Zastosowanie szybkiej mikroskopii superrozdzielczej SPEED w żywej rzęsce pierwotnej

Summary

Ostatnio zmapowaliśmy trójwymiarowe (3D) przestrzenne lokalizacje tras transportowych dla różnych białek przemieszczających się wewnątrz rzęsek pierwotnych w żywych komórkach. W tym artykule szczegółowo opisano konfigurację eksperymentalną, proces pobierania próbek biologicznych i analizy danych dla podejścia do obrazowania fluorescencji 3D o wysokiej rozdzielczości, nowo zastosowanego w żywych rzęskach pierwotnych.

Abstract

Rzęska pierwotna jest wypukłością opartą na mikrotubulach na powierzchni wielu komórek eukariotycznych i zawiera unikalny zestaw białek, które pełnią kluczową rolę w ruchliwości komórek i sygnalizacji. Ponieważ rzęski nie są zdolne do syntezy własnego białka, prawie 200 unikalnych białek rzęskowych musi być transportowanych między cytozolem a rzęskami pierwotnymi. Jednak mapowanie trójwymiarowych (3D) lokalizacji szlaków transportu tych białek w żywych rzęskach pierwotnych nadal stanowi wyzwanie techniczne ze względu na ograniczenia obecnie istniejących technik. Aby sprostać temu wyzwaniu, niedawno opracowaliśmy i zastosowaliśmy szybką wirtualną mikroskopię 3D o wysokiej rozdzielczości, zwaną jednopunktową mikroskopią subdyfrakcyjną wzbudzenia krawędziowego (SPEED), w celu określenia przestrzennej lokalizacji 3D szlaków transportowych zarówno dla białek cytozolowych, jak i błonowych w pierwotnych rzęskach żywych komórek. W tym artykule zademonstrujemy szczegółową konfigurację mikroskopii SPEED, przygotowanie komórek wyrażających białka rzęskowe znakowane białkiem fluorescencyjnym, śledzenie pojedynczych cząsteczek pojedynczych białek w żywej rzęsce w czasie rzeczywistym oraz osiągnięcie przestrzennych map gęstości prawdopodobieństwa 3D tras transportu białek rzęskowych.

Introduction

Od czasu stwierdzenia przez Ernsta Abbego w 1873 roku, uważa się, że rozdzielczość konwencjonalnej mikroskopii świetlnej jest ograniczona do około 200 nm z powodu dyfrakcji światła z obiektywu^1,2. Obecnie techniki mikroskopii świetlnej o wysokiej rozdzielczości przełamują to ograniczenie i umożliwiają rejestrowanie dynamicznych obrazów o rozdzielczości subdyfrakcyjnej (< 200 nm). Techniki te ogólnie dzielą się na dwie szerokie kategorie: podejścia oparte na mikroskopii wymuszonej deprywatacji emisji (STED), które generują objętość oświetlenia subdyfrakcyjnego z powodu nieliniowej odpowiedzi optycznej fluoroforów w próbkach³; oraz techniki superrozdzielcze oparte na mikroskopii świetlnej aktywowanej fotoaktywacją (PALM) i stochastycznej mikroskopii rekonstrukcyjnej optycznej (STORM), które wykorzystują funkcje matematyczne do lokalizacji centroidów fluoroforów, a następnie rekonstytucji tych centroidów w celu utworzenia obrazów o wysokiej rozdzielczości^4,5. Obecnie, ze względu na stosunkowo nieskomplikowaną konfigurację optyczną, PALM i STORM są szeroko stosowane poprzez aktywację tylko niewielkiego podzbioru fluoroforów w każdej klatce długiego filmu przedstawiającego preparat biologiczny. Pozwala to na dokładniejszą lokalizację poprzez dopasowanie gaussowskie 2D plamki fluorescencyjnej, zwanej funkcją rozproszenia punktowego (PSF), białek znakowanych fluorescencyjnie w każdej klatce wideo. Lokalizacja 2D każdej cząsteczki znakowanej fluorescencyjnie może być następnie nałożona na pojedynczą płaszczyznę obrazowania w celu uzyskania obrazu preparatu biologicznego o wysokiej rozdzielczości^1,2. Chociaż te lokalizacje pojedynczych cząsteczek i superrozdzielcze podejścia do mikroskopii z pewnością zrewolucjonizowały sposób obrazowania próbek biologicznych, nadal istnieją wyzwania do pokonania. Na przykład STORM i PALM mogą osiągać najlepsze rozdzielczości przestrzenne po utrwaleniu próbek biologicznych, a tym samym prezentować statyczną reprezentację białek znakowanych fluorescencyjnie, co jest podobnym ograniczeniem mikroskopii elektronowej. Dodatkowo, aby osiągnąć wysoką rozdzielczość przestrzenną dla każdego znakowanego fluorescencyjnie białka w żywych komórkach, próbki muszą być obrazowane z bardzo dużą liczbą klatek na sekundę, które nie są w stanie uchwycić dynamiki białka. Dlatego konieczne jest pokonanie tych głównych przeszkód technicznych.

