Artykuł metodologiczny

Wykrywanie krętka boreliozy, Borrelia burgdorferi, u kleszczy za pomocą zagnieżdżonego PCR

22.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56471

⸱

4 lutego 2018

 ,  , 
1Department of Biology, Mount Allison University

W tym artykule

Podsumowanie

Zagnieżdżony PCR to czuła, specyficzna i prosta technika, którą można zastosować do ekstraktów DNA kleszczy w celu zbadania Borrelia burgdorferi, czynnika wywołującego boreliozę. Początkowy eksperyment PCR wykorzystuje startery specyficzne dla genu do generowania długich amplikonów, które następnie stają się matrycami do późniejszej reakcji przy użyciu wewnętrznych starterów.

Streszczenie

Borelioza to poważna infekcja przenoszona przez wektory, wywoływana przez krętki z rodziny Borrelia burgdorferi sensu lato, które są przenoszone na ludzi przez ukąszenia zakażonych kleszczy Ixodes. Podstawowym czynnikiem etiologicznym w Ameryce Północnej jest Borrelia burgdorferi sensu stricto. Wraz z rozszerzaniem się regionów ryzyka geograficznego rozsądne jest wspieranie solidnych programów nadzoru, które mogą mierzyć wskaźniki infekcji kleszczami i przekazywać wyniki lekarzom, weterynarzom i ogółowi społeczeństwa. Technika molekularna zagnieżdżonej reakcji łańcuchowej polimerazy (nPCR) jest od dawna stosowana w tym celu i pozostaje centralnym, niedrogim i solidnym podejściem do wykrywania Borrelia zarówno u kleszczy, jak i dzikich zwierząt.

Ten artykuł demonstruje zastosowanie nPCR do ekstrakcji DNA kleszczy w celu identyfikacji zakażonych próbek. Dwa niezależne cele B. burgdorferi, geny kodujące flagelinę B (FlaB) i białko zewnętrznej powierzchni A (OspA), były szeroko stosowane w tej technice. Protokół obejmuje pobranie kleszczy, ekstrakcję DNA, a następnie wstępną rundę PCR w celu wykrycia każdego z dwóch loci specyficznych dla Borrelii. Późniejsza reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) wykorzystuje produkt pierwszej reakcji jako nową matrycę do generowania mniejszych, wewnętrznych fragmentów amplifikacji. Podejście zagnieżdżone poprawia zarówno specyficzność, jak i czułość konwencjonalnego PCR. Kleszcz jest uważany za pozytywny dla patogenu, gdy wewnętrzne amplikony z obu genów Borrelia można wykryć za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Wprowadzenie

Borelioza (LD) jest najczęstszą infekcją przenoszoną przez wektory na półkuli północnej, a jej zapadalność nadal rośnie1. Ta wyniszczająca choroba jest wywoływana przez krętkowe patogeny kompleksu boreliozy z Lyme (LB) (powszechnie określane jako Borrelia burgdorferi sensu lato, lub s.l.), który historycznie obejmuje dominujący patogen z Ameryki Północnej, B. burgdorferi sensu stricto (s.s), a także B. afzelii oraz B. garinii, które są rozpowszechnione w całej Europie i Azji i stanowią gatunki o rosnącym znaczeniu klinicznym2,3. Bakterie te są przenoszone na ludzi poprzez ukąszenia zainfekowanych kleszczy z rodzaju Ixodes2. Chociaż głównymi wektorami w Ameryce Północnej są I. scapularis i I. pacificus, stwierdzono, że wiele gatunków z tego rodzaju może przenosić i transmitować te bakterie4. U ludzi B. burgdorferi może powodować wieloukładowe objawy obejmujące skórę, stawy, serce, układ nerwowy, gruczoły endokrynne, przewód pokarmowy i narządy wewnętrzne5,6,7,8,9,10. Centrum Kontroli i Prewencji Chorób szacuje obecnie ponad 30 00 nowych przypadków zachorowań ludzi rocznie w Stanach Zjednoczonych1,12. Choć rokowania są często korzystne, gdy choroba zostanie zdiagnozowana i leczona we wczesnych stadiach, badania sugerują, że od 10% do 60% pacjentów, którzy otrzymali zalecany schemat antybiotykoterapii, nadal odczuwało objawy po zakończeniu leczenia, w zjawisku określanym jako zespół poboreliozowy (PTLDS)13,14,15. Ponadto opóźnienia w interwencji klinicznej mogą wynikać z nieświadomości ukąszenia przez kleszcza, nieswoistego przebiegu początkowej choroby oraz niskiej czułości tradycyjnej diagnostyki serologicznej stosowanej na początku infekcji. Brak szybkiego i odpowiedniego leczenia umożliwia progresję objawów, która może przejść w coraz bardziej wyniszczające powikłania16,17. Zapobieganie boreliozie jest zatem kamieniem milowym w zarządzaniu ryzykiem. Strategie walki z tym rosnącym zagrożeniem obejmują rygorystyczne środki nadzoru w celu określenia rozpowszechnienia patogenów u kleszczy oraz zidentyfikowania obszarów geograficznych budzących niepokój.

