Method Article

Indukcja i obrazowanie mikro-tomografią malformacji jamistych mózgu w modelu mysim

DOI:

10.3791/56476

⸱

September 4th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Lab of Cardiovascular Signaling, Centenary Institute, 2Faculty of Medicine, Sydney Medical School, University of Sydney, 3Department of Pharmacology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 4Australian Centre for Microscopy & Microanalysis, University of Sydney

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół demonstruje indukcję choroby malformacji jamistych mózgu w modelu mysim i wykorzystuje mikrotomografię komputerową wzmocnioną kontrastem do pomiaru obciążenia zmianami. Metoda ta zwiększa wartość uznanych modeli mysich w celu zbadania podstaw molekularnych i potencjalnych terapii malformacji jamistych mózgu i innych chorób naczyń mózgowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mutacje w genie CCM1 (aka KRIT1), CCM2 lub CCM3 (aka PDCD10) powodują malformację jamistą mózgu (CCM) u ludzi. Mysie modele choroby CCM zostały stworzone na podstawie indukowanej tamoksyfenem delecji genów CCM u zwierząt po urodzeniu. Te mysie modele dostarczają nieocenionych narzędzi do badania mechanizmów molekularnych i podejść terapeutycznych w chorobie CCM. Dokładna i ilościowa metoda oceny obciążenia zmianami i ich progresji jest niezbędna, aby w pełni wykorzystać wartość tych modeli zwierzęcych. Tutaj pokazujemy indukcję choroby CCM w modelu mysim i zastosowanie metody mikrotomografii komputerowej rentgenowskiej ze wzmocnieniem kontrastowym (mikro-CT) do pomiaru obciążenia zmianami CCM w mózgach myszy. W 1. dniu po urodzeniu (P1) użyliśmy 4-hydroksytamoksyfenu (4HT) do aktywacji aktywności rekombinazy Cre z transgenu Cdh5-CreErt2 w celu rozszczepienia floksowanego allelu Ccm2. Zmiany CCM w mózgach myszy analizowano w P8. W przypadku mikrotomografii komputerowej zastosowano płyn Lugola na bazie jodu w celu zwiększenia kontrastu w tkance mózgowej. Zoptymalizowaliśmy parametry skanowania i wykorzystaliśmy wymiar woksela 9,5 μm, co doprowadziło do minimalnego rozmiaru obiektu wynoszącego około 25 μm. Rozdzielczość ta jest wystarczająca do globalnego i dokładnego pomiaru objętości i liczby zmian CCM oraz zapewnienia wysokiej jakości mapowania 3D zmian CCM w mózgach myszy. Metoda ta zwiększa wartość uznanych modeli mysich w celu zbadania podstaw molekularnych i potencjalnych terapii CCM i innych chorób naczyń mózgowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CCM to cienkościenne, rozszerzone malformacje naczyniowe w mózgu, których częstość występowania w populacji ludzkiej wynosi do 0,5%1. CCM może być dziedziczone jako zaburzenie dominujące z powodu mutacji powodujących utratę funkcji w jednym z trzech genów: CCM1 (aka Krit1), CCM2 i CCM3 (zwane również PDCD10)2,3,4,5,6. Geny te są obecne w pojedynczym kompleksie sygnałowym.

Różne modele zostały opracowane do modelowania ludzkiej choroby CCM i zrozumienia dalszych ścieżek genów CCM, które są odpowiedzialne za CCM7,8,9,10. Najbardziej niezawodnym modelem jest warunkowe usunięcie dowolnego z genów Ccm z indukowanym tamoksyfenem Cdh5-CreERT2 w P1 u nowonarodzonych szczeniąt8,10. U tych szczeniąt rozwijają się zmiany CCM w mózgu od P6 i oczekuje się, że będą idealnym modelem do badań przedklinicznych w poszukiwaniu mechanizmów i środków terapeutycznych w leczeniu chorób CCM.

Obciążenie zmianami CCM w mózgu myszy zostało zmierzone głównie za pomocą metod opartych na histologii, podejścia, które jest niezwykle czasochłonne i podlega stronniczości badacza10,11,12. Metody oparte na MRI zostały wykorzystane do oceny obciążenia zmianami CCM w modelu dorosłej myszy9,13. Jednak wysoce specjalistyczny instrument MRI małych zwierząt i długi czas skanowania wynoszący od kilku godzin do nocy są wymagane, aby osiągnąć zadowalającą rozdzielczość w celu zidentyfikowania zmian CCM. Nie podano również, czy MRI może być stosowany do wykrywania zmian CCM u nowonarodzonych myszy, a ustąpienie może ograniczać czułość.

