartolini, B., et al. Determination of monoamine oxidase activity by HPLC with fluorimetric detection. Neurobiology (Bp). 7, 109-121 (1999).
  17. Dunand, M., Gubian, D., Stauffer, M., Abid, K., Grouzmann, E. High throughput and sensitive quantitation of plasma catecholamines by ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometryusing a solid phase microwell extraction plate. Anal. Chem. 85, 3539-3544 (2013).
  18. He, H., Carballo-Jane, E., Tong, X., Cohen, L. H. Measurement of catecholamines in rat and mini-pig plasma and urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with solid phase extraction. J. Chromatogr. B. 997, 154-161 (2015).
  19. Simon, N., Young, P. How to increase serotonin in the human brain without drugs. J. Psychiatry. Neurosci. 32, 394-399 (2007).
  20. Grossi, G., et al. Improvements in automated analysis of catecholamine and related metabolites in biological samples by column-switching high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 541, 273-284 (1991).
  21. Iwamot, T., Yoshiura, M., Iriyama, K. Liquid chromatographic identification of urinary catecholamine metabolites adsorbed on alumina. J. Liq. Chromatogr. R. T. 10, 1217-1235 (1987).
  22. Maycock, P. F., Frayn, K. N. Use of alumina columns to prepare plasma samples for liquid-chromatographic determination of catecholamines. Clin. Chem. 33, 286-287 (1987).
  23. Grossi, G., Bargossi, A., Lippi, A., Battistoni, R. A fully automated catecholamines analyzer based on cartridge extraction and HPLC separation. Chromatographia. 24, 842-846 (1987).
  24. Rondelli, I., et al. New method for the resolution of the enantiomers of 5,6-dihydroxy-2-methyl-aminotetralin by selective derivatization and HPLC analysis: Application to biological fluids. Chirality. 8, 381-389 (1996).
  25. Kumar, A., Hart, J. P., McCalley, D. V. Determination of catecholamines in urine using hydrophilic interaction chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr. A. 1218, 3854-3861 (2011).
  26. Sabbioni, C., et al. Simultaneous liquid chromatographic analysis of catecholamines and 4-hydroxy-3-methoxyphenylethylene glycol in human plasma: Comparison of amperometric and coulometric detection. J. Chromatogr. A. 1032, 65-71 (2004).
  27. Lee, M., et al. Selective solid-phase extraction of catecholamines by the chemically modified polymeric adsorbents with crown ether. J. Chromatogr. A. 1160, 340-344 (2007).
  28. He, H., et al. Facile synthesis of a boronate affinity sorbent from mesoporous nanomagnetic polyhedral oligomeric silsesquioxanes composite and its application for enrichment of catecholamines in human urine. Anal. Chim. Acta. 944, 1-13 (2016).
  29. Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. J. Appl. Polym. Sci. 96, 557-569 (2005).
  30. Hu, W. Y., et al. Packed-fiber solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for determination of diethylstilbestrol, hexestrol, and diedestrol residues in milk. J. Chromatogr. B. 957, 7-13 (2014).
  31. Liu, Z., Kang, X., Fang, F. Solid phase extraction with electrospun nanofibers for determination of retinol and α-tocopherol in plasma. Microchim. Acta. 168, 59-64 (2010).
  32. Qi, D., Kang, X., Chen, L., Zhang, Y., Wei, H., Gu, Z. Electrospun polymer nanofibers as a solid-phase extraction sorbent for the determination of trace pollutants in environmental water. Anal. Bioanal. Chem. 390, 929-938 (2008).
  33. Kang, X. J., Chen, L. Q., Zhang, Y. Y., Liu, Y. W., Gu, Z. Z. Performance of electrospun nanofibers for SPE of drugs from aqueous solutions. J. Sep. Sci. 31, 3272-3278 (2008).
  34. Chen, L. Q., Wang, Y., Qu, J. S., Deng, J. J., Kang, X. J. Selective extraction of catecholamines by packed fiber solid-phase using composite nanofibers composing of polymeric crown ether with polystyrene. Biomed. Chromatogr. 29, 103-109 (2015).
  35. Chen, L. Q., Zhu, X. H., Shen, J., Zhang, W. Q. Selective solid-phase extraction of catecholamines from plasma using nanofibers doped with crown ether and their quantitation by HPLC with electrochemical detection. Anal. Bioanal. Chem. 408, 4987-4994 (2016).
  36. Hu, H., Zhang, Y., Zhang, Y., Huang, X., Yuan, D. Preparation of a new sorbent based on boronate affinity monolith and evaluation of its extraction performance for nitrogen-containing pollutants. J. Chromatogr. A. 1342, 8-15 (2014).
  37. Chen, J., et al. Sensitive determination of four camptothecins bysolid-phase microextraction-HPLC based on a boronic acid contained polymer monolithic layer. Anal. Chim. Acta. 879, 41-47 (2015).
  38. Li, D., Chen, Y., Liu, Z. Boronate affinity materials for separation and molecular recognition: structure, properties and applications. Chem. Soc. Rev. 44, 8097-8123 (2015).
  39. Yan, J., Springsteen, G., Deeter, S., Wang, B. The relationship among pKa, pH, and binding constants in the interactions between boronic acids and diols: It is not as simple as it appears. Tetrahedron. 60, 11205-11209 (2004).
  40. Reuster, T., Rilke, O., Oehler, J. High correlation between salivary MHPG and CSF MHPG. Psychopharmacology. 162, 415-418 (2002).
  41. Beckmann, H., Goodwin, F. K. Urinary MHPG in subgroups of depressed patients and normal controls. Neuropsychobiology. 6, 91-100 (1980).
  42. Mitoma, M., et al. Stress at work alters serum brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels and plasma 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) levels in healthy volunteers: BDNF and MHPG as possible biological markers of mental stress? Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 32, 679-685 (2008).
  43. Ressler, K. J., Nemeroff, C. B. Role of Norepinephrine in the Pathophysiology and Treatment of Mood Disorders. Biol. Psychiatry. 46, 1219-1233 (1999).
  44. Alonso-Spilsbury, M., et al. Perinatal asphyxia pathophysiology in pig and human: A review. Anim. Reprod. Sci. 90, 1-30 (2005).
  45. Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant: Current concepts. Early. Hum. Dev. 80, 125-141 (2004).
  46. Maas, J. W., Leckman, J. F. relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary MHPG and other norepinephrine metabolites. MHPG: Basic Mechanisms and Psychopathology. , Academic Press. 33-43 (1983).
  47. Maas, J. W. Relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary concentrations of norepinephrine metabolites. Adv. Biochem. Psychopharmacol. 39, 45-55 (1984).
  48. Peyrin, L., Pequignot, J. M., Chauplannaz, G., Laurent, B., Aimard, G. Sulfate and glucuronide conjugates of 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) in urine of depressed patients: Central and peripheral influences. J. Neural. Transm. 63, 255-269 (1985).
  49. Peyrin, L. Urinary MHPG sulfate as a marker of central norepinephrine metabolism: A commentary. J. Neural. Transm. 80, 51-65 (1990).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Catecholamine NeurotransmittersHigh Pressure Liquid ChromatographyElectrochemical DetectionSolid Phase ExtractionPacked Fiber Solid Phase ExtractionUrine Sample AnalysisNanofiber AdsorbentMonoamine MetabolitesInfant Urine TestingHPLC ECD System

Related Articles