Niniejszy artykuł demonstruje użyteczność zagnieżdżonej reakcji łańcuchowej polimerazy (nPCR) jako narzędzia do przesiewowego badania molekularnego w celu identyfikacji zakażonych kleszczy. Aby zwiększyć swoistość, dwie Borrelia Geny są wykorzystywane do amplifikacji równoległej. Flagellina B (FlaB) koduje główne białko filamentowe wici18a gen znajduje się na pojedynczym liniowym chromosomie, natomiast lipoproteinowy produkt Białko powierzchniowe A (OspA) pośredniczy w kolonizacji jelita środkowego kleszcza i jest kodowane przez plazmid19,20Przebieg prac składa się z etapu gromadzenia kleszczy, ekstrakcji DNA, a następnie pierwszej rundy PCR w celu wykrycia Borrelialoci specyficzne dla danego gatunku. Następna reakcja PCR wykorzystuje produkt z pierwszej reakcji jako nową matrycę do generowania mniejszych, wewnętrznych fragmentów amplifikacyjnych. Kleszcza uznaje się za dodatni pod kątem Borrelia burgdorferi gdy wewnętrzne amplikony z obu Borrelia Geny można wykryć za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Zarówno technika nPCR, jak i geny docelowe FlaB oraz OspA, są szeroko stosowane w nadzorze ekologicznym i diagnostyce klinicznej krętków boreliozy od początku lat 90. XX wieku21,2,23,24,25. Przed opracowaniem protokołów molekularnych kleszcze oceniano poprzez poddawanie zawartości jelit barwieniu immunofluorescencyjnemu (IF) z użyciem przeciwciał anty-Borrelia, hodowli mikrobiologicznej lub kombinacji tych metod26. Podejścia te obarczone są istotnymi ograniczeniami, takimi jak powolny wzrost i wymagające warunki hodowlane Borrelia27, problemy z wydajnością przeciwciał oraz konieczność posiadania żywych kleszczy do procesu IF21. W późniejszym czasie wdrożono metodę PCR, aby zapewnić szybką, czułą i specyficzną identyfikację zainfekowanych wektorów. Przyniosło to znaczną poprawę w stosunku do tradycyjnej metodologii, w tym możliwość bezpośredniego zastosowania niezależnego od hodowli w różnorodnych typach próbek, takich jak martwe i zarchiwizowane kleszcze, które w przeciwnym razie byłyby nieprzydatne do badań21,2. Zagnieżdżone schematy eksperymentalne dodatkowo poprawiają specyficzność i czułość klasycznej PCR poprzez zastosowanie dwóch odrębnych zestawów starterów specyficznych dla genów w dwóch kolejnych rundach amplifikacji25,28.

Sukces eksperymentalny jest w krytycznym stopniu zależny od strategicznego wyboru genów oraz projektu amplikonów. Aby dokładnie oszacować obecność Borrelia burgdorferi, primery powinny wykrywać odpowiednie patogeny bez reakcji krzyżowej ze spirochetami gorączki nawracającej, należącymi również do rodzaju Borrelia. W przypadku FlaB swoistość tę osiąga się poprzez celowanie w zmienny wewnętrzny region genu, a nie w stosunkowo konserwatywne sekwencje flankujące, które są wspólne dla różnych bakterii (Rycina 1)24,29,30.

Schemat zagnieżdżonej PCR, proces amplifikacji genu FlaB z zastosowaniem starterów: zewnętrznych Forward/Reverse, wewnętrznych Forward/Reverse.
Rysunek 1: Koncepcja nPCR, przedstawiona na przykładzie Borrelia FlaB gen jako cel. Koniec 5' i 3' genu są wspólne dla organizmów wykraczających poza Borrelia burgdorferi s.l., co czyni te regiony nieprzydatnymi do specyficznej oceny patogenów wywołujących boreliozę. Wykorzystując mniej konserwatywne sekwencje wewnętrzne jako cele dla starterów, przeprowadza się dwie rundy PCR w celu wykrycia końcowego amplikonu wewnętrznego. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

W celu oceny ich zdolności różnicowania, wewnętrzne primery FlaB przetestowano na ponad 80 różnych izolatach Borrelia, wykazując, że identyfikują one wyłącznie szczepy związane z chorobą z Lyme24. Dolna granica wykrywalności metody nPCR została udokumentowana na poziomie od sześciu24 do dziesięciu31 bakterii z czystej hodowli, choć czułość można dodatkowo zwiększyć, przeprowadzając analizę Southern blot amplikonu i hybrydyzując go z sondą znakowaną promieniotwórczo lub chemiluminescencyjnie. Połączenie tych technik obniża próg wykrywalności do pojedynczej krętkowca31. W bezpośrednim porównaniu stwierdzono, że konwencjonalna, jednorundowa metoda PCR bez zastosowania sond wykrywała obecność minimum 104 krętkowców31. Należy jednak zauważyć, że czułość analizy będzie niższa w przypadku pracy ze złożonymi próbkami środowiskowymi i klinicznymi, ze względu na dużą ilość niepowiązanego DNA oraz potencjalne substancje inhibicyjne. Wyzwania te można w dużej mierze wyeliminować dzięki zastosowaniu nPCR.

Mimo postępów w technologiach molekularnych w ostatnich dziesięcioleciach, nPCR pozostaje podstawową techniką w nowoczesnych działaniach nadzoru. Przy zachowaniu staranności podczas opracowywania i wykonywania tego protokołu, jest to potężne, elastyczne i stosunkowo proste podejście do wykrywania obecności patogenów w kleszczach będących wektorami.