Aby uzyskać wysoką rozdzielczość czasoprzestrzenną, która jest dobrze przystosowana do wykrywania szybko poruszających się białek lub RNA w żywych komórkach, opracowaliśmy w naszym laboratorium mikroskopię SPEED o superrozdzielczości (Rysunek 1)^6,7,8. Kilka głównych osiągnięć technicznych w mikroskopii SPEED umożliwiło nam wcześniej pomyślne śledzenie nukleocytoplazmatycznego transportu małych cząsteczek, białek, mRNA i wirusa przez natywne kompleksy porów jądrowych (NPC)^6,7,8. Krótko mówiąc, następujące cechy mikroskopii SPEED zostaną wykorzystane do śledzenia szybko poruszających się makrocząsteczek przez submikrometrowe rotacyjnie symetryczne struktury w żywych komórkach, takich jak NPC i rzęski pierwotne: (1) Nachylone lub pionowe oświetlenie PSF umożliwia wzbudzenie pojedynczych cząsteczek w małej objętości granicznej dyfrakcyjnej w płaszczyźnie ogniskowej (Rysunek 1); (2) Nachylony PSF może znacznie uniknąć nieostrej fluorescencji, a tym samym poprawić stosunek sygnału do szumu. (3) Gęstość optyczna 100-500 kW /^cm2 w oświetleniu PSF pozwala na zebranie tysięcy fotonów z pojedynczych fluoroforów z dużymi prędkościami wykrywania (> 500 Hz). (4) Duża szybkość wykrywania również znacznie zmniejsza błąd lokalizacji przestrzennej pojedynczej cząsteczki (< 10 nm) w określaniu trajektorii przestrzennych poruszających się cząsteczek fluorescencyjnych w żywych komórkach, ponieważ dyfuzja molekularna jest jednym z głównych czynników powodujących niedoskonałości lokalizacji pojedynczej cząsteczki dla poruszających się cząsteczek. (5) Ugruntowane algorytmy transformacji 2D do 3D umożliwiają nam dostarczanie trójwymiarowych map gęstości prawdopodobieństwa przestrzennego tras transportu cząsteczek w NPC lub rzęsce pierwotnej. Warto zauważyć, że nasz proces konwersji między kartezjańskim a cylindrycznym układem koordynacyjnym jest używany do generowania przestrzennej mapy gęstości prawdopodobieństwa 3D, a nie do śledzenia 3D pojedynczych cząsteczek (Rysunek 2). Wcześniej dane z mikroskopii elektronowej ujawniły, że NPC^9,10 i pierwszorzędowa cilium¹¹ mają strukturę rotacyjnie symetryczną. Zasadniczo losowo dyfundujące cząsteczki poruszające się przez NPC lub rzęskę pierwotną powinny mieć również rozkłady rotacyjnie symetryczne. Jak pokazano na rysunku Rysunek 2, duża liczba losowo dyfuzyjnych cząsteczek wewnątrz cylindra wygenerowałaby rotacyjnie symetryczne rozkłady w widoku przekroju poprzecznego, tak jak w NPC, co dodatkowo skutkowałoby w przybliżeniu równomiernym rozkładem przestrzennym w każdym bardzo małym podregionie między dwoma sąsiednimi pierścieniami (Rysunek 2E). Ten równomierny rozkład powoduje, że rozkład przestrzenny wzdłuż wymiaru θ w układzie cylindrycznym jest stały. Następnie współrzędne 3D (R, X, θ) można uprościć do współrzędnych 2D (R, X, stała). W rzeczywistości nasz proces konwersji między układem kartezjańskim a cylindrycznym odbywa się z 2D (X, Y) na 2D (R, X, stała). Stała θ, odnosi się do gęstości przestrzennej p w Rysunek 2E, jest obliczana za pomocą równania A.

