Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test hodowli osteoklastów szpiku kostnego myszy oparty na RANKL w celu zbadania roli mTORC1 w tworzeniu osteoklastów

13.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56468

⸱

15 marca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Dentistry, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research Center of Stomatology, 2State Key Laboratory of Cell Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, University of Chinese Academy of Sciences, 3Department of Oral and Maxillofacial-Head and Neck Oncology, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje protokół izolacji i hodowli osteoklastów in vitro ze szpiku kostnego myszy oraz badania roli ssaczo-mechanistycznego celu kompleksu rapamycyny 1 w tworzeniu osteoklastów.

Streszczenie

Osteoklasty to unikalne komórki resorpujące kości, które różnią się od linii monocytów/makrofagów szpiku kostnego. Dysfunkcja osteoklastów może prowadzić do szeregu chorób metabolicznych kości, w tym osteoporozy. Aby opracować cele farmaceutyczne w celu zapobiegania patologicznej utracie masy kostnej, należy zrozumieć mechanizmy, dzięki którym osteoklasty różnią się od prekursorów. Zdolność do izolowania i hodowli dużej liczby osteoklastów in vitro ma kluczowe znaczenie dla określenia roli określonych genów w różnicowaniu osteoklastów. Inaktywacja ssaczo-mechanistycznego celu kompleksu rapamycyny 1 (TORC1) w osteoklastach może zmniejszyć liczbę osteoklastów i zwiększyć masę kostną; Jednak mechanizmy leżące u podstaw tego zjawiska wymagają dalszych badań. W niniejszym badaniu opisano oparty na RANKL protokół izolacji i hodowli osteoklastów ze szpiku kostnego myszy oraz badania wpływu inaktywacji mTORC1 na tworzenie osteoklastów. Protokół ten skutecznie doprowadził do powstania dużej liczby gigantycznych osteoklastów, zwykle w ciągu jednego tygodnia. Delecja Raptor upośledzała tworzenie osteoklastów i zmniejszała aktywność kwasowej fosfatazy odpornej na winian wydzielnicze, co wskazuje, że mTORC1 ma kluczowe znaczenie dla tworzenia osteoklastów.

Wprowadzenie

Kość jest ciągle zmieniającym się organem i jest przebudowywana przez osteoblasty i osteoklasty przez całe życie. Osteoklasty są odpowiedzialne za zmineralizowaną resorpcję macierzy, a osteoblasty syntetyzują i wydzielają nowe matryce kostne1. Równowaga między resorpcją kości a tworzeniem kości ma kluczowe znaczenie dla zdrowia kości, w tym utrzymania masy kostnej oraz reakcji na stymulację i urazy. Jeśli ta równowaga zostanie zakłócona, może dojść do szeregu chorób metabolicznych kości, w tym osteoporozy i chorób przyzębia. W tych chorobach utrata masy kostnej wynikająca z osteoklastycznej resorpcji kości przekracza zdolność kościotwórczą osteoblastów2,3. W związku z tym, aby opracować cele farmaceutyczne do leczenia chorób układu kostnego, takich jak osteoporoza, kluczowe znaczenie ma zrozumienie powstawania i biologii osteoklastów4.

Osteoklasty to unikalne gigantyczne wielojądrowe komórki znajdujące się na powierzchni kości lub w jej pobliżu, należące do rodziny monocytów/makrofagów1. Ibbotson, K. J. i wsp. opisano metodę generowania komórek podobnych do osteoklastów in vitro z pożywką zawierającą 1,25-dihydroksy-witaminę D35. Identyfikacja czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i aktywatora receptora dla liganda czynnika jądrowego κ B (RANKL) jako podstawowych czynników tworzenia osteoklastów znacznie zwiększyła skuteczność osteoklastogenezy in vitro1,6,7. Możliwość hodowli osteoklastów in vitro poszerzyła naszą wiedzę na temat wytwarzania i regulacji osteoklastów.