Protokół

1. Izolacja DNA od kleszczy

  1. Nabywaj kleszcze poprzez zbieranie w terenie lub pasywny nadzór ze strony weterynarzy i osób postronnych. Kleszcze należy zabić przez zamrożenie, umieścić w szczelnie zamkniętej torbie i wysłać w temperaturze pokojowej.
    1. Korzystając z formularza zgłoszeniowego, zbierz informacje o dacie i lokalizacji geograficznej spotkania, statusie załącznika do kleszcza, gatunku gospodarza i niedawnej historii podróży gospodarza.
    2. Ponieważ zagnieżdżony PCR jest z natury podatny na zanieczyszczenie, upewnij się, że przestrzeń robocza laboratorium jest skonfigurowana tak, aby zminimalizować narażenie krzyżowe próbek. Polega to na wykonywaniu różnych elementów protokołu w oddzielnych, dedykowanych przestrzeniach dobrze odizolowanych od siebie, które są dokładnie czyszczone i sterylizowane, oraz upewnieniu się, że wszystkie narzędzia są wolne od zanieczyszczeń.
    3. Po otrzymaniu okazu sfotografuj kleszcza i określ gatunek, stadium rozwoju, płeć i stan obrzęku, porównując go z kluczem identyfikacyjnym32 .
    4. W warunkach aseptycznych przeciąć kleszcza na pół za pomocą sterylnej żyletki lub skalpela i umieścić dwa fragmenty kleszcza w oddzielnych probówkach do mikrowirówki.
  2. Aby wyodrębnić całkowite DNA, należy użyć dowolnej procedury izolacji, która daje matrycę kompatybilną z PCR; ten protokół demonstruje proste podejście oparte na chelatacji.
    1. Zacznij od dodania odpowiedniej objętości (często od 50 do 200 μl) odczynnika chelatacji litycznej do fragmentu kleszcza. Konkretna ilość będzie zależeć od wielkości próbki i statusu obrzęku; Wytyczne powinny być dostarczone przez producenta. Homogenizować za pomocą tłuczka do mikroprobówek.
    2. Próbki inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 60 °C przez 45 minut i krótko wirować.
    3. Odwirować próbki przez 4 minuty przy 16 276 x g (13 300 obr./min) w mikrowirówce stacjonarnej.
    4. Przenieść supernatant do świeżej, znakowanej mikroprobówki zawierającej 50 μl izopropanolu, wymieszać przez odwrócenie i ponownie odwirować, jak w (1.2.3).
    5. Zdekantować supernatant i przepłukać osad DNA 50 μl 70% etanolu.
    6. Usuń nadmiar etanolu za pomocą pipety i pozostaw granulkę do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Aby ponownie zawiesić DNA, dodać 50 μl 1 mM Tris pH 7,0 i inkubować próbki w łaźni wodnej przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C. DNA może być teraz przechowywane w temperaturze -20 °C do przyszłej analizy molekularnej.

2. Zagnieżdżone wykrywanie PCR Borrelia OspA i FlaB.

UWAGA: Przegląd ogólnych zasad i praktyk PCR jest dostarczony przez Lorenz, 201233.

  1. Zsyntetyzować lub otrzymać zewnętrzne i wewnętrzne startery oligonukleotydowe specyficzne dla genu Borrelia. W Tabeli 1 przedstawiono zestawy podkładów, ich odpowiednie rozmiary amplikonów i temperatury topnienia.
Nazwa podkładu Cel genu Sekwencja (5'-3') Rozmiar amplikonu Temperatura wyżarzania FlaB Out Fw Flab gcatcactttcagggtctca 503 punktów bazowych 55°C FlaB Out Rv Flab tggggaacttgattagcctg FlaB w Fw Flab ctttaagagttcatgttggag 447 punktów bazowych 58°C FlaB w Rv Flab tcattgccattgcagattgt Wyjście OspA Fw Protokół OSPA cttgaagttttcaaagaagat 487 punktów bazowych 55°C OspA Out Rv Protokół OSPA caactgctgacccctctaat OspA w trybie wewnętrznym Protokół OSPA acaagagcagacggaaccag 350 punktów bazowych 58°C OspA w Rv Protokół OSPA ttggtgccatttgagtcgta

Tabela 1: Wewnętrzne i zewnętrzne startery do nPCR Borrelia burgdorferiFlaB i OspA.
W praktyce startery FlaB wykrywają B. burgdorferi s.s. i inne blisko spokrewnione genogatunki Borrelia, podczas gdy startery OspA wychwytują tylko B. burgdorferi s.s. Amplifikacja z obu loci wskazywałaby na B. burgdorferi. s.s.

  1. Wstępnie wysterylizuj szafkę PCR światłem UV i 70% etanolem.
    UWAGA: Aby zminimalizować potencjalne zanieczyszczenie próbki, to miejsce pracy powinno być oddzielone od miejsca sekcji kleszczy, ekstrakcji DNA i elektroforezy żelowej.
    1. Do początkowej serii PCR należy użyć zewnętrznych starterów w połączeniu z matrycą DNA odzyskaną w kroku 1.0 powyżej i ustawić mieszaninę reakcyjną zgodnie z opisem w Tabeli 2. Równolegle należy przeprowadzić kontrole pozytywne składające się ze zweryfikowanego DNA Borrelia oraz przebiegi kontroli negatywnej, w tym reakcje bez matrycy w celu wykrycia zanieczyszczenia odczynnikami i aerozolami. Dodaj DNA na końcu, aby zminimalizować potencjalne zanieczyszczenie odczynników. Upewnij się, że każda probówka jest zamknięta przez cały czas, gdy odczynniki nie są dodawane i zamykaj probówki natychmiast po dodaniu DNA i przed otwarciem innych probówek.
    2. Zaprogramować termocykler w następujący sposób: 95 °C przez 5 minut, 40 cykli po 95 °C przez 15 s, temperatura wyżarzania przez 30 s, 72 °C przez 45 s; 72 °C przez 5 minut; i utrzymać w temperaturze 4 °C.
  2. Przeprowadzić drugą rundę PCR podobną do pierwszej reakcji, z wyjątkiem użycia wewnętrznych starterów z 2 μl pierwszego produktu PCR (wyprodukowanego w 2.2.2).
    UWAGA: Objętości reakcji są ponownie podane w tabeli 2. Należy zachować ostrożność w celu uniknięcia zanieczyszczenia krzyżowego amplikonów, zapewniając, że matrycowy DNA jest dodawany jako ostatni i że tylko probówki odpowiadające jednej próbce są otwarte w tym samym czasie.
      składnik PCR # 1 Woluminy PCR # 2 Tomy Taq Polymerase Master Mix 2X 12,5 μl 12,5 μl Woda wolna od nukleaz 8,5 μL 8,5 μL 10 μM Startery do przodu i do tyłu 1,0 μl Podkłady zewnętrzne 1,0 μl Podkłady wewnętrzne Szablon DNA 2,0 μl z ekstrakcji próbki (1.2.7) 2,0 μl z 1. rundy PCR (2.2.2) Tabela 2: Mieszaniny reakcyjne PCR do pierwszej i drugiej amplifikacji.
     