Ostatecznie, śledzenie pojedynczych cząsteczek ma szerokie zastosowanie w badaniach biologicznych, dlatego naturalne jest, że mnóstwo technik zostanie opracowanych, aby wypełnić określone nisze biologiczne^12,13,14. Tak jest w przypadku mikroskopii SPEED. Wcześniej, w połączeniu z algorytmem transformacji 3D, technika ta została opracowana w celu rozwiązania trójwymiarowych tras transportu tranzystorów przez NPC, subdyfrakcyjną i rotacyjnie symetryczną strukturę biologiczną⁶. W tym artykule wykazano, że rzęski pierwotne są również doskonałymi organellami modelowymi. Rzęski pierwotne to cylindryczne, przypominające anteny organelle (promień ~125 nm), które wystają z powierzchni większości komórek ssaków^15,16,17. Są one odpowiedzialne za odbieranie sygnałów zewnętrznych i przekazywanie odpowiedzi wewnątrzkomórkowej zwykle związanej ze wzrostem i metabolizmem^15,16. Dlatego przepływ białek strukturalnych, recykling receptorów transbłonowych i przekazywanie przekaźników wewnątrzkomórkowych są istotnymi obowiązkami rzęsek pierwotnych. Na styku między rzęskami pierwotnymi a ciałem komórki znajduje się krytyczna bariera selektywności, zwana strefą przejściową lub TZ, przez którą musi nastąpić cały ten transport białka^11,18,19,20. Oprócz funkcji bramkowania TZ, uważa się, że co najmniej dwa procesy transportowe, transport wewnątrzwiciowy i dyfuzja bierna, są odpowiedzialne za przemieszczanie się białka przez ten region^16,21,22. Z punktu widzenia zdrowia ludzkiego, utrata rzęsek pierwotnych i późniejsza deregulacja sygnalizacji jest charakterystyczna dla wielu nowotworów. Ponadto wiele chorób genetycznych, takich jak zespół Bardeta-Biedla i wielotorbielowatość nerek, jest związanych z wadliwym transportem białek²³. Zarówno wielkość graniczna subdyfrakcji, jak i złożony proces selektywnego transportu białek przez TZ sprawiają, że rzęski pierwotne są głównym celem tej techniki. W tym artykule zademonstrujemy śledzenie rzęskowego białka transbłonowego, receptora somatostatyny 3 (SSTR3) < sup class="xref">24, znakowanego zewnętrznie Alexa Fluor 647 i składnika IFT, IFT20²⁵, znakowanego skondensowaną cząsteczką GFP.

