Method Article

Metody badania zmian w inherentnej agregacji białek wraz z wiekiem u Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/56464

⸱

November 26th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Protein Aggregation and Aging, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Graduate School of Cellular and Molecular Neuroscience, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem przedstawionej tutaj metody jest zbadanie agregacji białek podczas normalnego starzenia się w modelowym organizmie C. elegans. Protokół stanowi potężne narzędzie do badania wysoce nierozpuszczalnych dużych agregatów, które tworzą się wraz z wiekiem i do określenia, w jaki sposób zmiany w proteostazie wpływają na agregację białek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich dziesięcioleciach częstość występowania zaburzeń neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera (AD) i choroba Parkinsona (PD), wzrosła. Te zaburzenia związane z wiekiem charakteryzują się pojawieniem się agregatów białkowych o strukturze fibrylarnej w mózgach tych pacjentów. Dokładny powód, dla którego normalnie rozpuszczalne białka przechodzą proces agregacji, pozostaje słabo poznany. Odkrycie, że agregacja białek nie ogranicza się do procesów chorobowych, a jest częścią normalnego procesu starzenia, umożliwia badanie mechanizmów molekularnych i komórkowych, które regulują agregację białek, bez użycia ektopowo eksprymowanych białek związanych z chorobą ludzką. W tym miejscu opisujemy metodologie badania inherentnej agregacji białek w Caenorhabditis elegans za pomocą podejść uzupełniających. Po pierwsze, badamy, jak hodować dużą liczbę zsynchronizowanych z wiekiem C. elegans w celu uzyskania dojrzałych zwierząt i przedstawiamy procedury biochemiczne izolowania wysoce nierozpuszczalnych dużych agregatów. W połączeniu z ukierunkowanym nokautem genetycznym możliwe jest przeanalizowanie roli interesującego genu w promowaniu lub zapobieganiu zależnej od wieku agregacji białek za pomocą kompleksowej analizy z ilościową spektrometrią mas lub analizy opartej na kandydatach z przeciwciałami. Odkrycia te są następnie potwierdzane przez analizę in vivo z transgenicznymi zwierzętami wykazującymi ekspresję białek podatnych na agregację znakowanych fluorescencyjnie. Metody te powinny pomóc w wyjaśnieniu, dlaczego niektóre białka mają skłonność do agregacji wraz z wiekiem i ostatecznie w jaki sposób utrzymać te białka w pełnej funkcjonalności.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nieprawidłowe fałdowanie i agregacja białek są uznawane za cechę charakterystyczną wielu chorób neurodegeneracyjnych, takich jak AD, PD, stwardnienie zanikowe boczne (ALS), otępienie czołowo-skroniowe (FTD) i wiele innych. Na przykład α-synukleina łączy się w fibryle amyloidowe, które gromadzą się jako ciała Lewy'ego, szczególnie w istocie czarnej pacjentów z PD, podczas gdy u pacjentów z ALS TDP-43 lub FUS nieprawidłowo się fałdują, tworząc agregaty cytoplazmatyczne w degenerujących się neuronach ruchowych. W każdym z tych zaburzeń neurodegeneracyjnych mechanizmy utrzymujące homeostazę białek lub proteostazę nie zapobiegają akumulacji nieprawidłowo sfałdowanych białek, co w konsekwencji prowadzi do choroby.

Proteostaza jest niezbędna do zapewnienia funkcji komórkowych, a w normalnych warunkach te mechanizmy regulacyjne ściśle kontrolują tempo syntezy, fałdowania i degradacji białek. Kilka badań pokazuje, że wraz z wiekiem zdolność wielu komórek i narządów do zachowania homeostazy białek jest stopniowo zagrożona, a fizjologiczne pogorszenie sieci proteostazy wraz z wiekiem jest ważnym czynnikiem obciążającym choroby neurodegeneracyjne (przegląd w bibliografii1,2,3). Fakt, że kontrola jakości białek i odpowiedź komórkowa na stres związany z niespisanymi białkami są zaburzone wraz z wiekiem, sugeruje, że nieprawidłowe fałdowanie i agregacja białek może być ogólną konsekwencją starzenia się. Rzeczywiście, my i inni wykazaliśmy, że agregacja białek nie ogranicza się do choroby, a zamiast tego część proteomu staje się wysoce nierozpuszczalna w detergentach u starszych zwierząt4,5,6,7,8,9,10. Analiza obliczeniowa i in vivo ujawniła, że te fizjologiczne agregaty związane z wiekiem przypominają agregaty chorobowe pod kilkoma względami5. Odkrycie endogennej, zależnej od wieku agregacji białek daje nam możliwość przeanalizowania mechanizmów molekularnych i komórkowych, które regulują agregację białek, bez użycia ektopowo eksprymowanych białek związanych z chorobą ludzką. Obecnie istnieją jedynie ograniczone informacje na temat regulacji powszechnej nierozpuszczalności białek oraz na temat wpływu tej dysregulacji na zdrowie organizmu.