Ssakowy/mechanistyczny cel rapamycyny (mTOR) funkcjonuje w dwóch strukturalnie i funkcjonalnie odrębnych kompleksach, a mianowicie mTORC1 i mTORC28,9. Te dwa kompleksy wielobiałkowe różnią się od siebie różnymi składnikami i substratami końcowymi. mTORC1 zawiera unikalne białko mTOR (Raptor) związane z regulatorem, podczas gdy mTORC2 zawiera niewrażliwego na rapamycynę towarzysza mTOR (Rictor)9. mTORC1 może integrować i przesyłać ważne sygnały w celu regulacji wzrostu, proliferacji i różnicowania komórek. Niedawno wykazaliśmy, że mTORC1 odgrywa kluczową rolę w sieci katabolicznej resorpcji kości poprzez delecję Raptor w celu inaktywacji mTORC1 w osteoklastach10. Mechanizmy leżące u podstaw tego zjawiska wymagają jednak dalszych badań. W niniejszym badaniu zastosowano metodę osteoklastogenną opartą na RANKL do generowania osteoklastów z makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMM) myszy typu dzikiego (WT) i RapCtsk oraz do zbadania wpływu inaktywacji mTORC1 na tworzenie osteoklastów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury związane ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Stanford Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology.

1. Przygotowanie

  1. Wygeneruj myszy z delecją specyficzną dla osteoklastów Raptor (Raptorfl / fl; Ctsk-cre, dalej RapCtsk) przez kojarzenie myszy Raptor fl/fl z myszami Ctsk-cre. Użyj myszy Raptor fl / fl jako kontroli WT w tym badaniu.
  2. Miej pojemnik z lodem, aby utrzymać odizolowaną kość.
  3. Przygotuj pożywkę hodowlaną.
    1. Przygotuj pożywkę hodowlaną α-MEM, uzupełniając minimalną niezbędną pożywkę alfa (α-MEM) 1x glutaminą, penicyliną-streptomycyną i 10% płodową surowicą cielęcą.
    2. Przygotować pożywkę do indukcji makrofagów szpiku kostnego składającą się z 50 ml pożywki α-MEM i M-CSF w stężeniu 20 ng/ml.
    3. Przygotować pożywkę do indukcji osteoklastów składającą się z M-CSF i RANKL odpowiednio w stężeniu 20 ng/ml w 50 ml pożywki α-MEM.
  4. Przygotuj następujące przed barwieniem TRAP.
    1. Przygotować roztwór utrwalający składający się z 6,5 ml acetonu, 2,5 ml roztworu cytrynianu i 0,8 ml 37% (obj./obj.) roztworu formaldehydu.
    2. Przygotuj roztwór do barwienia TRAP.
      1. Podgrzej wodę dejonizowaną do temperatury 37 °C.
      2. Dodaj 100 μl roztworu bazowego GBC szybkiego granatu i 100 μl roztworu azotynu sodu do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml i mieszaj przez delikatną inwersję przez 30 s. Pozostaw mieszaninę na 2 minuty.
      3. Podgrzej 9 ml wody dejonizowanej do temperatury 37 °C. Dodać 200 μl roztworu zasadowego GBC diazotowanego granatu szybkiego z kroku 1.4.2.2, 100 μl roztworu fosforanu AS-BI naftolu, 400 μl roztworu octanu i 200 μl roztworu winianu.
      4. Roztwór mieszaniny barwiącej TRAP należy przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  5. Przygotować następujący bufor przed ilościowym określeniem aktywności TRAP pożywki hodowlanej.
    1. Przygotować bufor winianu (50 ml): 2 ml 0,33 M kwasu L-winowego, 48 ml 0,33 M dwuzasadowego odwodnionego winianu sodu. Dostosuj wartość pH do 4,9.
    2. Przygotować bufor disodowy fosforanu 4-nitrofenylu (pNPP) (200 ml): 1,502 g glicyny, 41 mg MgCl2, 27,2 mg ZnCl2 i 180 ml wody dejonizowanej. Dostosować wartość pH do 10,4 za pomocą 3 M NaOH, a objętość do 200 ml za pomocą wody dejonizowanej.
    3. Przygotować bufor pNPP z substratem fosfatazy (na jedną płytkę 96-dołkową): 49,37 mg substratu fosfatazy i 175 μl buforu pNPP z kroku 1.5.2.
    4. Przygotuj bufor substratowy (płytka 9 ml/96-dołkowa): 6,24 ml wody dejonizowanej, 360 μl roztworu octanu i 2,4 ml buforu winianowego. Wymieszać przez wir i podgrzać w temperaturze 37 °C przed użyciem.
    5. Dodać 90 μl buforu pNPP z substratem fosfatazy (1.5.3) do 9 ml podgrzanego buforu substratowego (1.5.4) w celu uzyskania mieszaniny substratów i wirować przez 10 s.

