Artykuł metodologiczny

Proste podejście do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu u myszy C57BL/6 w celu oceny funkcjonalnej i neuropatologicznej

9.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56455

⸱

9 listopada 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neuroscience, School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, The University of Melbourne

W tym artykule

Podsumowanie

Ten raport przedstawia proste podejście do skutecznego wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu (EAN) przy użyciu peptydu białka mieliny zero (P0)180-199 w połączeniu z kompletnym adiuwantem Freunda i toksyną krztuścową. Przedstawiamy wyrafinowany paradygmat zdolny do dokładnej oceny zakresu deficytów funkcjonalnych i neuropatologii, które występują w tym EAN.

Streszczenie

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie nerwów (EAN) jest dobrze cenionym eksperymentalnym modelem autoimmunologicznych obwodowych chorób demielinizacyjnych. Choroba EAN jest wywoływana przez uodparnienie myszy peptydami neurogennymi w celu skierowania ataku zapalnego w kierunku składników obwodowego układu nerwowego (PNS). Ostatnie postępy umożliwiły indukcję EAN w stosunkowo opornej linii myszy C57BL/6 przy użyciu peptydów białka mieliny zero (P0)106-125 lub P0180-199 podawanych w adiuwantach w połączeniu z wstrzyknięciem toksyny krztuścowej. Zdolność do indukcji EAN w szczepie C57BL/6 pozwala na wykorzystanie licznych narzędzi genetycznych, które istnieją na tym myszym tle, a tym samym umożliwia zaawansowane badanie patogenezy choroby i badanie mechanistycznego działania nowych terapii w połączeniu z podejściami transgenicznymi. W tym badaniu pokazujemy proste podejście do skutecznej indukcji EAN za pomocą peptydu P0180-199 u myszy C57BL / 6. Przedstawiono również protokół oceny deficytów funkcjonalnych występujących w tym modelu, którym towarzyszy szereg cech neuropatologicznych. W związku z tym model ten jest potężnym modelem eksperymentalnym do badania patogenezy ludzkich obwodowych neuropatii demielinizacyjnych oraz do określenia skuteczności potencjalnych terapii, które mają na celu promowanie naprawy mieliny i ochronę przed uszkodzeniem nerwów w autoimmunologicznym zapaleniu nerwów.

Wprowadzenie

Neuropatie obwodowe mogą być albo pochodzenia genetycznego, albo nabyte, przy czym neuropatie nabyte mają albo metaboliczne, niedokrwienne, zapalne albo toksyczne substancje. Choroby te są również z pożytkiem klasyfikowane jako pochodzenia aksonalnego lub demielinicznego. Najczęstszymi nabytymi demielinizacyjnymi neuropatiami obwodowymi są ostra zapalna polineuropatia demielinizacyjna (AIDP, znana również jako zespół Guillaina-Barrégo, GBS) i przewlekła zapalna polineuropatia demielinizacyjna (CIDP)1,2,3,4; Oba charakteryzują się patogenetycznie reakcją autoimmunologiczną skierowaną przeciwko osłonce mielinowej, powodującą demielinizację nerwów obwodowych. W tych chorobach aktywowane limfocyty T przenikają przez barierę nerwową krwi i generują reakcję immunologiczną w PNS. Aktywacja makrofagów w nerwie powoduje następnie demielinizację albo bezpośrednio poprzez atak fagocytarny, albo pośrednio przez wydzielane mediatory stanu zapalnego, co skutkuje niepełnosprawnością kliniczną, taką jak paraliż i dysfunkcja czuciowa5. Podczas gdy demielinizowane aksony zachowują zdolność do remielinizacji po demielinizacji, remielinizacja jest często opóźniona lub niepełna, co powoduje podatność nagich aksonów na nieodwracalne uszkodzenia, co jest główną przyczyną trwałej niepełnosprawności klinicznej. Obecnie najskuteczniejsze terapie są immunomodulujące, ale pomimo ich skuteczności, w wielu przypadkach powrót do zdrowia jest często powolny i ~25% pacjentów doświadczy resztkowych deficytów funkcjonalnych, które znacznie obniżą jakość ich życia6,7.

