Ocena uszkodzeń DNA in vitro za pomocą testu komety

Summary

Test komet jest skuteczną metodą wykrywania uszkodzeń DNA, w tym jedno- i dwuniciowych pęknięć DNA. Opisujemy alkaliczne i neutralne testy komet w celu zmierzenia uszkodzeń DNA w komórkach nowotworowych w celu oceny efektu terapeutycznego chemioterapii.

Abstract

Uszkodzenie DNA jest powszechnym zjawiskiem dla każdej komórki podczas jej życia i jest definiowane jako zmiana struktury chemicznej genomowego DNA. Terapie przeciwnowotworowe, takie jak radioterapia i chemioterapia, wprowadzają ogromne ilości dodatkowych uszkodzeń DNA, prowadząc do zatrzymania cyklu komórkowego i apoptozy w celu ograniczenia progresji raka. Ilościowa ocena uszkodzeń DNA podczas eksperymentalnej terapii przeciwnowotworowej jest kluczowym krokiem w celu uzasadnienia skuteczności czynnika genotoksycznego. W tym badaniu skupiamy się na teście elektroforezy jednokomórkowej, znanym również jako test kometowy, który może określić ilościowo pęknięcia jedno- i dwuniciowego DNA in vitro. Test komety to metoda kwantyfikacji uszkodzeń DNA, która jest wydajna i łatwa do wykonania, a także charakteryzuje się niskimi wymaganiami czasowymi/budżetowymi i wysoką odtwarzalnością. W tym miejscu podkreślamy przydatność testu kometarnego w badaniu przedklinicznym poprzez ocenę genotoksycznego wpływu terapii skojarzonej olaparyb/temozolomid na komórki glejaka U251.

Introduction

Test komet został po raz pierwszy opracowany przez Ostlinga i Johansona w 1984 roku, poprzez demonstrację migracji fragmentów DNA z jąder w warunkach neutralnych¹. Technika ta została później opracowana przez Singha i wsp., wykazując, że warunki alkaliczne znacznie zwiększyły specyficzność i odtwarzalność testu². Od tego czasu neutralny test kometarny jest najczęściej używany do wykrywania dwuniciowych pęknięć DNA, podczas gdy alkaliczny test komet jest bardziej czuły na mniejsze ilości uszkodzeń DNA, w tym pęknięcia jedno- i dwuniciowego DNA, miejsca alkaliczno-labilne, sieciowanie DNA-DNA lub DNA-białko oraz pęknięcia pojedynczej nici DNA związane z niekompletnymi miejscami naprawy wycięcia^3,4. Oba testy umożliwiają wizualizację pofragmentowanego DNA i zapewniają prosty sposób ilościowej oceny uszkodzeń DNA. Test komet jest uważany za czułą metodę dla genetycznych badań toksykologicznych in vitro i in vivo i ma zastosowanie w różnych obszarach badawczych, takich jak wczesna selekcja kandydatów na leki, monitorowanie środowiska, biomonitoring człowieka oraz podstawowe badania nad uszkodzeniem i naprawą DNA⁵.

Zasada testu polega na tym, że pod wpływem pola elektrycznego, rozdrobnione DNA migruje z ciała nukleoidowego (znanego również jako "głowa komety") i tworzy plamę DNA w żelu agarozowym (znanym również jako "warkocz komety"). Dzięki barwieniu nukleotydami zakres uszkodzeń DNA można określić ilościowo, analizując "komety" utworzone przez elektroforezę pojedynczej komórki. Obliczanie momentu ogonowego może dodatkowo pomóc w porównaniu uszkodzeń DNA między różnymi grupami eksperymentalnymi. W porównaniu z tradycyjnymi metodami wykrywania uszkodzeń DNA, test komety jest bezpośredni, czuły, niedrogi i stosunkowo prosty.