Protocol

1. Przygotowanie komórek NIH-3T3 do mikroskopii SPEED ze stocku

1. 1,5 tygodnia przed eksperymentem odzyskać świeżą kulturę komórek NIH-3T3 z zamrożonego materiału podstawowego poprzez rozmrożenie w temperaturze 37 °C i przeniesienie komórek do kolby do hodowli komórkowej o średnicy 25 cm z 3 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 110 mg/ml pirogronianu sodu, 2 mM glutaminy, 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny.
2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .}
3. Podziel komórki przy 80% zbieganiu, mniej więcej co dwa dni, co najmniej trzy razy przed dniem eksperymentalnym, aby zapewnić jednorodność cyklu komórkowego. Trypsynizować komórki 0,25% trypsyny przez 2 minuty w temperaturze 37 °C, odessać trypsynę i zastąpić ją 2 ml pożywki. Kilkakrotnie pipetować pożywkę, aby rozbić skupiska komórek, usunąć żądaną liczbę komórek i przywrócić całkowitą objętość pożywki do 3 ml.
   UWAGA: NIH-3T3 zostały wcześniej genetycznie zmodyfikowane do ekspresji NPHP-4, białka, które lokalizuje się w klasie TZ²⁶, połączonej na końcu C do mCherry. mCherry to fluorofor, który może być wzbudzony oświetleniem o długości fali 561 nm w celu ilościowego zlokalizowania bariery selektywności TZ i zorientowania rzęsek pierwotnych.
4. Dwa dni przed eksperymentem umieść komórki w szklanym naczyniu o średnicy 35 mm przy 60-70% zbiegu z 1,5 ml tej samej pożywki, co w kroku 1,1 i włóż komórki z powrotem do inkubatora.
5. Na dzień przed eksperymentem należy dokonać chemicznej transfekcji komórek pożądanym plazmidem. Zmieszać 500 - 1000 ng pożądanego plazmidu (patrz uwaga poniżej) w stosunku 1:2,5 z odczynnikiem do transfekcji w 0,25 ml zredukowanej pożywki surowicy bez antybiotyków przez 30 min. Odessać pożywkę z naczynia o szklanym dnie 35 mm i zastąpić ją mieszanką 0,25 ml plazmidu/odczynnika do transfekcji oraz dodatkowymi 1,25 ml zredukowanej pożywki surowicy bez antybiotyków. Zredukowana pożywka surowicy służy do ułatwiania udanej transfekcji, indukowania pierwotnego wzrostu rzęsek, a także utrzymywania komórek przy życiu wystarczająco długo, aby można było przeprowadzić eksperyment. Następnego dnia należy zwrócić komórki do inkubatora w celu przeprowadzenia eksperymentu.
   UWAGA: Podczas śledzenia pojedynczej cząsteczki IFT20 używany jest plazmid zawierający genetycznie zmodyfikowany IFT20 połączony na swoim końcu C z GFP²⁵. Podczas śledzenia pojedynczej cząsteczki SSTR3 używany jest plazmid zawierający genetycznie zmodyfikowany SSTR3 połączony na swoim końcu N z domeną peptydu akceptorowego (AP) i końcem C z GFP²². Oprócz konstruktu SSTR3 plazmid zawierający ligazę biotyny BirA musi ulec koekspresji, a pożywka transfekcyjna musi zostać uzupełniona biotyną o stężeniu 10 μM. Następnie BirA przyłącza biotynę do domeny AP nowo zsyntetyzowanych cząsteczek AP-SSTR3-GFP na poziomie ER. Alexa647 sprzężona z trzema z czterech miejsc wiązania biotyny na streptawidynie, średnio, może być następnie uzupełniona do pożywki przed obrazowaniem w celu fluorescencyjnego znakowania cząsteczek AP-SSTR3-GFP na zewnętrznej powierzchni komórki^{22, 27}. W tej metodzie stosuje się GFP i AlexaFluor647; Jednak inne sondy fluorescencyjne mogą być używane, jeśli mają podobnie wysoką fotostabilność i wydajność kwantową.
6. W przypadku stosowania zewnętrznie znakowanego konstruktu SSTR3, wyjmij pożywkę ze szklanego naczynia na 1 godzinę przed eksperymentem, przemyj komórkę 5 razy 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i dodaj 1 ml zredukowanej pożywki surowicy uzupełnionej 1 μM Alexa647 sprzężoną streptawidyną.
7. Nie więcej niż 15 minut przed eksperymentem wyjmij pożywkę z naczynia ze szklanym dnem i umyj transfekowane i oznakowane komórki 5 razy 1 ml PBS.
8. Umieścić 1 ml buforu do obrazowania (20 mM HEPES, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3) w naczyniu ze szklanym dnem.
   UWAGA: W buforze obrazowania komórki są żywotne nie dłużej niż 3 godziny. Dlatego na każdym daniu przeprowadza się tylko 2 godziny eksperymentów.

