Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena uszkodzeń DNA in vitro za pomocą testu komety

38.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56450

⸱

11 października 2017

 ,  , 
1Neuro-Oncology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 2Basic Medical Science Department, Zunyi Medical College-Zhuhai Campus

W tym artykule

Podsumowanie

Test komet jest skuteczną metodą wykrywania uszkodzeń DNA, w tym jedno- i dwuniciowych pęknięć DNA. Opisujemy alkaliczne i neutralne testy komet w celu zmierzenia uszkodzeń DNA w komórkach nowotworowych w celu oceny efektu terapeutycznego chemioterapii.

Streszczenie

Uszkodzenie DNA jest powszechnym zjawiskiem dla każdej komórki podczas jej życia i jest definiowane jako zmiana struktury chemicznej genomowego DNA. Terapie przeciwnowotworowe, takie jak radioterapia i chemioterapia, wprowadzają ogromne ilości dodatkowych uszkodzeń DNA, prowadząc do zatrzymania cyklu komórkowego i apoptozy w celu ograniczenia progresji raka. Ilościowa ocena uszkodzeń DNA podczas eksperymentalnej terapii przeciwnowotworowej jest kluczowym krokiem w celu uzasadnienia skuteczności czynnika genotoksycznego. W tym badaniu skupiamy się na teście elektroforezy jednokomórkowej, znanym również jako test kometowy, który może określić ilościowo pęknięcia jedno- i dwuniciowego DNA in vitro. Test komety to metoda kwantyfikacji uszkodzeń DNA, która jest wydajna i łatwa do wykonania, a także charakteryzuje się niskimi wymaganiami czasowymi/budżetowymi i wysoką odtwarzalnością. W tym miejscu podkreślamy przydatność testu kometarnego w badaniu przedklinicznym poprzez ocenę genotoksycznego wpływu terapii skojarzonej olaparyb/temozolomid na komórki glejaka U251.

Wprowadzenie

Test komet został po raz pierwszy opracowany przez Ostlinga i Johansona w 1984 roku, poprzez demonstrację migracji fragmentów DNA z jąder w warunkach neutralnych1. Technika ta została później opracowana przez Singha i wsp., wykazując, że warunki alkaliczne znacznie zwiększyły specyficzność i odtwarzalność testu2. Od tego czasu neutralny test kometarny jest najczęściej używany do wykrywania dwuniciowych pęknięć DNA, podczas gdy alkaliczny test komet jest bardziej czuły na mniejsze ilości uszkodzeń DNA, w tym pęknięcia jedno- i dwuniciowego DNA, miejsca alkaliczno-labilne, sieciowanie DNA-DNA lub DNA-białko oraz pęknięcia pojedynczej nici DNA związane z niekompletnymi miejscami naprawy wycięcia3,4. Oba testy umożliwiają wizualizację pofragmentowanego DNA i zapewniają prosty sposób ilościowej oceny uszkodzeń DNA. Test komet jest uważany za czułą metodę dla genetycznych badań toksykologicznych in vitro i in vivo i ma zastosowanie w różnych obszarach badawczych, takich jak wczesna selekcja kandydatów na leki, monitorowanie środowiska, biomonitoring człowieka oraz podstawowe badania nad uszkodzeniem i naprawą DNA5.

Zasada testu polega na tym, że pod wpływem pola elektrycznego, rozdrobnione DNA migruje z ciała nukleoidowego (znanego również jako "głowa komety") i tworzy plamę DNA w żelu agarozowym (znanym również jako "warkocz komety"). Dzięki barwieniu nukleotydami zakres uszkodzeń DNA można określić ilościowo, analizując "komety" utworzone przez elektroforezę pojedynczej komórki. Obliczanie momentu ogonowego może dodatkowo pomóc w porównaniu uszkodzeń DNA między różnymi grupami eksperymentalnymi. W porównaniu z tradycyjnymi metodami wykrywania uszkodzeń DNA, test komety jest bezpośredni, czuły, niedrogi i stosunkowo prosty.

Radioterapia i chemioterapia to powszechne strategie leczenia raka poprzez generowanie jedno- i dwuniciowych pęknięć DNA w chromosomach6. Niedawny postęp w dziedzinie inhibitorów naprawy DNA pozwala na bardziej skuteczne działanie genotoksyczne poprzez chemioterapię skojarzoną, a tym samym potencjalnie zmniejsza ogólnoustrojowe skutki uboczne, takie jak niedokrwistość, infekcje i supresja szpiku kostnego7,8. W tym badaniu pokazaliśmy badanie inhibitora polimerazy poli(ADP-rybozy) (PARP), olaparybu (Ola)9. PARP jest powszechnie występującym białkiem jądrowym i jest odpowiedzialny za naprawę przez wycinanie zasad DNA poprzez tworzenie polimeru poli (ADP-rybozy) 10. Temozolomid (TMZ) jest dostępnym doustnie środkiem alkilującym i jest szeroko stosowany w leczeniu pacjentów z glejakiem. Używając testu komety do ilościowego określenia uszkodzeń DNA, wykazaliśmy, że połączenie olaparybu z temozolomidem znacznie zwiększa uszkodzenia DNA w komórkach glejaka, co sugeruje, że terapia skojarzona olaparyb/temozolomid jest skuteczną strategią leczenia glejaka, w porównaniu z samym temozolomidem11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