Nicień C. elegans jest jednym z najobszerniej badanych organizmów modelowych w badaniach nad starzeniem, ponieważ zwierzęta te mają stosunkowo krótką długość życia i wykazują wiele charakterystycznych cech starzenia obserwowanych u organizmów wyższych. Wpływ starzenia się na nierozpuszczalność białek został zbadany u C. elegans poprzez sekwencyjne frakcjonowanie biochemiczne oparte na zróżnicowanej rozpuszczalności, które jest szeroko stosowane do ekstrakcji agregatów chorobowych w dziedzinie badań nad neurodegeneracją11. Za pomocą ilościowej spektrometrii mas wykazano, że kilkaset białek staje się podatnych na agregację u C. elegans przy braku choroby5. Tutaj szczegółowo opisujemy protokół hodowli dużej liczby robaków w płynnej kulturze i sekwencyjnej ekstrakcji w celu wyizolowania zagregowanych białek do kwantyfikacji za pomocą spektrometrii mas i analizy za pomocą Western blot. Ponieważ nieprawidłowo sfałdowane i podatne na agregację białka gromadzą się w starzejących się gonadach C. elegans i maskują zmiany w innych tkankach somatycznych5,12,13, używamy mutanta bez gonad, aby skupić analizę na nierozpuszczalności białek w tkankach nierozrodczych. Przedstawiona metoda umożliwia analizę wysoce nierozpuszczalnych, dużych kruszyw, które są nierozpuszczalne w 0,5% SDS i granulowane przy stosunkowo niskiej prędkości odśrodkowej. Alternatywnie, mniej rygorystyczny protokół ekstrakcji w celu zbierania również mniejszych i bardziej rozpuszczalnych agregatów został opublikowany w innym miejscu10. Ponadto opisano metodę stosowaną do oceny agregacji in vivo u C. elegans.

Ogólnie rzecz biorąc, te metody w połączeniu z interferencją RNA (RNAi) mogą ocenić rolę interesującego genu w modulowaniu zależnej od wieku agregacji białek. W tym celu opisujemy analizę ekstraktów z młodych i starszych robaków z knockdownem i bez knockdownu określonego białka będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą RNAi. Metody te powinny być potężnym narzędziem do określenia, które składniki sieci proteostazy regulują nierozpuszczalność białek. Wykazano, że kilka interwencji, takich jak zmniejszona sygnalizacja insuliny/insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF) 1 (IIS), znacznie opóźnia starzenie się C. elegans14. Szlaki długowieczności często indukują mechanizmy kontroli jakości białek, a zatem szlaki te mogą aktywnie wpływać na tempo agregacji białek. Jako przykład pokazujemy zmniejszoną naturalną agregację białek u długowiecznych zwierząt po zahamowaniu szlaku IIS7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Dla lepszego zrozumienia procedury, załączony jest schemat przepływu pracy (Rysunek 1).

1. Wzrost dużej liczby młodych i starszych C. elegans poddanych RNAi ukierunkowanemu na interesujący gen

UWAGA: Użyj sterylnych mutantów gon-2(q388) wywołanych temperaturą C. elegans (CF2253), aby uzyskać duże populacje zsynchronizowane starzeniowo. Podczas wszystkich etapów ważne jest, aby pracować w warunkach półsterylnych z otwartym ogniem i sprawdzać, czy nie ma zanieczyszczeń (na przykład grzybami lub bakteriami). Wykonaj kroki (również wirowanie) w temperaturze pokojowej, jeśli temperatura nie jest opisana.