2. Sekcja (Dzień -1)

  1. Poddaj eutanazji 3 miesięczne samice myszy WT i RapCtsk osobno za pomocą CO2. Wdychanie CO2 należy wykonywać przy użyciu odpowiedniego sprzętu przez przeszkolony personel.
  2. Zanurz 6 myszy w zlewce ze 100 ml 75% etanolu (obj./obj.) na 5 minut, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu, a następnie umieść na desce sekcyjnej w pozycji leżącej. Wykonaj nacięcie w dystalnej części kości piszczelowej pionowo i wypreparuj skórę wzdłuż tylnej kończyny nożyczkami okulistycznymi.
  3. Przetnij więzadło stawowe stawu biodrowego nożyczkami i zwichnij tylne kończyny od tułowia.
  4. Przetnij więzadło stawowe stawu kolanowego i ostrożnie odłącz kość piszczelową i udową od stawu kolanowego. Delikatnie usuń miękką tkankę nożyczkami.
  5. Umieść wszystkie kości jednego genotypu jednej myszy w każdym dołku sześciodołkowej płytki z 2 ml α-MEM na lodzie.
    UWAGA: Aby zachować żywotność komórek, kość powinna być przechowywana w tych warunkach krócej niż 1 godzinę.

3. Izolacja (Dzień -1)

  1. Napełnij jedną studzienkę sześciodołkowej płytki 75% etanolem (3 ml), a pozostałe 5 dołków pożywką α-MEM (3 ml).
  2. Umieścić wszystkie kości jednego genotypu w płuczce etanolowej na 15 s i za każdym razem myć kości 5 razy pożywką α-MEM przez 10 s.
  3. Odetnij nasady nożyczkami i włóż igłę strzykawkową 0,45 mm do jamy kostnej i wypłucz szpik z pożywką α-MEM do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
  4. Przepłucz jamę kostną tą samą metodą z drugiego końca kości. Powtórz co najmniej dwa razy, aby dokładnie umyć jamę kostną, aż kość będzie blada.
  5. Odwirować szpik kostny w celu uzyskania osadu komórkowego o temperaturze 800 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant.
  6. Dodać 3 ml buforu do lizy czerwonych krwinek do probówki wirówkowej i delikatnie odpipetować, aby ponownie zawiesić szpik kostny. Trzymaj probówkę wirówkową na lodzie przez 8 minut, aby zrazić czerwone krwinki.
  7. Dodaj 6 ml pożywki α-MEM do probówki wirówkowej, aby zatrzymać lizę komórek. Wirować w temperaturze 500 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut i zasysać supernatant.
  8. Zawiesić ponownie w 3 ml pożywki hodowlanej α-MEM i umieścić komórki na płytce sześciodołkowej (zwykle jedna mysz na studzienkę).
  9. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez noc.

4. Poszycie (Dzień 0)

  1. Przenieść supernatant do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml w celu zebrania nieprzyłączonych komórek następnego ranka.
  2. Wirować w temperaturze 800 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut i odsysać supernatant.
  3. Zawiesić w 4 ml pożywki hodowlanej α-MEM.
  4. Weź 20 μl roztworu komórkowego i wymieszaj z 20 μl błękitu trypanowego. Dodać 10 μl mieszaniny do komory liczenia i uzyskać liczbę komórek na ml roztworu.
  5. Dodać odpowiednią objętość pożywki hodowlanej α-MEM, aby uzyskać roztwór komórkowy o objętości 500 000 komórek/ml.
  6. Dodać 500 μl i 50 μl pożywki indukcyjnej makrofagów szpiku kostnego do każdego dołka odpowiednio płytki 24-dołkowej i 96-dołkowej.
  7. Dodać 500 μl i 50 μl roztworu komórkowego do każdego dołka odpowiednio na płytce 24-dołkowej i 96-dołkowej.
  8. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 3 dni.

5. Zróżnicowanie (dni 3-7)

  1. Trzy dni po posiewie zebrać 50 μl pożywki z każdego dołka płytki 96-dołkowej i zamrozić w temperaturze -20 °C, a następnie odessać pozostałą pożywkę.
  2. Dodać 1 ml i 100 μl pożywki do indukcji osteoklastów do każdego dołka odpowiednio płytki 24-dołkowej i płytki 96-dołkowej.
  3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 dni.
  4. Zebrać 50 μl pożywki z każdej studzienki i odessać pozostałą pożywkę.
  5. Dodaj pożywkę do indukcji osteoklastów do każdej studzienki.
  6. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 dzień.
    UWAGA: W tym momencie duże, wielojądrzaste osteoklasty powinny być widoczne pod odwróconym mikroskopem (Ryc. 2A).
  7. Jeśli osteoklasty nie są widoczne, należy zmienić pożywkę do indukcji osteoklastów i obserwować codziennie, aż osteoklasty będą widoczne.
  8. Zebrać 50 μl pożywki z każdej studzienki 96-dołkowej płytki po utworzeniu osteoklastów.