Radioterapia i chemioterapia to powszechne strategie leczenia raka poprzez generowanie jedno- i dwuniciowych pęknięć DNA w chromosomach⁶. Niedawny postęp w dziedzinie inhibitorów naprawy DNA pozwala na bardziej skuteczne działanie genotoksyczne poprzez chemioterapię skojarzoną, a tym samym potencjalnie zmniejsza ogólnoustrojowe skutki uboczne, takie jak niedokrwistość, infekcje i supresja szpiku kostnego^7,8. W tym badaniu pokazaliśmy badanie inhibitora polimerazy poli(ADP-rybozy) (PARP), olaparybu (Ola)⁹. PARP jest powszechnie występującym białkiem jądrowym i jest odpowiedzialny za naprawę przez wycinanie zasad DNA poprzez tworzenie polimeru poli (ADP-rybozy) ¹⁰. Temozolomid (TMZ) jest dostępnym doustnie środkiem alkilującym i jest szeroko stosowany w leczeniu pacjentów z glejakiem. Używając testu komety do ilościowego określenia uszkodzeń DNA, wykazaliśmy, że połączenie olaparybu z temozolomidem znacznie zwiększa uszkodzenia DNA w komórkach glejaka, co sugeruje, że terapia skojarzona olaparyb/temozolomid jest skuteczną strategią leczenia glejaka, w porównaniu z samym temozolomidem¹¹.

Protocol

1. Przygotuj odczynniki

1. 1x PBS (Biblioteka PBS)
   1. Rozcieńczyć 100 ml 10x PBS 900 ml dH₂O i dostosować pH do 7,4 za pomocą pH-metru. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Roztwór do lizy (LS)
   1. Przygotować 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA disodowego, 10 mM zasady Tris i 200 mM NaOH w 900 ml dH₂O; zwykle potrzeba około 20 minut, aby mieszanina całkowicie się rozpuściła. Dostosuj pH do 10 za pomocą pH-metru. Dodać 1% laurylu sodu i 1% Triton X-100 i dostosować końcową objętość do 1 000 ml. Schłodzić do 4 °C przez co najmniej 30 minut przed użyciem.
3. Alkaliczny roztwór do elektroforezy (AES), pH >13
   1. Przygotować 200 mM NaOH i 1 mM EDTA disodowego w 800 ml dH₂O. Dostosuj pH i upewnij się, że wynosi pH >13. Dostosuj końcową objętość do 1,000 ml. Przygotować świeże przed użyciem i schłodzić do 4 °C przez co najmniej 30 minut przed użyciem.
4. Neutralne rozwiązanie elektroforetyczne (NWW)
   1. Przygotować 1 000 ml obojętnego buforu do elektroforezy, mieszając 100 mM zasady Tris i 300 mM octanu sodu z 1000 ml dH₂O. Dostosować pH do 9,0 za pomocą lodowatego kwasu octowego. Schłodzić do 4 °C przez co najmniej 30 minut przed użyciem.
5. Roztwór do wytrącania DNA (DPS)
   1. Przygotowanie 10 ml 7,5 M octanu amonu. Na 50 ml roztworu do wytrącania DNA zmieszaj 6,7 ml 7,5 M octanu amonu z 43,3 ml 95% etanolu. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
6. Roztwór do barwienia
   1. Dodać 1 μl 10 000x zielony fluorescencyjny barwnik kwasu nukleinowego (np. SYBR Green) w 30 ml buforu Tris-EDTA (10 mM Tris-HCl, 1 mM disodowego EDTA, pH 7,4) i przechowywać w temperaturze 4 °C. Chronić przed światłem.
7. 1% agarozy niskotopliwej
   1. Rozpuść 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (1 g w 100 ml dH₂O) w kuchence mikrofalowej. Obracaj agarozę co 15-20 s, aby upewnić się, że agaroza jest całkowicie stopiona. Umieścić agarozę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na co najmniej 20 minut przed użyciem.
8. Wstępnie ciepłe końcówki do pipet
   1. Odciąć wąskie końce końcówek pipet P200 o 3 mm i ogrzać w temperaturze 37 °C przed pipetowaniem agarozy.