Niedawno opracowaliśmy technikę mikro-tomografii komputerowej do obrazowania i analizy zmian CCM14,15. Ta metoda o wysokiej rozdzielczości, efektywna czasowo i kosztowo znacznie zwiększyła wartość modelu choroby CCM w badaniach mechanistycznych i terapeutycznych. Do obrazowania mikro-tomografii komputerowej tkanek miękkich i zarodków myszy zastosowano metody barwienia całego wierzchołka wzmacniające kontrast i zarodki myszy16,17. Wcześniej używaliśmy barwienia na bazie osmu w celu zwiększenia kontrastu do obrazowania mikro-CT zmian CCM w brain14. W tym artykule użyliśmy mniej toksycznego, nieniszczącego i ekonomicznego odczynnika, roztworu Lugola na bazie jodu, w celu zwiększenia kontrastu w obrazowaniu mikro-CT. Jod może dyfundować po całym mózgu i ma wysokie powinowactwo do krwi18.

Szczegółowy protokół jest tutaj przedstawiony do indukcji zmian CCM w modelu myszy noworodkowej wraz z obrazowaniem i analizą zmian CCM za pomocą mikro-CT opartego na kontraście. Ta metoda oparta na mikro-CT zapewnia ilościowy globalny pomiar objętości zmian CCM, dokładnie identyfikuje liczbę i lokalizację 3D zmian CCM w mózgu myszy oraz znacznie zmniejsza koszty i czas wymagany do fenotypu tych zwierząt.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zasady etyki i protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt Lokalnego Okręgu Zdrowia w Sydney oraz Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Medycznego w Tianjin. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi/przepisami Centenary Institute, University of Sydney i Tianjin Medical University

1. Indukcja wad rozwojowych jamistych mózgu w modelach mysich

  1. Krzyż CDH5-CreErt2; Ccm2fl/fl myszy z Ccm2fl/fl do generowania miotów z Cdh5-CreErt2; Ccm2fl/fl (Ccm2iECKO) młode i kontrolne z miotu (Ccm2fl/fl). Zwierzęta Cdh5-CreErt2 i Ccm2 fl/fl zostały wcześniej opisane19.
  2. Rozpuścić 4HT w 100% etanolu i przechowywać w temperaturze -80 °C w porcjach 30 μl (stężenie 4HT: 10 mg/mL). W dniu stosowania rozcieńczyć porcję 4HT w oleju kukurydzianym (0,5 mg/ml).
  3. Wstrzyknąć dożołądkowo 50 μl 4HT (0,5 mg/ml) nowonarodzonym szczeniętom w P1 w celu wywołania eksperymentalnych zmian CCM za pomocą strzykawki insulinowej.

2. Przygotowanie próbki do badań mikrotomografią komputerową

  1. Eutanazja nowonarodzonych szczeniąt w P8 poprzez uduszenie dwutlenkiem węgla.
  2. Wykonaj perfuzję wewnątrzsercową, wprowadzając igłę o rozmiarze 29 z 3 ml 2% paraformaldehydu w PBS w strzykawce o pojemności 10 ml do komory serca myszy.
    UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny; Nosić odpowiednią ochronę.
  3. Odłącz głowę od ciała za pomocą nożyczek. Usuń całą skórę z głowy za pomocą nożyczek i oderwij czaszkę za pomocą kleszczy, aby wypreparować cały mózg.
  4. Rób zdjęcia mózgu za pomocą mikroskopu stereoskopowego przy powiększeniu 7,82x, wzmocnieniu 1x, gamma 0,6 i czasie naświetlania 20 ms.
  5. Napraw wypreparowane mózgi za pomocą 4% paraformaldehydu w roztworze PBS przez noc.
    UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny; Nosić odpowiednią ochronę.
  6. Następnego dnia odłącz tyłomózgowie za pomocą kleszczy i przemyj roztworem PBS.
  7. Inkubować tyłomózgowie w roztworze jodu Lugola przez 48 godzin.
  8. Po inkubacji należy krótko wysuszyć tyłomózgowie na powietrzu, aby usunąć nadmiar roztworu jodu Lugola.
  9. Zapakuj poplamione jodem tyłomózgowie Lugola do probówek mikrowirówek o pojemności 0,65 ml i całkowicie uszczelnij plastikową folią parafinową, aby uniknąć kurczenia się tkanek (Rysunek 2A).
  10. Umieść probówki do mikrowirówek w plastikowych probówkach o pojemności 5 ml z gąbkami, aby zapobiec ich przesuwaniu się podczas skanowania (Rysunek 2B).

3. Mikrotomografia komputerowa CCM w mózgu myszy

  1. Zamontuj pionowo tyłomózgowie zapakowane w rurkę na aluminiowym uchwycie w systemie micro-CT.
  2. Ustaw parametry skanowania na 540 projekcji i czas naświetlania 2 s przy warunkach źródła 50 kV i 10 W, aby uzyskać zestawy danych tomograficznych (rozdzielczość obrazu 9,5 μm/piksel).
  3. Zdjęcia rentgenowskie ze skanu są rekonstruowane automatycznie przez sprzętowe oprogramowanie do rekonstrukcji projekcyjnej dostarczone przez system micro-CT, tworząc serię obrazów 16-bitowych wycinków osiowych (plik "TXM").