  1. 1x PBS
    1. Rozcieńczyć 10 mL 10x PBS w 90 mL dH2O i dostosować pH do 7,4 za pomocą pH-metru. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  2. Roztwór do lizy (LS)
    1. Przygotować 2,5 M NaCl, 10 mM EDTA dwusodowego, 10 mM Tris base oraz 20 mM NaOH w 90 mL dH2O; zazwyczaj potrzeba około 20 min, aby mieszanina całkowicie się rozpuściła. Dostosować pH do 10 za pomocą pH-metru. Dodać 1% sarcosinianu sodu oraz 1% Triton X-10 i dopełnić końcową objętość do 1 0 mL. Chłodzić w temperaturze 4 °C przez co najmniej 30 min przed użyciem.
  3. Zasadowy roztwór do elektroforezy (AES), pH >13
    1. Przygotować 20 mM NaOH i 1 mM EDTA dwusodowego w 80 mL dH2O. Skorygować pH i upewnić się, że pH >13. Dopełnić końcową objętość do 1 0 mL. Przygotować świeżą porcję przed użyciem i chłodzić w temperaturze 4 °C przez co najmniej 30 min przed użyciem.
  4. Neutralny roztwór do elektroforezy (NES)
    1. Przygotować 1 0 mL neutralnego buforu do elektroforezy, mieszając 10 mM Tris base i 30 mM octanu sodu w 1 0 mL dH2O. Dostosować pH do 9,0 za pomocą octowego kwasu lodowatego. Chłodzić w temperaturze 4 °C przez co najmniej 30 min przed użyciem.
  5. Roztwór do precypitacji DNA (DPS)
    1. Przygotować 10 mL roztworu zapasowego 7,5 M octanu amonu. Aby uzyskać 50 mL roztworu do precypitacji DNA, zmieszać 6,7 mL 7,5 M octanu amonu z 43,3 mL 95% etanolu. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  6. Roztwór barwiący
    1. Dodać 1 µL 10 0x zielonego fluorescencyjnego barwnika do kwasów nukleinowych (np. SYBR Green) do 30 mL buforu Tris-EDTA (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA dwusodowego, pH 7,4) i przechowywać w temperaturze 4 °C. Chronić przed światłem.
  7. 1% agaroza niskotopliwa
    1. Roztopić 1% agarozę niskotopliwą (1 g w 10 mL dH2O) w mikrofalówce. Mieszać agarozę co 15-20 s, aby upewnić się, że jest całkowicie roztopiona. Umieścić agarozę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na co najmniej 20 min przed użyciem.
  8. Podgrzane końcówki do pipet
    1. Odciąć wąskie końce końcówek do pipet P20 o 3 mm i ogrzać w temperaturze 37 °C przed pipetowaniem agarozy.

2. Przygotowanie szkiełek do testu kometowego

  1. Powlekanie szkiełek
    1. Rozpuścić 1% agarozę (1 g w 10 mL dH2O) w mikrofalówce przez 2 - 3 min lub do całkowitego roztopienia agarozy. Zanurzyć szklane szkiełka mikroskopowe w agarozie i przetrzeć jedną stronę szkiełka za pomocą bezpyłowej chusteczki.
    2. Położyć szkiełka na płaskiej powierzchni do wyschnięcia na powietrzu lub podgrzać w temperaturze 50 °C w celu przyspieszenia suszenia; po wyschnięciu powinna utworzyć się przezroczysta warstwa agarozy. Przed użyciem umieścić powleczone szkiełka w temperaturze 37 °C.
  2. Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek
    1. Hodowla i przygotowanie komórek glejaka
      1. Hodować komórki U251 MG w pożywce DMEM-Ham F-12 uzupełnionej o 10% FBS, 100 U/mL penicyliny i 10 µg/mL streptomycyny w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.
      2. Przebrać komórki, stosując 1 mL trypsyny przez 3 min, a następnie zneutralizować trypsynę za pomocą pożywki DMEM-Ham F-12 z FBS. Zebrać komórki do probówki 15 mL, wirować przy 300 x g przez 4 min, odessać pożywkę i zawiesić komórki w stężeniu 2 x 105 komórek/mL w 1x PBS.
        UWAGA: Próbkę komórkową należy przygotować bezpośrednio przed rozpoczęciem analizy, a wszystkie próbki należy przechowywać i przetwarzać w ciemności lub przy przyciemnionym świetle, aby zapobiec uszkodzeniom DNA wywołanym przez światło.
      3. Połączyć zawiesinę komórkową z 1% roztopioną agarozą o niskiej temperaturze topnienia (w 37 °C) w stosunku 1:10 (v/v), delikatnie wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie niezwłocznie nanieść 30 µL na szkiełko. Użyć boku końcówki pipety do rozprowadzenia mieszaniny agarozy i komórek, aby zapewnić utworzenie cienkiej warstwy.
      4. Położyć szkiełko płasko w temperaturze 4 °C w ciemności przez 10 min. Wydłużenie czasu żelowania do 30 min poprawia przyleganie próbek w środowiskach o wysokiej wilgotności.
      5. Zanurzyć szkiełko w 4 °C LS w ciemności od 1 h do całej nocy.