EAN jest powszechnie używanym zwierzęcym modelem demielinizacyjnej neuropatii obwodowej, który dostarczył cennych informacji na temat patogenezy i umożliwił ocenę nowych środków terapeutycznych4. Model ten może być indukowany u różnych gatunków, takich jak króliki, szczury, myszy i świnki morskie, i jest indukowany przez immunizację antygenami neurogennymi. Jednak ostatecznie udana indukcja EAN zależy od odpowiedniej odpowiedzi immunologicznej, aby choroba mogła wystąpić. Biorąc pod uwagę różnice gatunkowe (i międzygatunkowe/szczepowe) w funkcjonowaniu układu odpornościowego, opracowano wiele kombinacji antygenów i adiuwantów, aby skutecznie indukować EAN. Jeśli chodzi o mysie narzędzia genetyczne, C57BL/6 jest najczęściej stosowany; jednak tradycyjny peptyd białka P2 57-81 (P257-81), który powoduje chorobę u podatnego szczepu myszy SJL 8, nie jest w stanie zalegalizować patogenezy prowadzącej do deficytów funkcjonalnych w szczepie C57BL/6. Na szczęście paradygmaty uwrażliwiające wykorzystujące peptydy P0106-125 lub P0180-199, dostarczane w adiuwantach w połączeniu z wstrzyknięciem toksyny krztuścowej, mogą pokonać tę barierę, umożliwiając wykorzystanie wyrafinowanych narzędzi genetycznych w mysim modelu EAN.

Tutaj prezentowana jest prosta metoda indukcji EAN u myszy C57BL/6. Ponadto zapewniono kompleksowe szczegółowe podejście, za pomocą którego można ocenić deficyty funkcjonalne i neuropatologiczne związane z chorobą. Peptide9 peptide180-199 został wybrany zamiast alternatywy P057-8110. Model P0180-199 został opisany jako powodujący łagodniejsze objawy kliniczne w porównaniu z alternatywą P057-8110, a zatem prawdopodobnie wytrzyma wprowadzenie potencjalnie szkodliwych zaburzeń genetycznych, wyzdrowieje po zabiegach chirurgicznych (takich jak implantacja pompy osmotycznej) i jest podatny na testy funkcji chodu na bieżni4. Jednak opisane tutaj testy funkcjonalne chodu na bieżni i protokoły histologiczne można łatwo zastosować podczas badania choroby w wariancie indukowanym przez P057-81.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Florey Institute for Neuroscience and Mental Health (Melbourne Brain Centre) i są zgodne z Australijskim Kodeksem Postępowania w Wykorzystywaniu Zwierząt do Celów Naukowych.

1. Indukcja EAN

UWAGA: EAN może być skutecznie indukowany u samców myszy C57BL/6 w wieku od 6 do 8 tygodni. Protokół indukcji trwa łącznie 9 dni. Dzień 0 odnosi się do dnia pierwszego szczepienia. W przypadku tego protokołu zastrzyki przeprowadzano w znieczuleniu (patrz krok 1.1.2 poniżej).