4. Analiza zbiorów danych Micro-CT

  1. Otwórz zrekonstruowany plik obrazu (plik "TXM") w oprogramowaniu do analizy 3D i zwizualizuj mózg za pomocą funkcji "renderowania objętości".
  2. Przekształć tyłomózgowie do pożądanej orientacji za pomocą funkcji "obwiedni" i "płaszczyzny tnącej".
  3. Ponownie próbkuj przekształcony obraz w trybie rozszerzonym i zachowaj rozmiar wokseli.
  4. Utwórz "edytuj nowe pole etykiety" na przekształconym obrazie (4.3) i podświetl tylko tyłomózgowie za pomocą intensywności skali szarości.
  5. Dodaj podświetlone obszary i uruchom "analizę etykiety", aby uzyskać pomiary całego tyłomózgowia (tj. całkowitej objętości i obszaru). Eksport pomiarów do pliku Excel.
  6. Wizualizuj tyłomózgowie za pomocą funkcji "renderowania izopowierzchni".
  7. Utwórz kolejne "edytuj nowe pole etykiety" na przekształconym obrazie i podświetl obszary ze zmianami za pomocą intensywności skali szarości.
  8. Dodaj podświetlone obszary i przeprowadź analizę "etykiety", aby uzyskać pomiary zmian w tyłomózgowiu (tj. całkowitej objętości i obszaru). Eksport pomiarów do pliku Excel.
  9. Wizualizacja zmian chorobowych za pomocą funkcji "generuj powierzchnię" i "widok powierzchni".
  10. Zrób migawkę obrazu tyłomózgowia w żądanej orientacji lub wygeneruj film, aby uzyskać wizualizację 3D zmian chorobowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojedyncze wstrzyknięcie 4HT w P1 wystarczyło, aby wywołać zmiany CCM w móżdżku. Mikrotomografia komputerowa Lugola z jodem w wystarczającym stopniu wykryła zmiany w CCM i mogła określić ilościowo ich objętość i liczbę. Wykorzystując zoptymalizowaną mikrotomografię komputerową, zobrazowaliśmy zmiany CCM w tyłomózgowiu myszy Ccm2iECKO. Zeskanowane obrazy rentgenowskie zrekonstruowano w celu uzyskania trójwymiarowych obrazów mózgu myszy, co pozwoliło na wizualizację cały...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CCM jest powszechną malformacją naczyniową, która dotyka do 0,5% osób1. CCM może występować w postaci sporadycznej lub rodzinnej. Rokowanie pacjenta jest często niejasne, ponieważ zmiany CCM mogą nieoczekiwanie pęknąć, powodując udar mózgu i inne konsekwencje neurologiczne. Obecnie jedyną opcją leczenia jest chirurgiczne usunięcie zmian, którym towarzyszy duże ryzyko.

Warunki CCM u ludzi zostały ostatnio odtworzone w modelach zwierzęcych

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za udogodnienia oraz naukową i techniczną pomoc Sydney Microscopy & Microanalysis Research Facility (AMMRF) oraz Australian Centre for Microscopy & Microanalysis (ACMM) na Uniwersytecie w Sydney. Badania te były wspierane przez australijską Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC) w ramach grantu 161558 i APP1124011 (XZ).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-hydroksytamoksyfenSigma-AldrichH6278Aby aktywować Cdh5-CreErt2
Olej kukurydzianySigma-AldrichC8267-500MLDo rozcieńczania 4-hydroksytamoksyfenu
Mikroskop stereoskopowyLeicaM205FADo wykonywania zdjęć makroskopowych
Płyn jodu LugolaSigma-AldrichL6146Do barwienia próbek do kontrastu mikro-CT
Folia parafinowa z tworzywa sztucznegoParafilmPM992Do pakowania próbek
Micro-CTXradiaMicroXCT-400Oprogramowanie
renderowania 3DFEI Visualization Grupa naukowaAvizo Oprogramowanie do przetwarzania obrazów 3DDo analizy skanów mikro-CT
do Micro-CT

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis. Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).
  2. Liquori, C. L., et al. Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).
  3. Laberge-le Couteulx, S., et al. Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas. Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).
  4. Sahoo, T., et al. Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1). Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).
  5. Denier, C., et al. Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).
  6. Bergametti, F., et al. Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).
  7. McDonald, D. A., et al. A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease. Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).
  8. Boulday, G., et al. Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice. J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).
  9. Chan, A. C., et al. Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice. J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).
  10. Zheng, X., et al. Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor. Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).
  11. McDonald, D. A., et al. Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease. Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).
  12. Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
  13. Gibson, C. C., et al. Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation. Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).
  14. Choi, J. P., et al. Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice. PLoS One. 11 (8), 0160833(2016).
  15. Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).
  16. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11(2009).
  17. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), 61(2006).
  18. Anderson, R., Maga, A. M. A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast. PLoS One. 10 (11), 0142974(2015).
  19. Zheng, X., et al. Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth. Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cerebral Cavernous MalformationsMouse Model InductionMicro CT ImagingTamoxifen Induced DeletionIodine Contrast EnhancementVoxel Dimension OptimizationLesion Burden Measurement3D Brain MappingCcm2 Gene KnockoutPostnatal Day 1 Injection

Related Articles