    1. Zaprogramuj termocykler jak poprzednio, ale dostosuj temperaturę wyżarzania, aby dostosować się do wewnętrznych starterów (patrz Tabela 1).

3. Elektroforeza i obrazowanie w żelu agarozowym

UWAGA: Podstawowe instrukcje dotyczące rozdzielania DNA za pomocą elektroforezy można znaleźć w Lee et al., 201234.

  1. Przygotuj 1,2% żel agarozowy przy użyciu 20X buforu SB (0,2 M NaOH, 0,8 M kwasu borowego pH 8), rozcieńczonego do 1X i dodaj około 5 μl barwnika DNA przed nalaniem, jeśli pożądane jest wstępne barwienie żelu.
  2. Załadować 10 μl produktu z drugiej (wewnętrznej) reakcji PCR z każdej próbki doświadczalnej i kontrolnej, wraz z drabinką 100 pz (5 μl).
    1. Elektroforeza przez 1 godzinę przy napięciu 107 V (5V/cm).
  3. Przeglądaj i dokumentuj żel za pomocą transiluminatora oraz powiązanej kamery i oprogramowania.

Wyniki

nPCR to eleganckie podejście pozwalające zwiększyć swoistość i czułość wykrywania patogenów, szczególnie podczas badania złożonych próbek środowiskowych. Jak przedstawiono na Rysunku 1, dwie rundy PCR nakierowane na strategiczny region locus Borrelia FlaB (oraz OspA, nieprzedstawiony na rysunku) mogą potwierdzić obecność bakterii Borrelia burgdorferi poprzez generowanie krótkich amplikonów wewnętrznych. Po rozdziale za pomocą elektroforezy w żelu produkty reakcji dla FlaB i OspA z każdego kleszcza mogą zostać wizualnie ocenione i porównane z kontrolami. Na Rysunku 2 w górnej części każdego żelu zamieszczono unikalne identyfikatory próbek, a kontrole bez matrycy i kontrole aerozolu znajdują się odpowiednio po prawej i lewej stronie, obok markerów wielkości.

Wyraźne prążki amplikonów są widoczne w wybranych próbkach eksperymentalnych i łatwo można je odróżnić od nadmiaru starterów oraz resztkowego DNA (Rysunek 2). Zgodnie z przyjętymi zasadami planowania eksperymentu, kleszcz jest uznawany za pozytywny pod kątem Borrelia, gdy równoległe kontrole negatywne nie wykazują amplifikacji, a wewnętrzne amplikony są wytwarzane z starterów zarówno dla FlaB, jak i OspA. W tym przypadku próbki T907, T604 i T606 spełniły kryteria nadzoru dla patogenu boreliozy (Rysunek 2). W przeciwieństwie do nich, próbka T923 była pozytywna tylko dla OspA, co może mieć kilka możliwych wyjaśnień: A) kleszcz, z którego pochodziła próbka, był negatywny pod kątem Borrelia, ale preparat PCR OspA (zewnętrzny lub wewnętrzny) został przypadkowo zanieczyszczony DNA matrycowym (należy zauważyć, że systematyczne zanieczyszczenie odczynników zostało wykluczone za pomocą kontroli negatywnych), B) kleszcz był nosicielem Borrelia wywołującej boreliozę, ale niewielka ilość matrycy lub błąd eksperymentalny uniemożliwiły amplifikację FlaB, lub C) obecny był organizm zawierający konserwatywną sekwencję OspA, lecz pozbawiony Flagellin lub posiadający niewystarczające podobieństwo w docelowym regionie FlaB, aby mogło dojść do przyłączenia starterów. Rzeczywiście, podobieństwa sekwencji OspA odnotowano u wielu organizmów, w tym u roślin i zwierząt28. Odwrotna sytuacja, czyli amplifikacja bardziej konserwatywnego genu Flagellin, ale nie genu OspA, mogłaby wskazywać na pokrewny gatunek Borrelia. W praktyce protokół ten daje więcej wyników pojedynczo pozytywnych dla OspA niż dla starterów FlaB, co sugeruje, że scenariusz „A” jest najmniej prawdopodobnym wyjaśnieniem. Jednak bez dalszej analizy eksperymentalnej spornej próbki nie jest możliwe ustalenie źródła pojedynczo pozytywnego wyniku. Zwiększenie liczby powtórzeń technicznych dla próbek niejednoznacznych może pomóc w ustaleniu ich rzeczywistego statusu, ponieważ zanieczyszczenia, które zostały przypadkowo wprowadzone do poprzednich reakcji, nie będą obecne w zarchiwizowanym DNA. Jeśli jednak kolejne reakcje z tymi starterami nie przyniosą rozstrzygających wyników, za pomocą PCR można zbadać inne loci Borrelia. Amplikony wygenerowane w tych reakcjach można również zsekwencjonować i porównać między izolatami, aby pomóc w identyfikacji oraz ocenie stopnia dywergencji szczepów. Sapi i współpracownicy przedstawili przykład takiego schematu postępowania z wykorzystaniem ludzkich próbek klinicznych35.

Biorąc pod uwagę wszystkie czynniki, szacuje się, że opisany protokół i kryteria interpretacyjne wykazują odsetek wyników fałszywie dodatnich oraz fałszywie ujemnych wynoszący odpowiednio 0,17% i 0,063%.