3. Elektroforeza pojedynczych komórek

  1. Przejdź do analizy komet w warunkach zasadowych (krok 3.2) lub neutralnych (krok 3.3)
  2. Dla analizy komet w warunkach zasadowych
    1. Ostrożnie wyjmij preparaty z LS, odlej nadmiar buforu i delikatnie zanurz w AES na 1 h w temperaturze 4 °C, aby umożliwić rozwijanie DNA. Przechowuj preparaty w ciemności.
    2. Wlej schłodzony AES do kuwety elektroforetycznej, nie przekraczając poziomu 0,5 cm powyżej preparatów (zależy to od rozmiaru urządzenia do elektroforezy), umieść w niej preparaty i przykryj pokrywką. Ustaw napięcie zasilacza na 1 V/cm (odległość między elektrodami) i prowadź elektroforezę przez 30 min w temperaturze 4 °C.
    3. Odlej nadmiar roztworu elektroforetycznego z preparatów. Delikatnie zanurz preparaty dwukrotnie w dH2O na 5 min każdy w temperaturze pokojowej.
    4. Delikatnie zanurz preparaty w 70% etanolu na 5 min w temperaturze pokojowej. Przejdź do kroku 4.
  3. Dla analizy komet w warunkach neutralnych
    1. Ostrożnie wyjmij preparaty z LS, odlej nadmiar buforu i delikatnie zanurz w NES na 30 min w temperaturze 4 °C. Przechowuj preparaty w ciemności.
    2. Wlej schłodzony neutralny bufor elektroforetyczny do kuwety elektroforetycznej, nie przekraczając poziomu 0,5 cm powyżej preparatów (zależy to od rozmiaru urządzenia do elektroforezy), umieść w niej preparaty i przykryj pokrywką. Ustaw napięcie zasilacza na 1 V/cm (odległość między elektrodami) i prowadź elektroforezę przez 45 min w temperaturze 4 °C.
    3. Odlej nadmiar buforu z preparatów. Delikatnie zanurz preparaty w DPS na 30 min w temperaturze pokojowej.
    4. Delikatnie zanurz preparaty w 70% etanolu na 30 min w temperaturze pokojowej. Przejdź do kroku 4.

4. Barwienie preparatów Comet

  1. Suszyć preparaty w temperaturze 37 °C przez 10 - 15 min w ciemności.
  2. Nanieść 50 - 10 µL zielonego fluorescencyjnego roztworu do barwienia kwasów nukleinowych na każdy wysuszony żel agarozowy i barwić przez 15 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
  3. Krótko wypłukać preparaty w dH2O i całkowicie wysuszyć w temperaturze 37 °C w ciemności. Przejść do akwizycji obrazów i analizy.

5. Pozyskiwanie i analiza obrazów

UWAGA: Wizualizacja i kwantyfikacja pęknięć DNA opierają się na mikroskopii epifluorescencyjnej oraz oprogramowaniu do testu komet (patrz Tabela materiałów)12.