  1. W dniu -1:
    1. Przygotować roztwór toksyny krztuścowej (patrz tabela materiałów) o stężeniu 1,6 μg/ml, używając sterylnego 0,1 M roztworu soli fizjologicznej buforowanej izotonicznym fosforanem myszy (MT-PBS).
    2. Znieczulenie izofluranem:
      1. Umieść mysz (C57BL/6, samiec, 6-8 tygodni) w komorze anestezjologicznej i dostosuj przepływ tlenu do 1 l/min.
      2. Włącz parownik izofluranowy, ustaw go na 2,5% w celu znieczulenia, monitoruj oddech i poczekaj 2 minuty lub do momentu, gdy odruchy pierwotne (rogówka i kończyna tylna) przestaną reagować
    3. Wyjmij mysz z komory anestezjologicznej i podaj 250 μl powyższego roztworu toksyny krztuścowej we wstrzyknięciu dootrzewnowym (i.p.) za pomocą strzykawki 0,5 ml z igłą 301/2 G.
    4. Przygotować inokulum do wstrzykiwań do immunizacji:
      1. Przygotować roztwór A, używając 2 mg/ml roztworu peptydu P0180-199 (o czystości > 98%, sekwencja S-S-K-R-G-R- Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) w 0,9% soli fizjologicznej.
      2. Przygotować roztwór B, używając 20 mg/ml roztworu Mycobacterium tuberculosis (patrz tabela materiałów) w kompletnym adiuwantzie Freunda (FCA, zawierającym: 15% monoolanu mannidu + 85% oleju parafinowego i 0,5 mg/ml wysuszonego zabitego i wysuszonego M Mycobacterium butyricum).
      3. Aby przygotować końcowe inokulum do wstrzykiwań, należy połączyć równe objętościowo części roztworów A i B w ubijaku do kulek i mieszać je z maksymalną prędkością przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
        UWAGA: Roztwory A i B mogą być przechowywane w stanie wywaru i w temperaturze 4 °C przez maksymalnie jeden miesiąc, ale połączone inokulum końcowe musi być świeżo przygotowane w dniu wstrzyknięcia myszy.
  2. W dniu 0 należy podać 50 μl inokulum (preparat opisany w kroku 1.1.4) myszowi poprzez wstrzyknięcie podskórne za pomocą igły 23 G.
    UWAGA: Wstrzyknięcie można umieścić między łopatkami lub między kończyną tylną a ogonem nad grzbietem ogonowym.
  3. W dniu 1 przygotuj roztwór toksyny krztuścowej o stężeniu 1,2 μg/ml (w MT-PBS) i podaj 250 μl myszy za pomocą iniekcji dożylnej za pomocą strzykawki 0,5 ml z igłą 301/2 G.
  4. W dniu 3 powtórz krok 1.3 powyżej.
    UWAGA: Roztwory podstawowe A i B mogą być sporządzane i przechowywane w temperaturze 4 °C maksymalnie przez jeden miesiąc. Jednakże końcowe inokulum do wstrzykiwań, wytworzone przez połączenie roztworów podstawowych A i B, musi być wykonane w dniu wstrzyknięcia.
  5. W dniu 8 należy podać 50 μl inokulum (preparat opisany w kroku 1.1.4) myszowi poprzez wstrzyknięcie podskórne (patrz krok 1.2 powyżej), w to samo miejsce wstrzyknięcia, co w kroku 1.2 (dla każdego zwierzęcia)

2. Punktacja kliniczna

  1. Wykonuj ocenę kliniczną codziennie, począwszy od dnia 0.
  2. Przyznaj każdej myszy wynik 0, 1, 2, 3 lub 4 zgodnie z opublikowanymi kryteriami4. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z oceną kliniczną EAN.
    UWAGA: Aby zachować spójność, należy dołożyć starań, aby ten sam badacz codziennie oceniał myszy o tej samej porze.

3. Ocena funkcji motorycznych

UWAGA: Sprawność motoryczna jest oceniana równolegle z punktacją kliniczną dla tej samej kohorty zwierząt. Aparatura do oceny funkcji motorycznych musi być podłączona do komputera, który ma zainstalowany system obrazowania funkcji chodu (patrz tabela materiałów). Zaleca się również, aby wszystkie myszy, które mają być oceniane, były przyzwyczajone do zadania biegowego przed indukcją EAN. W tym celu przeprowadza się ćwiczenia (2 testy na mysz) na trzy dni przed indukcją choroby (dzień -3).