Żel elektroforetyczny, prążki DNA, drabinka, 350 bp, 47 bp, OspA FlaB, analiza biologii molekularnej.
Rysunek 2Wykrywanie Borrelia burgdorferi w pojedynczych kleszczach za pomocą nPCR z FlaB i OspA. Kody przypisane do każdego kleszcza są przedstawione w górnej części żeli, a ich tożsamość jest wyrównana pionowo w celu wskazania detekcji OspA i FlaB w każdej próbce. Ścieżki oznaczone literą B po lewej stronie obrazu reprezentują kontrole bez matrycy, natomiast A (ścieżki po prawej stronie) to kontrole aerozolu służące do wykrywania zanieczyszczeń środowiska laboratoryjnego. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Przez dziesięciolecia stosowania techniki oparte na PCR konsekwentnie udowadniały swoją wartość w wykrywaniu Borrelia z okazów stawonogów i ssaków, niezależnie od tego, czy Borrelia pochodzi ze środowiska czy klinicznego. PCR oferuje wiele ulepszeń w porównaniu z istniejącymi wcześniej podejściami do nadzoru. Warto zauważyć, że nie jest on zależny od rozwoju i działania odczynników przeciwciał, a zamiast tego może być łatwo dostosowany do wykrywania nowych celów zainteresowania po prostu poprzez modyfikację sekwencji starterów. PCR umożliwia również ocenę wielu loci równolegle, niezależnie lub za pomocą reakcji multipleksowej. Może być stosowany do różnych próbek wejściowych, w tym świeżych i archiwalnych kleszczy22, płynów ustrojowych zwierząt lub ludzi oraz wyciętych tkanek25. PCR daje również amplikony, które można dalej przetwarzać, na przykład poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym, hybrydyzację sondą lub sekwencjonowanie, aby zapewnić lepszy wgląd w tożsamość drobnoustrojów21.

Jako narzędzie kliniczne, PCR jest koncepcyjnie lepszy od standardowej diagnostyki serologicznej, ponieważ zapewnia bezpośrednie wskazanie obecności bakterii, a nie opiera się na odpowiedzi immunologicznej gospodarza jako drugorzędnej miary infekcji. Jednak borelioza z Lyme wiąże się ze stosunkowo niewielkim obciążeniem mikrobiologicznym (<50 organizmów/ml moczu lub osocza) i przejściową krętkami, która może prowadzić do fałszywie ujemnych wyników25. Czułość tej techniki w klinice różni się znacznie w zależności od rodzaju tkanki, stadium infekcji i stanu próbki, spadając od 12,5% do 62% w istniejących badaniach krwi, płynu mózgowo-rdzeniowego i tkanki poddanej biopsji36. Ograniczenia czułości molekularnej nie stanowią problemu, jeśli PCR jest przeprowadzany po hodowli bakteryjnej, jednak odzyskanie żywych krętków z próbek klinicznych okazało się podobnie trudne. Dopiero niedawno protokoły zostały zoptymalizowane pod kątem wyższej wydajności35. Tymczasem jelito zakażonego dorosłego kleszcza może zawierać średnio od 2 000 do ponad 50 000 Borrelia 37,38,39, co mieści się w zakresie wykrywania nPCR. W związku z tym protokół dobrze nadaje się do działań związanych z nadzorem nad kleszczami.

Pomimo wielu zalet, nPCR stwarza pewne wyzwania, a zdolność tej techniki do dokładnego zgłaszania infekcji kleszczami zależy zatem od strategicznej selekcji genów i amplikonów, skrupulatnych procesów eksperymentalnych, które odzyskują wysokiej jakości DNA z próbek, jednocześnie minimalizując narażenie krzyżowe próbek, oraz stosowania odpowiednich kontroli, które mogą zgłaszać zanieczyszczenia w środowisku laboratoryjnym i odczynnikach. Przed przystąpieniem do jakichkolwiek eksperymentów zakres i intencje badań powinny być jasno określone, tak aby można było wybrać odpowiednie loci genetyczne i ich regiony. Jeśli celem jest zapewnienie bezstronnego badania przesiewowego dla wywołującego boreliozę kompleksu Borrelia burgdorferi s.l., należy stworzyć startery w celu wykrycia wszystkich powiązanych szczepów o podobnym powinowactwie i skuteczności amplifikacji, bez wychwytywania niepowiązanych organizmów25. Nowe startery mogą być projektowane i oceniane in silico przy użyciu narzędzi programowych, takich jak Primer-BLAST40, chociaż powinny być również walidowane eksperymentalnie w stosunku do standardowych izolatów referencyjnych przed zastosowaniem do niescharakteryzowanych próbek. Celem procedury ekstrakcji DNA jest odzyskanie nienaruszonej matrycy drobnoustrojów z mieszanej próbki środowiskowej (homogenat kleszcza). Opcjonalnym krokiem przed przystąpieniem do PCR jest ocena integralności wyekstrahowanego DNA. Dodatkowo można skonfigurować równoległe reakcje, aby celować w gen porządkowy u kleszcza. Ta ostatnia metoda może również wskazywać na obecność inhibitorów w mieszaninie reakcyjnej, co zwiększa pewność, że negatywne reakcje Borrelia są spowodowane brakiem organizmu, a nie obecnością zanieczyszczenia hamującego.