2. Przygotuj slajdy komety

1. Powłoka ślizgowa
   1. Rozpuść 1% agarozy (1 g w 100 ml dH₂O) w kuchence mikrofalowej przez 2 - 3 minuty lub do momentu, gdy agaroza całkowicie się stopi. Zanurz szklane szkiełka mikroskopowe w agarozie i wytrzyj jedną stronę szkiełka za pomocą niestrzępiącej się chusteczki.
   2. Połóż szkiełka na płaskiej powierzchni do wyschnięcia na powietrzu lub podgrzania w temperaturze 50 °C w celu szybszego wyschnięcia; po wyschnięciu powinien powstać przezroczysty film agarozowy. Przed użyciem umieścić powlekane szkiełka w temperaturze 37 °C.
2. Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych
   1. Hodowla i leczenie komórki glejaka
      1. Hoduj komórki U251 MG w pożywce DMEM-Ham F-12 uzupełnionej 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 10 μg/ml streptomycyny w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
      2. Trawić komórki za pomocą 1 ml trypsyny przez 3 minuty i neutralizować trypsynę za pomocą pożywki DMEM-Ham F-12 z FBS. Zebrać do probówki o pojemności 15 ml, wirować w temperaturze 300 x g przez 4 minuty, odessać pożywkę i zawiesić komórki w temperaturze 2 x 10⁵ komórek/ml w 1x PBS.
         UWAGA: Próbka komórek powinna być przygotowana bezpośrednio przed rozpoczęciem testu, a wszystkie próbki powinny być obsługiwane w ciemnym lub przyciemnionym środowisku, aby zapobiec uszkodzeniom DNA przez światło.
      3. Połączyć zawiesinę komórek z 1% stopioną agarozą o niskiej temperaturze topnienia (w temperaturze 37 °C) w stosunku 1:10 (v/v), delikatnie wymieszać pipetując w górę i w dół i natychmiast odpipetować 30 μl na szkiełko. Użyj boku końcówki pipety, aby rozprowadzić mieszaninę agarozy i komórek, aby zapewnić utworzenie cienkiej warstwy.
      4. Umieścić szkiełko płasko w temperaturze 4 °C w ciemności na 10 minut. Wydłużenie czasu żelowania do 30 minut poprawia przyleganie próbek w środowisku o wysokiej wilgotności.
      5. Zanurz zjeżdżalnię w temperaturze 4 °C LS w ciemności na 1 godzinę do nocy.

3. Elektroforeza jednokomórkowa

1. Przejdź do alkalicznego (krok 3.2) lub neutralnego (krok 3.3) testu komety
2. Do alkalicznego testu kometa
   1. Delikatnie wyjmij szkiełka z LS, opróżnij nadmiar buforu i delikatnie zanurz w AES na 1 godzinę w temperaturze 4 °C, aby umożliwić rozwinięcie DNA. Trzymaj slajdy w ciemności.
   2. Dodaj wstępnie schłodzony AES do tacki na szkiełka do elektroforezy, nie przekraczaj 0,5 cm nad szkiełkami (zależy to od wielkości jednostek do elektroforezy), umieść szkiełka w środku i przykryj nakrętką. Ustaw napięcie zasilania na 1 V/cm (długość między elektrodami) i pracuj przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
   3. Spuść nadmiar roztworu elektroforetycznego ze szkiełka. Delikatnie zanurz szkiełka dwukrotnie w dH₂O na 5 minut każde w temperaturze pokojowej.
   4. Delikatnie zanurz szkiełka w 70% etanolu na 5 minut w temperaturze pokojowej. Przejdź do kroku 4.
3. Do neutralnego testu komety
   1. Delikatnie wyjmij szkiełka z LS, opróżnij nadmiar bufora i delikatnie zanurz w NES na 30 minut w temperaturze 4 °C. Trzymaj slajd w ciemności.
   2. Dodaj wstępnie schłodzony neutralny bufor do elektroforezy do tacki na szkiełka do elektroforezy, nie przekraczaj 0,5 cm powyżej szkiełek (zależy to od wielkości jednostek do elektroforezy), umieść szkiełka w środku i przykryj nakrętką. Ustaw napięcie zasilania na 1 V/cm (długość między elektrodami) i pracuj przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
   3. Spuść nadmiar bufora ze szkiełek. Delikatnie zanurz szkiełka w DPS na 30 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Delikatnie zanurz szkiełka w 70% etanolu na 30 minut w temperaturze pokojowej. Przejdź do kroku 4.

4. Plamy Szkiełka komety

1. Suszyć szkiełka w temperaturze 37 °C przez 10 - 15 minut w ciemności.
2. Umieść 50 - 100 μl zielonego fluorescencyjnego roztworu do barwienia kwasów nukleinowych na każdej wysuszonej agarozie i barwić przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
3. Szkiełka należy krótko przepłukać w temperaturze_{dH 2}O i całkowicie wysuszyć w temperaturze 37 °C w ciemności. Przejdź do akwizycji i analizy obrazu.

5. Akwizycja i analiza obrazu

UWAGA: Wizualizacja i kwantyfikacja pęknięć DNA opiera się na mikroskopii epifluorescencyjnej i oprogramowaniu do testowania komet (patrz Tabela Materiałów)¹².