  1. Włączyć aparaturę do oceny funkcji motorycznych i włączyć przycisk światła.
  2. Mocno chrap mysz i posmaruj jej stopy, opuszczając ją na pojemnik wypełniony czerwonym atramentem, trzymając ją za ogon.
    UWAGA: Ten krok jest wymagany w przypadku szczepu C57BL/6, ale można go pominąć, jeśli używana jest odmiana myszy o białym kolorze sierści.
  3. Umieść mysz w komorze do chodzenia i ustaw prędkość bieżni na 15 cm/s.
  4. Włącz bieżnię i kliknij przycisk "nagraj", aby uchwycić ruch biegowy myszy za pomocą systemu obrazowania funkcji chodu (patrz Tabela materiałów).
  5. Użyj timera i mierz każdy bieg przez 36 sekund. Po 36 s przerwij nagrywanie i zatrzymaj bieżnię.
    UWAGA: Myszy, które nie mogą pomyślnie ukończyć uruchomionego zadania w tym 36-sekundowym interwale, są uważane za nieudane.
  6. Zapisz plik wideo w wyznaczonym folderze.
  7. Powtórz powyższe kroki dla każdej myszy, która ma zostać oceniona. Testuj myszy z tym samym uruchomionym zadaniem co 3 dni.
  8. Przeanalizuj edytowane pliki wideo za pomocą oprogramowania do pomiaru parametrów funkcji chodu (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Szczegóły dotyczące analizy różnych parametrów silnika różnią się w zależności od oprogramowania, dlatego przed analizą należy zapoznać się z instrukcją producenta. Aby uzyskać histologiczne dowody uszkodzenia aksonów i mieliny za pomocą immunohistochemii lub mikroskopii elektronowej, tkanki zwierzęce mogą być pobierane na dowolnym etapie oceny funkcji pomotorycznej, w zależności od konkretnych celów badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

P0180-199 indukowana peptydowo neuropatia rzekomoparalityczna (EAN) u myszy C57BL/6 prowadzi do monofazowego przebiegu choroby, w której objawy kliniczne pojawiają się od 6. dnia po pierwszej immunizacji (dpi), a maksymalne nasilenie punktacji klinicznej obserwuje się od 25. dpi, po czym następuje pewna poprawa stanu klinicznego od 40. dpi (Rysunek 1)4,9Pod względem funkcji chodu myszy zacz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym raporcie przedstawiono prostą metodę indukcji EAN przy użyciu peptydu P0180-199 u myszy C57BL/6, umożliwiając ilościowe określenie kluczowych deficytów neuropatologicznych i funkcjonalnych u myszy indukowanych EAN. Odmienną cechą opisanego tutaj protokołu indukcji EAN jest stosowanie znieczulenia podczas wykonywania zastrzyków uodparniających. Zastosowanie znieczulenia izofluranem znacznie zwiększa zdolność do zapewnienia, że całkowita objętość inokulum zostanie wstrzyknięta podskórnie w pożądane ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów w związku z tą pracą.