Zwiększona czułość metody zagnieżdżonej reakcji PCR odbywa się kosztem potencjalnego zanieczyszczenia, które generuje wyniki fałszywie dodatnie. Egzogenny szablon może być wprowadzany do próbki podczas sekcji kleszczy i odzyskiwania DNA lub w procesie ustawiania zewnętrznych i wewnętrznych reakcji amplifikacji. Dlatego szczególnie ważne jest przestrzeganie protokołów najlepszych praktyk w zakresie PCR, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego matrycą lub amplikonem. Obejmują one stosowanie oddzielnych stanowisk pracy z niezależnymi przepływami powietrza, hermetyzację w komorach PCR i bezpieczeństwa biologicznego, w stosownych przypadkach, dokładne chemiczne i fizyczne czyszczenie i sterylizację powierzchni i odczynników oraz ostrożne obchodzenie się z DNA41. Kontrole bez szablonów są również niezbędne do identyfikacji zanieczyszczenia odczynników podstawowych. Szczególną podatnością nPCR jest obsługa amplikonów, która ma miejsce podczas przenoszenia produktów pierwszej reakcji do drugiego naczynia PCR. Ponieważ docelowe DNA zostało już poddane wykładniczemu wzbogaceniu w próbki dodatnie, etap ten jest szczególnie podatny na zanieczyszczenie krzyżowe, a w celu obejścia tego ograniczenia opracowano protokół nPCR z jedną probówką. W tym podejściu oba zestawy starterów dla danego genu są dodawane razem do probówki reakcyjnej, która pozostaje szczelnie zamknięta dla obu rund PCR31. Zewnętrzne i wewnętrzne pary starterów muszą być termodynamicznie różne, tak aby zewnętrzna para wzmacniała matrycę w wysokiej temperaturze wyżarzania, która jest zaporowa dla wewnętrznych starterów. W drugiej rundzie temperatura wyżarzania jest obniżana, aby dostosować się do pary wewnętrznej. Nie tylko pozwala to ominąć potencjalnie mylący krok, ale także pozwala na zastosowanie dodatkowych środków zapobiegających skażeniu31,42. Jednak ta modyfikacja może poświęcić pewną czułość testu. Niezależnie od przyjętego podejścia, zwiększenie liczby kontrprób technicznych przeprowadzanych niezależnie na próbce pomoże w identyfikacji fałszywych zanieczyszczeń.

Techniki molekularne nadal ewoluują od czasu wprowadzenia nPCR, a te nowsze podejścia oferują pewne korzyści w porównaniu z oryginalnymi projektami, choć przy zwiększonych kosztach finansowych. Jak sama nazwa wskazuje, ilościowy PCR (qPCR lub real time (RT)-PCR) pozwala na wyliczenie patogenów w próbce, podczas gdy konwencjonalne techniki mają charakter jakościowy43. Czułość qPCR jest podobno podobna do czułości nPCR38, chociaż może się wahać w zależności od charakterystyki startera28. Wariant qPCR, który wykorzystuje radiolatarnie molekularne (MB) zamiast konwencjonalnych sond TaqMan, również okazał się obiecujący w wykrywaniu Borrelia w próbkach klinicznych 44,45,46. Ze względu na swoją unikalną strukturę drugorzędową, latarnie molekularne podobno wytwarzają niższą fluorescencję tła i wyższe legalne sygnały, zapewniając w ten sposób lepszą czułość47. Oceny przedkliniczne sugerują potencjalny próg wykrywalności od jednego do dziesięciu krętków44,45. Co więcej, technika ta została z powodzeniem zastosowana w reakcjach multipleksowych w celu jednoczesnego wykrywania genugospodarza 44 u ssaków i innych patogenów przenoszonych przez kleszcze45, co nie jest tak łatwo osiągalne w przypadku nPCR. Inne modyfikacje projektu obejmują technologię kropelkowego cyfrowego PCR (ddPCR), która może określić ilościowo DNA bez użycia krzywej standardowej39,48. Dolna granica wykrywalności tej techniki dla Borrelia wynosi również około dziesięciu krętków/próbkę39. W porównaniu z nPCR, metody te mają również tę zaletę, że zmniejszają ryzyko zanieczyszczenia, ponieważ wymagają tylko jednego protokołu amplifikacji.

Jeśli celem nadzoru jest natomiast profilowanie zróżnicowanej zawartości bakterii w kleszczu, atrakcyjną opcją jest metagenomiczny 16S rRNA49. Chociaż takie podejście jest bardziej kosztowne, wymaga specjalistycznych sekwenatorów DNA, których nie ma we wszystkich laboratoriach biologii molekularnej, i wymaga bardziej wyrafinowanej interpretacji opartej na bioinformatyce, może uchwycić szerokie spektrum drobnoustrojów, aby dokładniej odzwierciedlić obciążenie patogenem wektora.

Podczas gdy qPCR i jego pochodne są metodami z wyboru do zastosowań ilościowych, a badania przesiewowe metagenomiki dostarczają szerokich inwentaryzacji mikrobiomu kleszczy, ukierunkowane wysiłki w zakresie nadzoru często dotyczą binarnego raportowania obecności lub braku jednego lub kilku patogenów w wektorze. W takich okolicznościach te nowsze, bardziej wyszukane podejścia mogą wprowadzić niepotrzebną złożoność i obciążenie finansowe do procesu. Z tych powodów nPCR przetrwał próbę czasu jako kluczowa technika w testowaniu kleszczy.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Kami Harris za projekt podkładu, Ashley McKibbon i Jessice Thomas-Ebbett za filmowanie, a także Johnowi Blakely'emu, Alexandrze Foley-Eby, Chrisowi Langleyowi, Julie Lewis, Kelsey McIntyre, Ashley McKibbon, Chrisowi Zinckowi i psu Rosie za pojawienie się w filmie. A. M. K. był wspierany przez Kanadyjską Fundację Badań nad Boreliozą, a finansowanie projektu zapewniła Kanadyjska Rada ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC). M. K. B. W. otrzymał finansowanie wynagrodzeń z New Brunswick Innovation Foundation (NBIF).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
LabGard Class II, Typ A2 Szafa bezpieczeństwa biologicznegoNuaireES AIR NU-543 
ŻyletkiVWR55411-050grubości 0,22 mm
(mikroprobówki 1,5 ml)Axygen311-08-051
AquaGenomic MultiTarget Pharmaceuticals2030Odczynnik do ekstrakcji DNA
Tłuczek do mikroprobówekDiamedDIATEC610-1551Przeznaczony do probówek 1,5 ml
Łaźnia wodna - Isotemp 202Fishse Scientific15-462-2
VortexLabnetS0100 Spektrauga CAN
24D Cyfrowa mikrowirówkaLabnetC2400
IzopropanolSigma-Aldrich190764
BIS-TRISSigma-AldrichB9754
Synteza starterówSzafka Sigma-AldrichOLIGO
PCRMisonixPCR6-482
Probówka PCR z dołączonymi płaskimi nakrętkami 0,2 mlVWR20170-012
GoTaq Green Master Mix 2xPromegaM7123
Woda wolna od nukleazPromegaM7123Woda jest dostarczana z GTG
Spectrafuge MiniLabnetC1301
SYBR Bezpieczne barwienie DNA 10 000X StężenieEDVOTEK608
Froggarose LE (Agaroza klasy biologii molekularnej)FroggaBioA87-500G
GD 100 bp Drabinka DNAFroggaBioDM001-R500 
Zasilacz do elektroforezy VWRVWR 105EC Apparatus Corporation
Fluor-S MultiImager BioRad170-7700 (numer seryjny 433B0154)
Ilość One Oprogramowanie do analizy 1-D (V. 4.5.2)BioRad1709600
Rurki do mikrofuge o