  1. Przygotowanie mutantów C. elegans gon-2(-) do otrzymywania zwierząt bez gonad
    UWAGA: W celu uzyskania bezpłodnych zwierząt pozbawionych gonad, mutacja powodująca utratę funkcji musi być wywołana u zwierząt rodzicielskich poprzez przesunięcie ich w ostatnim stadium larwalnym (L4) do 25 °C w celu uniknięcia udziału matki.
    1. Pierwsza ekspansja zwierząt gon-2(-) w celu zebrania pokolenia rodzicielskiego dla zmiany temperatury
      1. Smuga Escherichia coli OP50 przecedzić na płytkę bulionu lizogenicznego (LB) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
      2. Następnego dnia zaszczepić 200 ml pożywki LB jednym klonem OP50 i inkubować go przez noc w temperaturze 37 °C.
      3. Następnego dnia wysiewaj 15 pożywek High Growth (HG) (średnica 9 cm) 0,5 ml OP50 i rozprowadzaj OP50 szpatułką. Przechowuj talerze w temperaturze pokojowej przez dwa dni.
      4. Kawałki zwierząt gon-2(-) (nie głodzone przez ostatnie dwa pokolenia) na 15 pożywkach HG obsianych OP50 i utrzymuj je w temperaturze 20 °C, aż płytki zlewają się z dorosłymi osobnikami, a część OP50 jest nadal dostępna.
      5. W międzyczasie wysiewaj pożywki 60 HG za pomocą OP50 zgodnie z opisem w kroku 1.1.1.3 i utrzymuj płytki w temperaturze pokojowej. Ostrożnie: Talerze z nasionami nie powinny być przechowywane dłużej niż tydzień, ponieważ agar pęknie w temperaturze pokojowej.
      6. Wybielaj zlewające się płytki, gdy większość dorosłych zacznie składać jaja, jak opisano wcześniej15. Zebrać jaja do dwóch probówek o pojemności 15 ml i umieścić na noc w mieszadle nutującym w temperaturze 20 °C.
      7. Następnego dnia przemyć wykluwające się L1 buforem M9 (85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO4): odwirować przy 3 000 x g przez 30 s, odrzucić supernatant i napełnić M9 do oznaczenia 15 ml. Odwirować, odrzucić supernatant i powtórzyć krok 1.1.1.6. Napełnij probówki powstałymi granulkami robaków do oznaczenia 15 ml za pomocą M9.
      8. Oceń całkowitą liczbę L1 za pomocą mikroskopu preparacyjnego, licząc L1 obecne w 2 μl kroplach umieszczonych na nienasiennych płytkach agarowych. Uśrednij liczby uzyskane z co najmniej dziewięciu kropli.
      9. Dodać 6 500 L1 na wysiewaną płytkę HG i pozwolić robakom rosnąć w temperaturze 20 °C do fazy L4.
    2. Drugie rozszerzenie zwierząt gon-2(-) w celu uzyskania zwierząt bez gonad do eksperymentów
      1. Na etapie L4 przesunąć robaki z kroku 1.1.1.9 do 25 °C, aż zaczną składać jaja i zaczną się wykluwać L1.
      2. Zbieranie jaj i L1 metodą sedymentacji
        UWAGA: Po zmianie temperatury do 25 °C zaleca się stosowanie sedymentacji jako delikatnej techniki oddzielania delikatnych jaj i L1 od osobników dorosłych.
        1. Umyj płytki za pomocą M9, używając 5 ml M9 na pięć płytek. Przenieś robaki do probówek o pojemności 50 ml.
        2. Napełnij wszystkie probówki do oznaczenia 45 ml M9, pozwól dorosłym osobnikom osiadać przez około 10 minut, zbierz każdy supernatant do probówki o pojemności 50 ml i powtórz ten krok z osadem. Odwirować supernatant zawierający jaja i L1 w temperaturze 3 000 x g przez 1 minutę, pozostawić osad L1s na około 10 minut i usunąć supernatant do momentu pozostawienia 15 ml.
          UWAGA: Jest to krytyczny krok. Nie należy usuwać supernatantu zbyt wcześnie, aby zebrać jak najwięcej L1.
        3. Umieścić probówki zawierające jaja i L1 w mieszalniku nutującym na noc w temperaturze 25 °C.
  2. Płynna hodowla zwierząt bez gonad w celu zebrania młodych i starszych zwierząt poddanych RNAi ukierunkowanej na gen będący przedmiotem zainteresowania
    UWAGA: Odpowiedź niektórych genów na RNAi może być zależna od temperatury, jak opisano wcześniej16. Jako alternatywę dla RNAi, zmutowany gen może zostać włączony do tła gon-2(-).
    1. Przygotowanie bakterii do hodowli płynnej
      1. Przygotować bakterie OP50 i RNAi (bakterie wytwarzające pożądane dsRNA i bakterie z pustym wektorem jako kontrolą) poprzez zaszczepienie 4 l pożywki LB 12 ml odpowiedniej kultury bakteryjnej (dodać końcowe stężenie 50 μg/ml karbenicyliny i 1 mM IPTG do kultur bakteryjnych RNAi) i inkubować je w temperaturze 37 °C przez noc przy 180 obr./min.
      2. Następnego dnia zebrać kultury w temperaturze 6 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatanty i ponownie zawiesić każdą osadkę w 60 ml lodowatego podłoża podstawowego S (100 mM NaCl, 50 mM fosforanu potasu pH 6, przechowywanego na lodzie). Przechowywać trzy zawieszone osadki (OP50, bakterie kontrolne RNAi i bakterie RNAi dla genu będącego przedmiotem zainteresowania) w temperaturze 4 °C do etapu 1.2.2 lub 1.2.3.
        UWAGA: Robaki mogą być hodowane na RNAi od stadium L1 (patrz krok 1.2.3) lub w celu uniknięcia wad rozwojowych z ostatniego stadium larwalnego L4 (patrz krok 1.2.2).
    2. Płynna hodowla do leczenia RNAi, począwszy od ostatniego stadium larwalnego L4
      1. Dodać 200 ml pożywki podstawowej S do kolby hodowlanej Fernbacha (pojemność 2 800 ml). Aby uzyskać końcową objętość hodowli wynoszącą 300 ml (patrz 1.2.2.4), dodać 10 mM cytrynianu potasu o pH 6, 3 ml roztworu metali śladowych (5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 2,5 mMFeSO4, 1 mM MnCl2, 1 mM ZnSO4, 0,1 mM CuSO4), 3 mM MgSO4, 3 mM CaCl2, 100 ng/ml karbendazymu i 5 μg/ml cholesterolu). Zamknąć kolbę zakrętką membranową. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z przepisami dotyczącymi.
      2. Wyjąć L1 z temperatury 25 °C (krok 1.1.2.2.3) i przenieść je do probówek o pojemności 15 ml. Wirować przy 1,900 x g przez 3 minuty, usunąć supernatant i policzyć L1 na 2 μl, jak w kroku 1.1.1.8. Dodać 500 000 L1 do kolby hodowlanej Fernbacha przygotowanej w poprzednim kroku.
      3. Dodaj OP50 (z kroku 1.2.1) proporcjonalnie do liczby robaków. Na przykład na 500 000 robaków dodaj 60 ml OP50.
      4. Kompletna hodowla robaków z S base, aby zwiększyć całkowitą objętość do 300 ml. Inkubować kulturę robaków do stadium L4 w temperaturze 25 °C w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 150 obr./min.
      5. Następnego dnia robaki powinny być wielkości L4 typu dzikiego. Aby zmienić bakterie z OP50 na RNAi, zbierz zwierzęta do sześciu probówek o pojemności 50 ml, pozwól im się osadzać i usuń supernatant. Przemyć L4s M9 w celu usunięcia resztek bakterii OP50: odwirować przy 1900 x g przez 3 minuty, usunąć supernatant i przenieść wszystkie L4 do jednej probówki o pojemności 50 ml. Policz L4 na 5 μl (co najmniej dziewięć razy). Dwa razy 50 000 L4 jest potrzebne do zebrania młodych robaków i dwa razy 100 000 L4 są potrzebne do zebrania starych robaków.