6. Barwienie kwaśną fosfatazą odporną na winian (TRAP)

UWAGA: Dojrzałe osteoklasty mogą być obecne po 6-7 dniach hodowli in vitro (krok 4).

  1. Odessać podłoże i delikatnie przemyć 3 razy 1x PBS.
  2. Umieścić komórki w każdym dołku płytki 96-dołkowej za pomocą 100 μl roztworu utrwalającego przez 30 s w temperaturze pokojowej.
  3. Po utrwaleniu odessać roztwór utrwalający i delikatnie przemyć 3 razy wodą dejonizowaną podgrzaną do 37 °C. Odsysać wodę dejonizowaną.
  4. Dodać 100 μl barwnika TRAP do każdego dołka na 96-dołkowej płytce i umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut, osłaniając przed światłem.
  5. Po zabarwieniu odessać plamę TRAP i delikatnie zmyć 3 razy wodą dejonizowaną.
  6. Obraz osteoklastów za pomocą odwróconego mikroskopu przy 40-krotnym powiększeniu.

7. Kwantyfikacja aktywności TRAP pożywki hodowlanej

  1. Zebrać 30 μl supernatantu hodowli z każdej studzienki 96-dołkowej płytki z kroku 5.1, 5.4 i 5.8; Jako kontrolę ujemną należy użyć 30 μl niehodowlanej pożywki indukcyjnej osteoklastów. Umieścić próbki na nowej płytce 96-dołkowej.
  2. Dodać 90 μl mieszaniny substratów (1.5.5) do każdego dołka płytki 96-dołkowej.
  3. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 godzinę i chronić przed światłem.
  4. Zatrzymać reakcję, dodając 50 μl 3 M NaOH do każdego dołka płytki 96-dołkowej.
  5. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 405 nm.

8. Western Blotting (zachodnia plama)

UWAGA: Po 6-7 dniach hodowli in vitro na płytce 24-dołkowej, dojrzałe osteoklasty powinny być widoczne.

  1. Zassać pożywkę.
  2. Umyj delikatnie wstępnie schłodzonym 1x PBS 3 razy.
  3. Zasysać PBS.
  4. Dodać 100 μL 1x buforu do lizy SDS zawierającego koktajl inhibitorów proteazy.
  5. Podgrzewać lizaty w temperaturze 105 °C przez 10 minut i wirować w temperaturze 12 000 × g i w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Zebrać supernatanty zawierające białka.
  6. Oddzielić lizaty zawierające 30 μg białka przez 10% SDS-PAGE11, a następnie przenieść do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF).
  7. Zatkaj błony 5% mlekiem beztłuszczowym na 30 minut.
  8. Inkubować błony z anty-Raptor, anty-P-S6, anty-S6, anty-β-aktyną w rozcieńczeniu 1:1 000 w 5% mleku beztłuszczowym w temperaturze 4 °C przez noc.
  9. Płukać membrany roztworem soli fizjologicznej Tris Buffered Saline z Tween-20 (TBST) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Powtórz krok 8.9 dwa razy.
  11. Inkubować błony z przeciwciałami anty-mysim lub króliczym IgG sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (HRP) w rozcieńczeniu 1:5 000 w 5% mleku beztłuszczowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  12. Umyj membrany 3 razy TBST przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  13. W celu detekcji chemiluminescencyjnej dodaj zachodni substrat chemiluminescencyjny HRP na membrany i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odcedź nadmiar podłoża i naświetl plamy na folię rentgenowską.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując niniejszy protokół, w 6. dniu zaobserwowano dużą liczbę olbrzymich osteoklastów; jeśli olbrzymie osteoklasty nie są widoczne, może być wymagany jeden dodatkowy dzień różnicowania osteoklastów (Rycina 1). Pomyślną formację osteoklastów potwierdzono za pomocą barwienia TRAP (Rycina 2A). Osteoklasty stanowiły olbrzymie komórki o kolorze winnej czerwieni/fioletu z więcej niż 3 jądrami. W każdej studni płytki 96-dołkowej z BM...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Test osteoklastogenny jest najczęściej stosowaną metodą izolowania i hodowli osteoklastów in vitro 12,13. Podczas gdy opisano kilka indukcji osteoklastów opartych na RANKL 13,14,15, w niniejszym badaniu opisano protokół z pewnymi modyfikacjami opartymi na poprzednich metodach.