Bibliografia

  1. Schotthoefer, A. M., Frost, H. M. Ecology and epidemiology of Lyme borreliosis. Clin. Lab. Med. 35 (4), 723-743 (2015).
  2. Franke, J., Hildebrandt, A., Dorn, W. Exploring gaps in our knowledge on Lyme borreliosis spirochaetes - Updates on complex heterogeneity, ecology, and pathogenicity. Ticks Tick Borne Dis. 4 (1-2), 11-25 (2013).
  3. Rudenko, N., Golovchenko, M., Vancova, M., Clark, K., Grubhoffer, L., Oliver, J. H. Jr Isolation of live Borrelia burgdorferi sensu lato spirochaetes from patients with undefined disorders and symptoms not typical for Lyme borreliosis. Clin. Microbiol. Infect. 22 (3), 267.e9-267.e15 (2016).
  4. Scott, J. D., Clark, K. L., Anderson, J. F., Foley, J. E., Young, M. R., Durden, L. A. Lyme Disease Bacterium, Borrelia burgdorferi Sensu Lato, Detected in Multiple Tick Species at Species at Kenora, Ontario, Canada. J Bacteriol Parasitol. 08 (01), 1-10 (2017).
  5. Sperling, J., Middelveen, M., Klein, D., Sperling, F. Evolving perspectives on lyme borreliosis in Canada. Open Neurol J. 6, 94-103 (2012).
  6. Pachner, A. R. Early disseminated Lyme disease: Lyme meningitis. Am. J. Med. 98 (Supplement 1), 30S-43S (1995).
  7. Mikkilä, H. O., Seppälä, I. J., Viljanen, M. K., Peltomaa, M. P., Karma, A. The expanding clinical spectrum of ocular lyme borreliosis. Ophthalmology. 107 (3), 581-587 (2000).
  8. Mc Causland, F. R., Niedermaier, S., Bijol, V., Rennke, H. G., Choi, M. E., Forman, J. P. Lyme disease-associated glomerulonephritis. Nephrol. Dial. Transplant. 26 (9), 3054-3056 (2011).
  9. Tunev, S. S., Hastey, C. J., Hodzic, E., Feng, S., Barthold, S. W., Baumgarth, N. Lymphoadenopathy during Lyme Borreliosis Is Caused by Spirochete Migration-Induced Specific B Cell Activation. PLoS Pathog. 7 (5), e1002066-e1002014 (2011).
  10. Kostić, T., et al. Manifestations of Lyme carditis. Int. J. Cardiol. 232, 24-32 (2017).
  11. Hinckley, A. F., et al. Lyme Disease Testing by Large Commercial Laboratories in the United States. Clin. Infect. Dis. 59 (5), 676-681 (2014).
  12. Nelson, C. A., et al. Incidence of Clinician-Diagnosed Lyme Disease, United States 2005-2010. Emerg. Infect. Dis. 21 (9), 1625-1631 (2015).
  13. Aucott, J. N., Rebman, A. W., Crowder, L. A., Kortte, K. B. Post-treatment Lyme disease syndrome symptomatology and the impact on life functioning: is there something here? Qual Life Res. 22 (1), 75-84 (2012).
  14. Aucott, J. N., Crowder, L. A., Kortte, K. B. Development of a foundation for a case definition of post-treatment Lyme disease syndrome. Int. J. Infect. Dis. 17 (6), e443-e449 (2013).
  15. Adrion, E. R., Aucott, J., Lemke, K. W., Weiner, J. P. Health care costs, utilization and patterns of care following Lyme disease. PLoS ONE. , (2015).
  16. Cameron, D. J. Consequences of treatment delay in Lyme disease. Journal of Evaluation in Clinical Practice. 13 (3), 470-472 (2007).
  17. Johnson, L., Aylward, A., Stricker, R. B. Healthcare access and burden of care for patients with Lyme disease: a large United States survey. Health policy. 102 (1), 64-71 (2011).
  18. Motaleb, M. A., et al. Borrelia burgdorferi periplasmic flagella have both skeletal and motility functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (20), 10899-10904 (2000).
  19. Rosa, P. A., Tilly, K., Stewart, P. E. The burgeoning molecular genetics of the Lyme disease spirochaete. Nat. Rev. Microbiol. 3 (2), 129-143 (2005).
  20. Kenedy, M. R., Lenhart, T. R., Akins, D. R. The role of Borrelia burgdorferi outer surface proteins. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 66 (1), 1-19 (2012).
  21. Persing, D. H., Telford, S. R., Spielman, A., Barthold, S. W. Detection of Borrelia burgdorferi infection in Ixodes dammini ticks with the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 28 (3), 566-572 (1990).
  22. Persing, D. H., et al. Detection of Borrelia burgdorferi DNA in museum specimens of Ixodes dammini ticks. Science. 249 (4975), 1420-1423 (1990).
  23. Wise, D. J., Weaver, T. L. Detection of the Lyme disease bacterium, Borrelia burgdorferi, by using the polymerase chain reaction and a nonradioisotopic gene probe. J. Clin. Microbiol. 29 (7), 1523-1526 (1991).
  24. Johnson, B. J., Happ, C. M., Mayer, L. W., Piesman, J. Detection of Borrelia burgdorferi in ticks by species-specific amplification of the flagellin gene. Am. J. Trop. Med. Hyg. 47 (6), 730-741 (1992).
  25. Schmidt, B. L. PCR in laboratory diagnosis of human Borrelia burgdorferi infections. Clin. Microbiol. Rev. 10 (1), 185-201 (1997).
  26. Ogden, N. H., et al. Ixodes scapularis ticks collected by passive surveillance in Canada: analysis of geographic distribution and infection with Lyme borreliosis agent Borrelia burgdorferi. J. Med. Entomol. 43 (3), 600-609 (2006).