      6. Przygotować cztery kolby hodowlane Fernbacha zgodnie z opisem w ppkt 1.2.2.1. Dodać również końcowe stężenie 50 μg/ml karbenicyliny i 1 mM IPTG do każdej kolby.
      7. Dodać kontrolne bakterie RNAi i bakterie RNAi dla genu będącego przedmiotem zainteresowania (z kroku 1.2.1) proporcjonalnie do liczby robaków: Dodać 7 ml odpowiednich bakterii na kolbę w przypadku młodych robaków i 14 ml na kolbę w wieku dojrzałym robaków.
      8. Dodaj 50 000 robaków na kolbę dla kolekcji młodych robaków i 100 000 robaków na kolbę dla kolekcji starych robaków i uzupełnij kultury z bazą S, aby wypełnić do 300 ml. Inkubować kultury robaków (w sumie cztery) w temperaturze 25 °C i 150 obr./min.
    3. Płynna hodowla do leczenia RNAi od etapu L1
      1. Przygotować cztery kolby hodowlane Fernbacha zgodnie z opisem w ppkt 1.2.2.1 i dodać końcowe stężenie 50 μg/ml karbenicyliny i 1 mM IPTG.
      2. Kontynuować przygotowanie L1 zgodnie z opisem w ppkt 1.2.2.2. W sumie potrzeba 300 000 robaków, aby podzielić je na cztery kolby.
      3. Dodać kontrolne bakterie RNAi i bakterie RNAi dla interesującego genu (z kroku 1.2.1) proporcjonalnie do liczby robaków, jak opisano w kroku 1.2.2.7 i uwzględnić również fazę wzrostu między etapem L1 i L4: Dodać 13 ml odpowiednich bakterii na kolbę dla młodych robaków i 26 ml na kolbę dla starzejących się robaków.
      4. Postępuj zgodnie z opisem w kroku 1.2.2.8.
    4. Utrzymanie płynnych kultur C. elegans
      1. Okresowo pobierać podwielokrotność z każdej płynnej kultury i umieszczać na szkiełku podstawowym (alternatywnie na płytce agarowej) w celu sprawdzenia, czy nie ma zanieczyszczeń. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego sprawdź poziom pokarmu bakteryjnego w kulturze, zwłaszcza w fazie wzrostu. Przygotować z wyprzedzeniem 2 l kultur kontrolnych bakterii RNAi i bakterii RNAi dla genu będącego przedmiotem zainteresowania, jak opisano w kroku 1.2.1. W razie potrzeby dodać je do płynnych kultur C. elegans, a resztę przechowywać w temperaturze 4 °C.
      2. Okresowo sprawdzaj, czy zwierzęta są bezpłodne. Większość zwierząt nie będzie miała gonady. W zależności od penetracji mutacji gon-2, niektóre mogą mieć poronione struktury gonadalne, ale nie należy obserwować zwierząt z jajami.
  3. Zbiór młodych i starych robaków poddanych działaniu RNAi w płynnej kulturze
    UWAGA: Wszystkie poniższe kroki dotyczą jednej płynnej kolby hodowlanej, ale obie kultury w tym samym wieku z grupą kontrolną i bakteriami RNAi dla interesującego genu powinny być przetwarzane razem.
    1. Zbierz młode robaki w dniu 2 lub 3, aby zmierzyć podstawowy poziom nierozpuszczalności białka. Stare robaki należy zbierać (najpóźniej), gdy padnie połowa populacji. Aby to ustalić, martwe i żywe robaki liczy się w kilku kroplach płynnej kultury umieszczonej na płytce agarowej. Wskaźniki są uśredniane dla co najmniej dziewięciu kropli.
    2. Przygotuj następujące odczynniki: 1 L M9, 1 L M9 z 0,01% Octoxynol-9 (M9 + Octoxynol-9) i 40 ml 60% sacharozy w ddH2O. Odczynniki należy przechowywać na lodzie.
    3. Wlać robaki z jednej kolby do lejka rozdzielającego i pozostawić robaki na osadzanie się przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Otwórz kran i wlej robaki do jednej probówki o pojemności 50 ml.
    4. Podzielić osad robaka na dwie probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 1 900 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Aby umyć robaki, usuń supernatant i napełnij do 15 ml M9. Powtórzyć wirowanie. Na koniec przenieś robaki do dwóch probówek o pojemności 50 ml i napełnij całkowitą objętość do 20 ml lodowatym M9.
    5. Aby usunąć bakterie i martwe robaki, dodaj dwie rozcieńczone granulki robaków o pojemności 20 ml do dwóch probówek o pojemności 50 ml wypełnionych 20 ml lodowatej 60% sacharozy. Szybko wirować przy 2 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, przyspieszanie 9 i zwalnianie 7. Ostrożnie usuń górną warstwę robaka za pomocą dużej pipety (25 ml). Weź do 15 ml (ale mniej, jeśli oczywiście jest dużo martwych robaków). Wsyp to bezpośrednio do 37 ml M9 + Octoxynol-9 (3 probówki na probówkę sacharozy) przygotowanej na lodzie. Wirować przy 2 700 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, przyspieszenie 9 i opóźnienie 7,
      UWAGA: Oba muszą być lodowate; w przeciwnym razie separacja nie zadziała. Nie mieszać! Ponieważ sacharoza jest toksyczna dla robaków, ważne jest, aby szybko przejść do następnego kroku.
    6. Podzielić osad na cztery probówki o pojemności 15 ml i dwukrotnie przemyć lodowatym M9+ Octoxynol-9: odwirować przy 1,900 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant, napełnić do 15 ml oznaczone lodowatym M9+Octoxynol-9 i powtórzyć procedurę.
    7. Umyj raz lodowatym M9 i połącz cztery probówki z dwiema tubkami. Napełnić M9 w temperaturze pokojowej do całkowitej objętości 4 ml w probówkach 15 ml i obracać na mieszalniku nutującym w temperaturze 25 °C przez 40 min.
      UWAGA: Pomaga to robakom trawić wszelkie pozostałości bakterii w jelitach. Sprawdź robaki pod mikroskopem, aby zobaczyć, czy nie ma martwych.
    8. Umyj robaki dwukrotnie lodowatym M9 + Octoxynol-9, jak opisano w 1.3.5. Umyj dwukrotnie M9 i przenieś robaki do jednej tubki.
    9. Przed pobraniem przemyć robaki w buforze ekstrakcyjnym o wysokiej zawartości soli do ponownego montażu (RAB) bez inhibitorów (0,1 M kwas 4-morfolinoetanosulfonowy (MES), 1 mM kwas etylenoglikoltetraoctowy (EGTA), 0,1 mM EDTA, 0,5 mMMgSO4, 0,75 M NaCl, 0,02 M fluorku sodu (NaF)) ). Usunąć supernatant do momentu, aż na wierzchu osadu ślimakowego nie będzie płynu.
      UWAGA: Ten krok i następny należy wykonać szybko, aby uniknąć artefaktów w robakach spowodowanych wysokim stężeniem soli w buforze.
    10. Oszacuj objętość osadu robaka i dodaj identyczną objętość RAB z inhibitorami (2x Koktajl Inhibitorów Proteazy). Za pomocą pipety Pasteura wyciągnij robaki i powoli wlej je do 50 ml probówki wypełnionej do połowy ciekłym azotem umieszczonej w suchym lodzie. Pozwól ciekłemu azotowi odparować i przechowuj zamrożone robaki w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania.
      Uwaga: Ciekły azot ma bardzo niską temperaturę; Nosić odpowiednią ochronę.