Podziękowania

DGG jest stypendystą NHMRC Petera Doherty'ego i Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA) Early Career Fellow. JLF jest wspierany przez stypendium podoktoranckie MSRA. Prace te były wspierane przez grant projektowy Australijskiej Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC) #APP1058647 dla JX.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
C57BL/6, samiec, 6-8 tygodniAustralian Bioresources Cenre, WA, Australia
Lista toksyn krztuścowychBiological Laboratories, Inc., CA, USA#181
0,1 M mysia izotoniczna fosforanowana buforowana sól fizjologiczna (MT-PBS)Laboratoria będą miały swój własny protokół.
IsofluranePharmachem, QLD, AustraliaLaboratories będzie miało swój własny protokół podawania.
P0180– 199 peptydWuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHNP0180– 199, sekwencja S– S– K– R– G– R– Pytanie– T– P– V– L– T– A– M– L– D– H– S– R– S
Ciepło zabiło Mycobacterium tuberculosis (szczep H37RA)Difco, MI, USA#231141
Kompletny adiuwant Freunda (FCA)Difco, MI, USA#263910
16% paraformaldehyd (PFA)Usługi mikroskopii elektronowej#15710Rozcieńczyć do 4% PFA w dniu pobrania tkanki.
25% glutaraldheydeProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia#11-30-8Rozcieńczyć do 2,5% aldehydu glutarowego w dniu utrwalenia.
Azydek soduChem-Supply Pty Ltd, SA, AustraliaSL189Utwórz 10% (w/v) zapasów w 0,1 mln MT-PBS. Stosować w stężeniu 0,03% (v/v).
SacharozaChem-Supply Pty Ltd, SA, AustraliaSA030Stosować w stężeniu 30% (w/v).
Optymalna temperatura skrawania (OCT) mediumSakura Finetek, CA, USA#4583
Normalna surowica osłaMerck Millipore, MA, USA#S30-100Stosować jako rozcieńczalnik przeciwciał o stężeniu 10% (v/v) lub innym określonym przez własne laboratorium.
Triton-X 100Sigma Aldrich, MI, USA#90o2-31-1Stosować w rozcieńczalniku przeciwciał o stężeniu 0,3% (v/v) lub innym ustalonym przez własne laboratorium.
królicze białko prekursorowe anty-amyloidu (APP)Invitrogen (Life Technologies), CA, USAS12700Używany w 1:400 lub miareczkowany we własnym laboratorium.
Białko związane z antykontaktyną królika-1 (Caspr)Prezent od prof. Eliora Pelesa, Wiezmann Institute of Science, IzraelUżywany w 1:500 lub miareczkować we własnym laboratorium.
Odpowiednie sprzężone przeciwciała drugorzędowe Alexa FluorSondy molekularne (Life Technologies), OR, USARóżnezastosowania w stosunku 1:200 lub miareczkowanie we własnym laboratorium. Wybór gatunku, w którym wyhodowano przeciwciało, i wybór Alexa Fluor zależy od uznania każdego laboratorium.
Wodne rozwiązanie montażoweDako (Agilent), CA, USAKażde laboratorium będzie miało swoje własne preferencje.
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
0,5 mL strzykawka z igłami 301/2 gBD#326105
Igły 23 gBD#305143
Czerwona poduszkaDo znakowania stóp zwierząt można użyć dowolnej czerwonej poduszki z atramentem lub czerwonego barwnika spożywczego.
Aparatura DigiGate (w tym bieżnia)eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging SystemeMouse Specifics Inc. Framingham, MA
StoperMożna użyć dowolnego timera.
DigiGait 8 SoftwareeMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Mikroskop preparacyjnyZeissMożna użyć dowolnego odpowiedniego mikroskopu preparacyjnego.
Ładowane prowadniceSuperfrost Plus, Lomb Scientific Pty LtdSF41296SP
CyrostatLeicaMożna użyć dowolnego odpowiedniego cyrostatu.
Sprzęt perfuzyjny i instrumentyLaboratoria będą miały własne protoktole perfuzyjne.
Nieprzezroczyste humifikaty komoroweLabs mogą produkować własne przy użyciu nieprzezroczystego plastikowego pojemnika.
PAP peneGeneTex (USA)Ołówek woskowy lub napięcie powierzchniowe mogą być również użyte do stworzenia dołka wokół sekcji tkanki.
Mikroskop konfokalnyZeis LSM780Można użyć dowolnego mikroskopu konfokalnego z odpowiednimi liniami laserowymi.
FIDŻI/Image JNarodowe Instytuty ZdrowiaDostępne od www.fiji.sc
#S3023 z atramentem prosektoryjne

Bibliografia

  1. Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
  2. Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
  3. Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).
  4. Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
  5. Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
  6. Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy--update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
  7. Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
  8. Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
  9. Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
  10. Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
  11. Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
  12. Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model EANpeptyd P0 180 199iniekcja podsk rnatoksyna krztu caocena funkcji motorycznychanaliza chodu na bie nidemielinizacja nerwu kulszowegotransmisyjna mikroskopia elektronowa

Powiązane artykuły