  1. Umieść preparaty na mikroskopie, używając uchwytu do szkiełek. Upewnij się, że żel agarozy jest skierowany w stronę obiektywu. Wykonaj losowe zdjęcia barwionych preparatów do testu komet, używając mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 10x. Unikaj krawędzi oraz obszarów wokół pęcherzyków powietrza.
  2. Należy upewnić się, że każdy ogon komety jest rozłożony poziomo. Glowy komet powinny znajdować się po lewej stronie, a ogony po prawej.
  3. Zapisz każdy obraz w binarnym formacie TIF z jasnym barwieniem DNA i ciemnym tłem. Wczytaj obrazy do oprogramowania, korzystając z przycisku „Select files to analyze” (Wybierz pliki do analizy), który znajduje się po lewej stronie paska narzędzi. Powinno pojawić się okno podglądu obrazu (Rycina 1).
  4. Narysuj na ekranie ramkę pomiarową i dostosuj jej rozmiar do komety komórkowej. Kliknij przycisk „Adjust”, aby ustawić próg dla głowy, komety i ogona zgodnie z obrazem, a następnie kliknij przycisk „Start measurements” (Rysunek 1).
  5. Wybierz komórkę za pomocą ramki i uruchom pomiar, klikając myszą przycisk „Assay the comet”; w oknie „profiles” pojawi się obraz intensywności z wybranymi parametrami pomiaru. Wyniki można zapisać, klikając przycisk „store result” (Rysunek 1).
    UWAGA: Oprogramowanie oblicza parametry, w tym długość ogona komety, procent DNA w ogonie oraz moment ogona (TM) i moment ogona Olive'a (OTM). Moment ogona oblicza się według następujących wzorów:
    Wzór na obliczanie Tm; analiza uszkodzeń DNA; równanie.
    Równanie OTM do oceny uszkodzeń DNA; wzór przedstawia Tail.mean minus Head.mean podzielone przez 10.
  6. Przeanalizuj co najmniej 50 komórek dla każdej grupy badawczej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje krok po kroku przebieg analizy w metodzie kometowej oraz analizy danych (Rysunek 1). Wyniki alkalicznego i neutralnego testu kometowego wykazały, że ogon komety w komórkach U251 traktowanych doksorubicyną (1 µM, 20 h) był dłuższy i charakteryzował się wyższą intensywnością DNA, co sugeruje znaczną akumulację pofragmentowanego DNA w wyniku chemioterapii (Rysunek 2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Test kometarny jest skutecznym narzędziem do pomiaru pęknięć jedno- i dwuniciowego DNA na poziomie komórkowym. Test ten jest szeroko stosowany jako "złoty standard" w badaniach dotyczących genotoksyczności i biomonitoringu13, począwszy od zmian podstawowych, wiązań krzyżowych DNA, opracowywania leków i miejsc wrażliwych na zasady. W niniejszym badaniu pokazaliśmy dwa odrębne protokoły krok po kroku odpowiednio dla alkalicznych i neutralnych testów komet. Łącząc elektroforezę jednokomórkową, mikros...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Intramural Research Program NIH, NCI i CCR. Wszyscy autorzy otrzymali Intramural Research Grant od NIH, NCI i CCR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reodczynniki
10x PBS(Ca++, Mg++ wolny)TEKnovaP0196
NaClSigmaS5886
EDTATEKnovaE0308
Baza TrizmaSigmaT1503
NaOHSigma72068
Lauryl sarkozynian soduSigmaL7414
Triton X-100Sigma93443
Octan soduSigma32318
Lodowaty kwas octowySigma695092
Octan amonuSigmaA1542
SYBR ZielonyInvitrogenS33102
Niski temperatura topnienia agarozyInvitrogen16520
AgarozaInvitrogen16500
95% etanolWARNER-GRAHAM#64-17-5
TrypsynaGIBICO25300-054
NazwaCompanyNumer katalogowyComments
Materiały eksploatacyjne
Szkiełka bibułkoweMIKROSKOPIA ELEKTRONOWA NAUKI63422-11
Chusteczki KimwipesKIMberly-Clark
1,5 ml MikrowirówkiDENVILLE
Końcówki do pipetSHARP
strong>NazwaFirma<strong>Numer katalogowyKomentarze
Wyposażenia
MicrowaveAvanti
WaterbathPRECISION
Pozioma komora do elektroforezyTREVIGENCometassay ES II
ZasilanieBio-Rad
Quincy LabModel 12-140E
Mikroskop fluorescencyjnyZeissLSM700
MikropipetEppendorf
< Inkubator

Bibliografia

  1. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
  2. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
  3. Tice, R. R., et al. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).
  4. Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays. Indian J Exp Biol. 54 (8), 502-508 (2016).
  5. Azqueta, A., Collins, A. R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair. Arch Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).
  6. Goldstein, M., Kastan, M. B. The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy. Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).
  7. Gavande, N. S., et al. DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment? Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).
  8. Torgovnick, A., Schumacher, B. DNA repair mechanisms in cancer development and therapy. Front Genet. 6, 157(2015).
  9. Weston, V. J., et al. The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo. Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).
  10. Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors. Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).
  11. Lu, Y., et al. Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair. Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).
  12. Konca, K., et al. A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay. Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).
  13. Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).
  14. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  15. Karbaschi, M., Cooke, M. S. Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay. Sci Rep. 4, 7200(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Elektroforeza pojedynczych komórekkomet alkalicznakomet neutralnakomórki glejaka U251olaparibtemozolomidmikroskopia fluorescencyjnaanaliza obrazupowlekanie slajdków agarozą
Ocena uszkodzeń DNA in vitro za pomocą testu komety
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.