2. Ekstrakcja nierozpuszczalnych białek u młodych i starszych zwierząt poddanych działaniu RNAi ukierunkowanego na gen będący przedmiotem zainteresowania

  1. Zakłócenie w stosunku do zwierząt zebranych w kroku 1.3
    UWAGA: Ważne jest, aby unikać rozmrożenia próbek robaków. Schłodzić zaprawę ciekłym azotem i wykonać całą procedurę na suchym lodzie.
    Uwaga: Ciekły azot ma bardzo niską temperaturę; Nosić odpowiednią ochronę.
    1. Zamrożone robaki przenieść do wstępnie schłodzonego moździerza i mielić przez 2,5 min.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas mielenia: na początku zamrożone robaki są w małych kulkach i łatwo je zgubić.
    2. Dodaj ciekły azot (około 100 ml) do proszku, aby ponownie go schłodzić i miel przez kolejne 2,5 minuty. Sprawdź pod mikroskopem, czy ciała robaków są uszkodzone. Przenieść proszek do probówek o pojemności 2 ml i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
  2. Szybka ekstrakcja białka nierozpuszczalnego do analizy Western blot
    Uwaga: Użyj tej metody, aby porównać całkowitą zawartość białka i poziomy białka nierozpuszczalnego między różnymi dniami z RNAi i bez niego ukierunkowanego na gen będący przedmiotem zainteresowania. Wykonaj wszystkie kroki aż do kroku 2.2.3 na lodzie!
    1. Rozpuścić 50 mg robaków ziemnych z kroku 2.1 za pomocą 150 μl buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 0,5% deoksycholanu sodu (SDO), 1% nonylofenylopolietylenglikolu (NP40), 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF), 1x koktajl inhibitorów proteazy). Homogenizować zawiesinę za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z szarą igłą (27 G x 1/2", 0,4 mm x 13 mm); Narysuj zawieszenie 10 razy.
    2. Wirować przy 18 400 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać sklarowany osad.
    3. Zawiesić osad w 100 μl buforze RIPA i odwirować przy 18 400 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, krótko odwirować i uważać, aby usunąć resztki supernatantu.
    4. Aby rozpuścić wysoce nierozpuszczalne białka, należy ponownie zawiesić osad w 75 μl buforu mocznik/SDS (8 M mocznika, 2% SDS, 50 mM ditiotreitol (DTT), 50 mM Tris, pH 8) i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Aby przeanalizować całkowitą zawartość białka, należy połączyć pierwszy supernatant RIPA z kroku 2.2.2 i zawiesinę osadów mocznik/SDS. Aby uwzględnić objętości użyte do ekstrakcji, całkowita frakcja powinna zawierać dwie trzecie supernatantu RIPA i jedną trzecią frakcji osadów mocznika/SDS. Na małym żelu o gradiencie 4-12% sprawdź poziom nierozpuszczalnego białka, ładując 9 μl frakcji mocznika/SDS i 4 μl całkowitego białka połączonego. Wykonaj barwienie całkowitym blotem białkowym, aby monitorować poziom białka. Za pomocą Western blot przy użyciu specyficznych przeciwciał należy zweryfikować zmiany nierozpuszczalności poszczególnych białek określone ilościowo za pomocą spektrometrii mas (patrz punkt 3).
  3. Ekstrakcja białek nierozpuszczalnych w celu wyizolowania białek nierozpuszczalnych w SDS do spektrometrii mas
    UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki na lodzie.
    1. Na suchym lodzie odważ dwa razy 350 mg zmielonych robaków na punkt czasowy i na bakterie RNAi (młode i starsze robaki, bakterie kontrolne RNAi i bakterie RNAi dla interesującego genu) do probówek o pojemności 2 ml.
    2. Aby usunąć białka rozpuszczalne o wysokiej zawartości soli, dodaj dwie objętości RAB na wagę (700 μl) z inhibitorami, 1 mM PMSF, 200 U/ml DNazy I i 100 μg/ml RNazy A do każdej probówki i rozpuścić proszek na lodzie. Pobrać zawiesinę do strzykawki o pojemności 1 ml (szara igła, 27 G x 1/2", 0,4 mm x 13 mm) 15 razy i inkubować na lodzie przez 10 minut. Wirować przy 18 400 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przejdź przez warstwę tłuszczu i zbierz supernatant zawierający białka rozpuszczalne o wysokiej zawartości soli do jednej probówki o pojemności 2 ml na warunek (w sumie cztery probówki). Usuń tłuszcz i wyrzuć go. Podwielokrotność białek rozpuszczalnych o wysokiej zawartości soli do zamrożenia w temperaturze -80 °C.
    3. Aby odrzucić lipidy, należy rozpuścić osad z 700 μl RAB z inhibitorami zawierającymi 1 M sacharozę (bez DNazy I i RNazy A). Pobrać zawiesinę do strzykawki 10 razy i inkubować na lodzie przez 5 minut. Wirować przy 18 400 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Należy uważać, aby usunąć cały sklarowany osad i lipidy i wyrzucić je.
    4. Aby usunąć białka rozpuszczalne w SDS, należy rozpuścić osad za pomocą 700 μl buforu RIPA. Pobrać zawiesinę do strzykawki 10 razy i inkubować przez 10 minut na lodzie. Wirować przy 18 400 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant zawierający białka rozpuszczalne w SDS i porcję do zamrożenia w temperaturze -80 °C.
    5. Zebrać dwie próbki każdego stanu po rozpuszczeniu każdej osadki za pomocą 500 μl buforu RIPA. Pobrać zawiesinę do strzykawki 10 razy. Wirować w temperaturze 18 400 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Należy uważać, aby usunąć cały sklarowany osad i wyrzucić go.
      UWAGA: Celem ekstrakcji jest oddzielenie białek rozpuszczalnych od białek nierozpuszczalnych. Dlatego ważne jest, aby usunąć cały pozostałości supernatantu RIPA przed dodaniem kwasu mrówkowego w następnym kroku.
    6. Końcową osadkę zawierającą wysoce nierozpuszczalne białka rozpuścić w 400 μl 70% kwasu mrówkowego i pobrać zawiesinę do strzykawki 20 razy. Inkubować przez 20 minut na lodzie. Wirować przy 50 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, przyspieszeniu 3 i opóźnieniu 5, w celu usunięcia resztek naskórka robaka. Zebrać sklarowany nad nim sklarowany składnik zawierający wysoce nierozpuszczalne białka i zamrozić go w temperaturze -80 °C.
    7. Dializa nierozpuszczalnych frakcji białkowych do spektrometrii mas
      UWAGA: Dializować w temperaturze 4 °C.
      1. Przygotować 8 l buforu do dializy (50 mM Tris, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, pH 7,5) i podzielić go na osiem zlewek o pojemności 1 l. Umieścić trzy membrany (filtry membranowe = 0,025 μM) na powierzchni bufora na każdą zlewkę o pojemności 1 l.
      2. Na każdą membranę ostrożnie załadować 65 μl nierozpuszczalnego białka rozpuszczonego w kwasie mrówkowym otrzymanym w kroku 2.3.6. Każdy warunek jest podzielony na sześć membran.
      3. Sprawdź pH jednej próbki, usuwając 5 μl i dodając ją do paska pH. Jeśli pH mieści się w przedziale od 7 do 8 (mniej więcej po 2 godzinach), należy pobrać próbkę, delikatnie pipetując w górę i w dół. Na koniec użyj 10 μl buforu do dializy, aby zmyć osad z każdej membrany. Zamrażać próbki w temperaturze -80 °C.