2. Mikroskopia SPEED

Uwaga: Zestaw mikroskopii SPEED obejmuje odwrócony mikroskop fluorescencyjny wyposażony w apochromatyczny obiektyw 1,4-NA 100× zanurzeniowy w oleju, laser He-Ne o długości fali 35 mW 633 nm, lasery półprzewodnikowe 488 nm i 561 nm o mocy 50 mW, kamerę z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem oraz pakiet oprogramowania mikroskopowego do akwizycji i przetwarzania danych (Rysunek 1). W przypadku obrazowania poszczególnych kanałów GFP, mCherry i Alexa647 są wzbudzane odpowiednio przez lasery 488 nm, 561 nm lub 633 nm. Do śledzenia pojedynczych cząsteczek stosuje się oświetlenie jednopunktowe do śledzenia pojedynczych cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie. W przypadku obrazowania epifluorescencyjnego wklęsła soczewka jest umieszczana na ścieżce oświetlenia laserowego, aby rozszerzyć wiązkę do jednolitego pola oświetlenia. Emisje fluorescencji są zbierane przez ten sam obiektyw, filtrowane przez filtr dichroiczny (405/488/561/635) i filtr emisyjny (405/488/561/635) i obrazowane za pomocą powyższej kamery CCD działającej z częstotliwością 500 Hz dla śledzenia pojedynczej cząsteczki lub 2 Hz dla obrazowania epifluorescencyjnego.

1. Przymocuj szklaną płytkę dolną do stolika mikroskopu i zlokalizuj komórkę, która prawidłowo wyraża pożądane konstrukty. Po znalezieniu odpowiedniej komórki wyrównaj plamkę NPHP4-mCherry u podstawy rzęsek pierwotnych z miejscem na płaszczyźnie obrazowania, które odpowiada jednopunktowemu oświetleniu lasera.
2. Przechwyć obraz epifluorescencji NPHP4-mCherry i IFT20-GFP lub AP-SSTR3-GFP za pomocą funkcji "Snap" w zakładce "Kamera" w oknie "Kontrola ostrości", jeśli korzystasz z pakietu oprogramowania do mikroskopii cyfrowej (patrz Tabela materiałów).
   UWAGA: Obrazy te będą działać jako odniesienie dla kolejnych lokalizacji pojedynczych cząsteczek.
3. Po uzyskaniu obrazów referencyjnych należy lokalnie zmniejszyć stężenie znakowanych pojedynczych cząsteczek. Wybielanie fotograficzne TZ za pomocą oświetlenia laserowego o mocy 1 mW przez 20 s lub do momentu, gdy intensywność fluorescencji będzie zbliżona do intensywności fluorescencji tła.
   UWAGA: Gdy można kontrolować dokładne stężenie, stosuje się pojedyncze cząsteczki znakowane 0,1-1 nM.
4. Aby przygotować się do śledzenia pojedynczych cząsteczek, zmniejsz moc oświetlenia lasera do ~0,15 mW dla pojedynczych cząsteczek znakowanych GFP lub ~0,5 mW dla cząsteczek znakowanych Alexa647.
5. Jak tylko moc lasera i parametry obrazowania zostaną ustawione, maksymalne wzmocnienie i intensyfikacja oraz częstotliwość odświeżania 2 ms, w przypadku obrazowania pojedynczej cząsteczki włącz odpowiedni laser oświetleniowy i zarejestruj niefotobielone, znakowane pojedyncze cząsteczki, gdy są transportowane przez fotowybielany obszar TZ, klikając przycisk "Strumień" w zakładce "Kamera" w oknie "Sterowanie ostrością".
   UWAGA: Nie należy nagrywać więcej niż 2 minuty filmu, aby zminimalizować skutki dryfu rzęsek do znikomego poziomu.
6. Po przechwyceniu filmu z pojedynczą cząsteczką, przetwórz filmy za pomocą algorytmu dopasowania Gaussa 2D, takiego jak Glimpse firmy Gelles Lab, który precyzyjnie lokalizuje środek ciężkości wzbudzenia PSF każdej pojedynczej cząsteczki w obszarze zainteresowania (AOI).
7. Zaznacz wszystkie lokalizacje pojedynczych cząsteczek z precyzją <10 nm i skoryguj środek rzęsek na podstawie rozkładu lokalizacji pojedynczych cząsteczek wyposażonych w funkcję Gaussa 2D.
   UWAGA: Dzięki zastosowaniu algorytmu transformacji 2D do 3D, trasy transportowe 3D tras IFT20-GFP i AP-SSTR3 są wyraźnie pokazane odpowiednio na błonie rzęskowej aksonemalnej lub rzęskowej.