W poprzednim badaniu BMM były posiewane natychmiast po izo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Dr. Minghan Tong i S. Kato za uprzejme dostarczenie odczynników i myszy. Dziękujemy członkom laboratorium Zou za przydatne dyskusje. Praca ta była częściowo wspierana przez granty z programu 973 z chińskiego Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST) [2014CB964704 i 2015CB964503], Programu Badań Klinicznych 9th People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Dziękujemy za pomoc Core Facility for Cell Biology i Core Facility for Chemical Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Myszy Raptorfl/flMyszy
Ctsk-creod S. Kato, Uniwersytet Tokijski, Tokio, Japonia
Gibico15140122
Płodowa surowica cielęcaBioInd04-001-1A
Rekombinowane mysie białko M-CSFR& DQ3U4F9
Rekombinowane mysie białko RANKLR& DQ3TWY5
Bufor do lizy RBCBeyotimeC3702
Błękit trypanowySigma-Aldrich302643
AcetonShanghai Chemical Co., Ltd.
Roztwór cytrynianuSigma-Aldrich915
Roztwór formaldehyduShanghai Chemical Co., Ltd.
Zestaw fosfatazy kwasowej, leukocytów (TRAP)Sigma-Aldrich387A-1KT
Szybki granat GBC Roztwór podstawowySigma-Aldrich3872
Roztwór azotynu soduSigma-Aldrich914
Naftol AS-BI Roztwór fosforanuSigma-Aldrich3871
Roztwór octanuSigma-Aldrich3863
Roztwór winianuSigma-Aldrich3873
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami DulbeccoCorning21-031-CVR
Kwas L-winowySigma-Aldrich251380
Winian sodu dwuzasadowy odwodnienieSigma-Aldrichs4797
GlycineShanghai Chemical Co., Ltd.
MgCl2Shanghai Chemical Co. Ltd.
ZnCl2Shanghai Chemical Co. Ltd.
NaOHShanghai Chemical Co., Ltd.
Substrat fosfatazySigma-AldrichP4744
anti-RaptorCell Signaling Technology2280
białko anty-P-rybosomalne S6 (S235/236)Technologia sygnalizacji komórkowej2317
białko antyrybosomalne S6Technologia sygnalizacji komórkowej2211
anty-β-aktynaSanta Cruz Biotechnologiasc-130300
37% formaldehydXilong naukowa
membrana z polifluorku winylidenu (PVDF)Bio-Rad
Western Chemiluminescent Substrate HRP (ECL)Millipore00000367MSDS
IX71Olympus
EnvisionPerkin Elmer
0,45 mm Strzykawka
nożycowa
Kleszczyk
Jackson Laboratory 013188 prezent α-MEM Corning 10-022-CVR Glutamina Gibico 25030081 Penicylina Streptomycyna do komarów

Bibliografia

  1. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  2. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
  3. Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).
  4. Boyce, B. F. Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts. J Bone Miner Res. 28 (4), 711-722 (2013).
  5. Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells. J Cell Biol. 99 (2), 471-480 (1984).
  6. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
  7. Wong, B. R., et al. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells. J Biol Chem. 272 (40), 25190-25194 (1997).
  8. Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (1), 21-35 (2011).
  9. Bhaskar, P. T., Hay, N. The two TORCs and Akt. Dev Cell. 12 (4), 487-502 (2007).
  10. Dai, Q., et al. Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice. J Biol Chem. 292 (1), 196-204 (2017).
  11. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).
  12. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
  13. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
  14. Tevlin, R., et al. Osteoclast derivation from mouse bone marrow. J Vis Exp. (93), e52056(2014).
  15. Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells. Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).
  16. Hsu, H., et al. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 3540-3545 (1999).
  17. Underwood, J. C. From where comes the osteoclast? J Pathol. 144 (4), 225-226 (1984).
  18. Wein, M. N., et al. Control of bone resorption in mice by Schnurri-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8173-8178 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza oparta na RANKLinaktywacja mTORC1makrofagi szpiku kostnegofosfataza kwaśna odporna na tartranprotokół hodowli komórkowychróżnicowanie osteoklastówdelecja Raptorbarwienie TRAP
Test hodowli osteoklastów szpiku kostnego myszy oparty na RANKL w celu zbadania roli mTORC1 w tworzeniu osteoklastów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.