3. Kompleksowa identyfikacja i kwantyfikacja zmian w nierozpuszczalności białek wraz z wiekiem wywołanych przez RNAi ukierunkowane na interesujący gen

  1. Przygotowanie do analizy metodą spektrometrii mas
    1. Ocenić ilość nierozpuszczalnych białek w dializowanych próbkach, ładując podwielokrotność do żelu gradientowego o stężeniu 4-12% razem z próbką referencyjną o znanym stężeniu. Wykonaj barwienie całkowitego żelu białkowego i określ ilościowo ilość białka za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Ten krok jest niezbędny do oszacowania ilości trypsyny potrzebnej do trawienia (krok 3.1.4).
    2. Zagęścić próbki za pomocą parownika odśrodkowego i rozpuścić nierozpuszczalne białka w końcowym stężeniu 8 M mocznika.
    3. Alkilowanie i redukcja
      1. Dodać do próbek chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP) do końcowego stężenia 4 mM. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 57 °C z prędkością 300 obr./min. Umieścić próbki w temperaturze pokojowej.
      2. Dodać jodoacetamid do końcowego stężenia 8,4 mM. Inkubować przez 45 minut (można inkubować przez 2 godziny) w ciemności w temperaturze pokojowej.
      3. Rozcieńczyć próbki w 150 mM wodorowęglanie amonu, aby uzyskać końcowe stężenie 2 M mocznika.
    4. Trawić białka z 5% w/w modyfikowaną trypsyną przez noc w temperaturze 37 °C i 400 obr./min.
    5. Załaduj próbkę strawionych białek na 12% żel SDS i wykonaj barwienie całkowitego żelu białkowego, aby przeanalizować, czy trawienie zadziałało. Jeśli niektóre pasma są nadal obecne, powtórz kroki 3.1.4 i 3.1.5.
    6. Peptydy z grupy kontrolnej młodości i wieku oraz C. elegans poddane działaniu RNAi są znakowane znacznikami izobarycznymi w celu względnej i bezwzględnej oceny ilościowej zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Alternatywnie, do oznaczania ilościowego można zastosować inne metody znakowania peptydów lub białek, takie jak tandem mass tags.
      UWAGA: Analiza spektrometrii mas: Aby zmniejszyć złożoność próbki, peptydy należy rozdzielić za pomocą silnej chromatografii kationowymiennej na różne frakcje do analizy spektrometrii mas5. Kilka spektrometrów masowych jest w stanie analizować znaczniki izobaryczne pod kątem względnej i bezwzględnej oceny ilościowej, jak opisano w innym miejscu17. Pozyskane dane powinny być przetwarzane za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Ogólnie rzecz biorąc, analiza ta pozwala na identyfikację wysoce nierozpuszczalnych białek i ich zmian wraz z wiekiem i modulacją proteostazy.