3. Transformacja 2D do 3D

1. Po zebraniu kilku tysięcy lokalizacji cząsteczek tranzytujących (stosunek sygnału do szumu > 11) w rzęsce, wybierz długą oś rzęski jako wymiar X. Wykonaj histogram wymiaru Y lokalizacji i uzyskaj sumy przedziałów w krokach co 10 nm.
   UWAGA: Transformacja 2D do 3D może być oceniana ręcznie lub za pomocą dowolnego oprogramowania lub języka programowania. Autorzy z powodzeniem zaimplementowali transformację zarówno w Matlabie, jak i w Pythonie 2.7.

Results

Ta sekcja przedstawia dane uzyskane z wykonania mikroskopii SPEED w TZ rzęsek pierwotnych w celu zbadania trasy transportu SSTR3 połączonej zewnętrznym łącznikiem ~15 nm z Alexa647 (Rysunek 3A). Służy dwóm celom: weryfikacji algorytmu transformacji 3D. Alexa647 powinna oznaczać tylko zewnętrzną powierzchnię rzęski pierwotnej, a zatem trasa transportowa 3D powinna ujawniać trasę transportową o dużej gęstości w tym miejscu. NIH-3T3 stabilnie ek...

Discussion

Protokół ten opisuje zastosowanie mikroskopii SPEED do rzęski pierwotnej, komórkowych organelli sygnalizacyjnych, które są w dużym stopniu zależne od wydajnego transportu białek. Mikroskopia SPEED może zapewnić lokalizacje o wysokiej rozdzielczości (< 10 nm) dla cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie, gdy przechodzą one przez oświetlenie jednopunktowe wyśrodkowane na TZ. Wcześniej stosowano go do badania transportu białek przez NPC ^6,7,8

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naczynie do hodowli tkankowych 25 cm2	Corning	VV-01936-00
Penicylina/streptomycyna	ThermoFisher	15140122
Surowica bydlęca	płodu ThermoFisher	10438018
DMEM	ThermoFisher	10566-016
OPTIMEM	ThermoFisher	31985062
Trypsyna	ThermoFisher	25300054
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Sigma-Aldrich	P3813-1PAK
Transit LT1	Mirus	MIR 2300
35 mm szklana naczynie dolne	MatTek	P35GCOL-0-14-C
AlexaFluor 647-sprzężona streptawidyna	ThermoFisher	S21374
Biotyna	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
633 nm Laser He-Ne	Melles Griot	25-LHP-928-249
Laser półprzewodnikowy 561 nm	Coherent	OBIS 561-50 LS
488 nm laser półprzewodnikowy	Coherent	1185053
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny	Olympus	IX81
1,4-NA 100 i razy; obiektyw apochromatyczny zanurzeniowy w oleju	Olympus	UPLSAPO 100 i razy;
Wbudowana kamera ze sprzężeniem ładowania ze wzmocnieniem zwielokrotnienia	Roper	Scientific Cascade 128 +
filtr dichroiczny	Semrock	Di01- R405/488/561/635-25x36
Filtr emisyjny	Semrock	NF01-405/488/561/635-25X5.0
Slidebook 6.0	Intelligent Imaging Innovations		oprogramowanie do mikroskopii cyfrowej