  27. Doern, G. V. Detection of selected fastidious bacteria. Clin. Infect. Dis. 30 (1), 166-173 (2000).
  28. Nolte, O. Nucleic Acid Amplification Based Diagnostic of Lyme (Neuro-)borreliosis - Lost in the Jungle of Methods, Targets, and Assays? Open Neurol J. 6 (1), 129-139 (2012).
  29. Wallich, R., Moter, S. E., Simon, M. M., Ebnet, K., Heiberger, A., Kramer, M. D. The Borrelia burgdorferi flagellum-associated 41-kilodalton antigen (flagellin): molecular cloning, expression, and amplification of the gene. Infect. Immun. 58 (6), 1711-1719 (1990).
  30. Picken, R. N. Polymerase chain reaction primers and probes derived from flagellin gene sequences for specific detection of the agents of Lyme disease and North American relapsing fever. J. Clin. Microbiol. 30 (1), 99-114 (1992).
  31. Picken, M. M., Picken, R. N., Han, D., Cheng, Y., Strle, F. Single-tube nested polymerase chain reaction assay based on flagellin gene sequences for detection ofBorrelia burgdorferi sensu lato. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15 (6), 489-498 (1996).
  32. Keirans, J. E., Litwak, T. R. Pictorial key to the adults of hard ticks, family Ixodidae (Ixodida: Ixodoidea), east of the Mississippi River. J. Med. Entomol. 26 (5), 435-448 (1989).
  33. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J Vis Exp. (63), e3998(2012).
  34. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923(2012).
  35. Sapi, E., Pabbati, N., Datar, A., Davies, E. M., Rattelle, A., Kuo, B. A. Improved culture conditions for the growth and detection of Borrelia from human serum. Int J Med Sci. 10 (4), 362-376 (2013).
  36. Waddell, L. A., Greig, J., Mascarenhas, M., Harding, S., Lindsay, R., Ogden, N. The Accuracy of Diagnostic Tests for Lyme Disease in Humans, A Systematic Review and Meta-Analysis of North American Research. PLoS ONE. 11 (12), e0168613-e0168623 (2016).
  37. Brunet, L. R., Spielman, A., Telford, S. R. III Density of Lyme disease spirochetes within deer ticks collected from zoonotic sites. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53 (3), 300-302 (1995).
  38. Wang, G., et al. Real-time PCR for simultaneous detection and quantification of Borrelia burgdorferi in field-collected Ixodes scapularis ticks from the Northeastern United States. Appl. Environ. Microbiol. 69 (8), 4561-4565 (2003).
  39. King, J. L., Smith, A. D., Mitchell, E. A., Allen, M. S. Validation of droplet digital PCR for the detection and absolute quantification of Borrelia DNA in Ixodes scapularis ticks. Parasitology. 144 (4), 359-367 (2017).
  40. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (1), 134(2012).
  41. Kwok, S., Higuchi, R. Avoiding false positives with PCR. Nature. 339 (6221), 237-238 (1989).
  42. Rys, P. N., Persing, D. H. Preventing false positives: quantitative evaluation of three protocols for inactivation of polymerase chain reaction amplification products. J. Clin. Microbiol. 31 (9), 2356-2360 (1993).
  43. Pahl, A., Kühlbrandt, U., Brune, K., Röllinghoff, M., Gessner, A. Quantitative detection of Borrelia burgdorferi by real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 37 (6), 1958-1963 (1999).
  44. Saidac, D. S., Marras, S. A. E., Parveen, N. Detection and quantification of Lyme spirochetes using sensitive and specific molecular beacon probes. BMC Microbiol. 9 (1), 43(2009).
  45. Chan, K., Marras, S. A. E., Parveen, N. Sensitive multiplex PCR assay to differentiate Lyme spirochetes and emerging pathogens Anaplasma phagocytophilum and Babesia microti. BMC Microbiol. 13 (1), 295(2013).
  46. Schlachter, S., Chan, K., Marras, S. A. E., Parveen, N. Detection and Differentiation of Lyme Spirochetes and Other Tick-Borne Pathogens from Blood Using Real-Time PCR with Molecular Beacons. Methods Mol. Biol. 1616, 155-170 (2017).
  47. Wang, L., Blasic, J. R. Jr, Holden, M. J., Pires, R. Sensitivity comparison of real-time PCR probe designs on a model DNA plasmid. Anal. Biochem. 344 (2), 257-265 (2005).
  48. Sze, M. A., Abbasi, M., Hogg, J. C., Sin, D. D. A Comparison between Droplet Digital and Quantitative PCR in the Analysis of Bacterial 16S Load in Lung Tissue Samples from Control and COPD GOLD 2. PLos ONE. 9 (10), e110351-e110356 (2014).
  49. Sperling, J. L., et al. Comparison of bacterial 16S rRNA variable regions for microbiome surveys of ticks. Ticks Tick Borne Dis. , 1-9 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Nadz r nad kleszczamiekstrakcja DNAgen flagelliny Bbia ko powierzchniowe Aelektroforeza w elu agarozowymzbieranie kleszczyprzesiew molekularny
Wykrywanie krętka boreliozy, Borrelia burgdorferi, u kleszczy za pomocą zagnieżdżonego PCR
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.