4. Ocena in vivo wpływu interesującego genu na wzorzec agregacji podczas starzenia

  1. Z analizy spektrometrii mas w sekcji 3 wybrać zależne od wieku białko podatne na agregację, które gromadzi się w różnym stopniu u zwierząt poddanych działaniu RNAi. Wygeneruj transgeniczne linie C. elegans wyrażające to białko oznaczone białkiem fluorescencyjnym i pod kontrolą odpowiedniego promotora lub promotora specyficznego dla tkanki (patrz Dyskusja w celu wyboru odpowiedniego promotora). Utrzymuj szczep w temperaturze 15 °C za pomocą standardowych technik na płytkach wzrostu nicieni (NG) wysianych OP50. Na przykład wybraliśmy szczep robaka eksprymujący białko wiążące poliadenylan (PAB-1) połączony na N-końcu w celu oznaczenia RFP pod kontrolą promotora mięśnia gardła pmyo-2.
  2. Ocena in vivo zmian w agregacji wraz z wiekiem po zahamowaniu genu będącego przedmiotem zainteresowania
    1. Z jedno- lub dwudniowym wyprzedzeniem przygotuj płytki NG/karbenicyliny (Carb)/IPTG z bakteriami kontrolnymi (pusty wektor RNAi L4440) i bakteriami RNAi w celu zahamowania interesującego genu. (Szczegółowy protokół dotyczący RNAi u C. elegans można znaleźć w bazie danych JoVE Science Education Database. Podstawy biologii 1: drożdże, Drosophila i C. elegans. RNAi u C. elegans. JoVE, Cambridge, MA, doi: 10.3791/5105 (2017)).
    2. W celu leczenia RNAi z L1 należy umieścić robaki składające jaja na kilku oddzielnych małych płytkach NG/Carb/IPTG (o średnicy 6 cm) wysianych kontrolnymi bakteriami RNAi lub RNAi dla interesującego genu w temperaturze 20 °C. Dorosłe osobniki usunąć po 2 godzinach, utrzymując potomstwo w temperaturze 20 °C. Aby uniknąć wad rozwojowych, leczenie RNAi można rozpocząć po stadium larwalnym L4.
    3. Gdy potomstwo osiągnie stadium larwalne L4, przenieś te L4 na nowe płytki NG/Carb/IPTG obsiane kontrolnymi bakteriami RNAi lub RNAi dla interesującego genu. Ustawić dziewięć płytek z 15 transgenikami każda dla obu warunków i utrzymywać je w temperaturze 20 °C. Starzejące się robaki muszą być przenoszone z potomstwa na nowe płytki co drugi dzień, aż do końca okresu rozrodczego, aby móc odróżnić je od potomstwa.
    4. Oceń zmiany w dystrybucji białka podatnego na agregację znakowanego znacznikiem fluorescencyjnym pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym z 24-krotnym powiększeniem w wieku dorosłym, co drugi dzień.
      UWAGA: Zależna od wieku akumulacja białka podatnego na agregację w jasnych puncta jest używana jako odczyt do agregacji. Te puncta powinny być wysoce nieruchomymi strukturami, aby można je było scharakteryzować jako agregaty. Należy to określić za pomocą odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) przy użyciu mikroskopii konfokalnej. W przypadku białka zagregowanego nie należy zaobserwować odzysku w wybielonym regionie po co najmniej 4 min5,18. Aby określić ilościowo zmiany wraz z wiekiem, oceniliśmy wzorce rozmieszczenia u robaków zsynchronizowanych z wiekiem z nadekspresją PAB-1 w dniu 2, dniu 5 i dniu 7 dorosłości w następujący sposób: niskie poziomy agregacji (0-10 tagRFP: :P AB-1 puncta w tylnej opuszki gardłowej), średnie poziomy agregacji (ponad 10 punktów w tylnej opuszki gardłowej) i wysokie poziomy agregacji (ponad 10 punktów w przedniej opuszki gardłowej).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy przedstawionych tutaj metod, aby ocenić, jak długowieczne zwierzęta z obniżonymi IIS modulują agregację białek zależną od wieku. Za pomocą Western blot (patrz krok 2.2, Szybka ekstrakcja białka nierozpuszczalnego do analizy Western blot), przeanalizowaliśmy całkowitą i nierozpuszczalną zawartość białka w młodych (3 dzień dorosłości) i starszych (18 dzień dorosłości) robakach na kontrolnym RNAi i na RNAi ukierunkowanym na receptor podobny do insuliny / IGF-1 daf-2. Nie za...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy metodologię izolowania wysoce nierozpuszczalnych agregatów białkowych ze starzejących się C. elegans poddanych działaniu RNAi do analizy za pomocą spektrometrii mas i Western blot. Pokazujemy, że poprawa proteostazy poprzez zmniejszenie IIS znacznie zapobiega zależnej od wieku agregacji białek. Poprzez selekcję specyficznych białek podatnych na agregację do nadekspresji w C. elegans, możliwe jest dalsze przeanalizowanie mechanizmów modulujących naturalną agregację białek.