1. Umieść szkiełka podstawowe na mikroskopie z uchwytem na szkiełka. Upewnij się, że żel agarozowy jest skierowany w stronę soczewki obiektywu. Losowo rejestruj obrazy z poplamionych szkiełek kometarnych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z soczewką obiektywową 10x. Unikaj krawędzi i obszarów wokół pęcherzyków powietrza.
2. Upewnij się, że każdy warkocz komety jest rozłożony poziomo. Głowy komety powinny zaczynać się z lewej strony, a ogon z prawej.
3. Zapisz każde zdjęcie w binarnym formacie TIF z jasnym barwnikiem DNA i ciemnym tłem. Załaduj obrazy do oprogramowania za pomocą przycisku "Wybierz pliki do analizy", który znajduje się po lewej stronie paska narzędzi. Powinno pojawić się okno widoku obrazu (Rysunek 1).
4. Narysuj ramkę pomiarową na ekranie i dostosuj jej rozmiar zgodnie z kometą komórki. Kliknij przycisk "Dostosuj", aby ustawić próg głowy, komety i ogona zgodnie z obrazem, a następnie kliknij przycisk "Rozpocznij pomiary" (Rysunek 1).
5. Wybierz komórkę za pomocą ramki i aktywuj pomiar, klikając myszką na przycisk "Oznacz kometę"; w oknie "profile" pojawi się obraz intensywności z wybranymi parametrami pomiaru. Wyniki można zapisać, klikając przycisk "zapisz wynik" (Rysunek 1).
   UWAGA: Oprogramowanie oblicza parametry, w tym długość warkocza komety, procentowy udział DNA ogona, moment warkocza (TM) i moment warkocza Olive (OTM). Momenty końcowe oblicza się według następujących wzorów:
   
   
6. Przeanalizuj co najmniej 50 komórek na zabieg.

Results

Obecny protokół opisuje krok po kroku proces przeprowadzania testu komety i analizy danych (Rysunek 1). Wyniki testów alkalicznych i neutralnych komet wykazały, że warkocz komety komórek U251 traktowanych doksorubicyną (1 μM, 20 h) był dłuższy i miał większą intensywność DNA, co sugeruje znaczną akumulację fragmentarycznego DNA w wyniku chemioterapii (Ryc. 2).

Analiza ilo...

Discussion

Test kometarny jest skutecznym narzędziem do pomiaru pęknięć jedno- i dwuniciowego DNA na poziomie komórkowym. Test ten jest szeroko stosowany jako "złoty standard" w badaniach dotyczących genotoksyczności i biomonitoringu¹³, począwszy od zmian podstawowych, wiązań krzyżowych DNA, opracowywania leków i miejsc wrażliwych na zasady. W niniejszym badaniu pokazaliśmy dwa odrębne protokoły krok po kroku odpowiednio dla alkalicznych i neutralnych testów komet. Łącząc elektroforezę jednokomórkową, mikros...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reodczynniki
10x PBS(Ca++, Mg++ wolny)	TEKnova	P0196
NaCl	Sigma	S5886
EDTA	TEKnova	E0308
Baza Trizma	Sigma	T1503
NaOH	Sigma	72068
Lauryl sarkozynian sodu	Sigma	L7414
Triton X-100	Sigma	93443
Octan sodu	Sigma	32318
Lodowaty kwas octowy	Sigma	695092
Octan amonu	Sigma	A1542
SYBR Zielony	Invitrogen	S33102
Niski temperatura topnienia agarozy	Invitrogen	16520
Agaroza	Invitrogen	16500
95% etanol	WARNER-GRAHAM	#64-17-5
Trypsyna	GIBICO	25300-054
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Comments
Materiały eksploatacyjne
Szkiełka bibułkowe	MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA NAUKI	63422-11
Chusteczki Kimwipes	KIMberly-Clark
1,5 ml Mikrowirówki	DENVILLE
Końcówki do pipet	SHARP
strong>Nazwa	Firma<	strong>Numer katalogowy	Komentarze
Wyposażenia
Microwave	Avanti
Waterbath	PRECISION
Pozioma komora do elektroforezy	TREVIGEN	Cometassay ES II
Zasilanie	Bio-Rad
	Quincy Lab	Model 12-140E
Mikroskop fluorescencyjny	Zeiss	LSM700
Mikropipet	Eppendorf