...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez fundusze z DZNE oraz Międzynarodowy Grant Reintegracyjny Marie Curie (322120 dla D.C.D.)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kolba hodowlana Fernbacha Corning4425-2XLPyrex, Pojemność 2 800 ml, z 3 wgłębieniami na przegrodę
Membrana Zakrętka Mieszalnik1088655GL45
VWR444-0148
Lejek separacyjnyNalgene4300-1000Pojemność 1.000 ml
Strzykawka 1 ml BD Plastipak300013
Szara igła, 27 G x ½ ", 0,4 mm x 13 mmBD Microlance 3300635
Filtry membranowe 0,025 &mikro; MMilliporeVSWP04700
Pasek pHMachery-Nagel92110pH-Fix 0-14
inhibitorówproteazy4693132001Kompletne mini tabletki wolne od EDTA 
Oktoksynol-9 ApplichemA1388Triton X-100
Kwas 4-morpholineetanosulfonowy (MES)Sigma-AldrichM1317
NonylofenylopolietylenglikolApplichemA1694Nonidet P40 (NP40)
DNaseIRoche04716728001rekombinowany, wolny od RNaz RNazaA
PromegaA7973roztwór
Barwienie blot białkowy Całkowite barwienie blot białkowyThermofisherS11791Sypro Barwnik białkiem rubinowym Barwienie
w żelu białkowymThermofisherS12001Sypro Barwnik w żelu białkowym rubinowym
TCEP (chlorowodorek tris (2-karboksyetylo)fosfiny)Serva36970
JodoacetamidServa26710
Wodorowęglan amonuSigma-Aldrich09830
Sekwencjonowanie Zmodyfikowana trypsynaPromegaV5111
Znaczniki izobaryczne do względnej i bezwzględnej oceny ilościowejOdczynniki Sciex4352135iTRAQ Zestaw multipleksowy
Wirówka Avanti J-26XPUltrawirówka Beckmann Coulter393126
Optima Max-XP393315redlic Beckmann
5424REppendorf
5404000413 Wirówka 5702Eppendorf5702000329
Wirówka Megafuge 40RThermo Scientific
PlusEppendorf5305000304Parownik odśrodkowy
Fluorescencyjny stereomikroskop M165 FC Leicaz obiektywem Planapo 2.0x
Mikroskop preparacyjnyLeica Mikroskop Leica S6E
o dużym powiększeniu Zeiss Axio Observer Z1Zeissz obiektywem PlanAPOCHROMAT 20x i Zeiss Axio Cam MRm
SoftwareImage
Szczep http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
E.coli
OP50CGC
RNAi bacteria
L4440Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutanty
CF2253CGC, nazwa szczepu: EJ1158 Genotyp: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214Laboratorium Della Davida w DZNE Tü bingenGenotyp: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
DCD215Laboratorium Della Davida w DZNE Tü : daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
nutacyjny Schott Koktajl Roche Wirówka Koncentrator 75004518 Analysis of mass spectrometr Prospector (Wyszukiwarka białków) Genotyp bingen

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
  2. David, D. C. Aging and the aggregating proteome. Frontiers in genetics. 3, 247(2012).
  3. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
  4. Ayyadevara, S., et al. Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles. Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).
  5. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS biology. 8, 1000450(2010).
  6. Demontis, F., Perrimon, N. FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging. Cell. 143, 813-825 (2010).
  7. Lechler, M. C., et al. Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging. Cell reports. 18, 454-467 (2017).
  8. Reis-Rodrigues, P., et al. Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan. Aging cell. 11, 120-127 (2012).
  9. Tanase, M., et al. Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation. Scientific reports. 6, 19311(2016).
  10. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161, 919-932 (2015).
  11. Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue. Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).
  12. Goudeau, J., Aguilaniu, H. Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans. Aging cell. 9, 991-1003 (2010).
  13. Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans. PLoS genetics. 11, 1005725(2015).
  14. Uno, M., Nishida, E. Lifespan-regulating genes in C. elegans. Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010(2016).
  15. Sulston, J. H. The Nematode Caenorhabditis elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
  16. Maine, E. M. RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions. Developmental biology. 239, 177-189 (2001).
  17. Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).
  18. Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).
  19. Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , 1-58 (2013).
  20. Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).
  21. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).
  22. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9, 85964(2014).
  23. Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
  24. Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance. Cell. 143, 299-312 (2010).
  25. Andux, S., Ellis, R. E. Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females. PLoS genetics. 4, 1000295(2008).
  26. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489, 263-268 (2012).
  27. Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 5, 1000639(2009).
  28. Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases. Front Mol Neurosci. 10, 101(2017).
  29. Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529, 92-96 (2016).
  30. Kawarabayashi, T., et al. Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).
  31. Kraemer, B. C., et al. Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein AggregationCaenorhabditis elegansAge Synchronized WormsHighly Insoluble AggregatesGenetic KnockdownQuantitative Mass SpectrometryFluorescent Tagged ProteinsRAB Extraction BufferUltracentrifugationFormic Acid Solubilization

Related Articles