Artykuł metodologiczny

Elektrofizjologiczna ocena przedsionków myszy z mapowaniem optycznym o wysokiej rozdzielczości

11.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56478

⸱

22 lutego 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bio-informational Pharmacology, Medical Research Institute, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Biofunctional Informatics, Tokyo Medical and Dental University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje elektrofizjologiczną ocenę przedsionków myszy za pomocą optycznego systemu mapowania o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej, w tym podwójne zapisy napięcia membranowego i Ca2+ przejściowego pod zaprogramowaną stymulacją przez specjalistyczny cewnik elektrodowy.

Streszczenie

Ostatnie badania asocjacyjne całego genomu ukierunkowane na migotanie przedsionków (AF) wykazały silny związek między genotypem a fenotypem elektrofizjologicznym w przedsionkach. To zachęca nas do wykorzystania genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy w celu wyjaśnienia mechanizmu migotania przedsionków. Trudno jest jednak ocenić właściwości elektrofizjologiczne w mysich przedsionkach ze względu na ich niewielkie rozmiary. Protokół ten opisuje elektrofizjologiczną ocenę przedsionków przy użyciu systemu mapowania optycznego o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej w perfundowanych mysich sercach Langendorffa. System mapowania optycznego jest wyposażony w podwójne, szybkie, uzupełniające kamery półprzewodnikowe z tlenkiem metalu i soczewki obiektywowe o dużym powiększeniu, w celu wykrycia fluorescencji barwnika wrażliwego na napięcie i wskaźnika Ca2 +. Aby skupić się na ocenie mysich przedsionków, mapowanie optyczne przeprowadza się z obszarem 2 mm × 2 mm lub 10 mm x 10 mm, z rozdzielczością 100 × 100 (20 μm/piksel lub 100 μm/piksel) i częstotliwością próbkowania do 10 kHz (0,1 ms) maksymalnie. Cewnik stymulujący elektrody czterobiegunowej w rozmiarze 1 French umieszcza się w prawym przedsionku przez żyłę główną górną, unikając mechanicznego uszkodzenia przedsionka, a stymulacja stymulacji jest dostarczana przez cewnik. Badanie elektrofizjologiczne jest wykonywane z zaprogramowaną stymulacją, w tym stymulacją stałą, stymulacją impulsową i nawet potrójną stymulacją pozabodźcową. W rytmie spontanicznym lub stymulacyjnym mapowanie optyczne rejestrowało czas trwania potencjału czynnościowego, mapę aktywacji, prędkość przewodzenia i stan przejściowy Ca2+ indywidualnie w prawym i lewym przedsionku. Ponadto zaprogramowana stymulacja decyduje również o indukowalności tachyarytmii przedsionkowej. Precyzyjne mapowanie aktywacji wykonuje się w celu identyfikacji propagacji wzbudzenia w przedsionku podczas indukowanej tachyarytmii przedsionkowej. Mapowanie optyczne ze specjalistycznym ustawieniem umożliwia dokładną ocenę elektrofizjologiczną przedsionka w mysich modelach patologicznych.

Wprowadzenie

Serce składa się z 4 komór u ssaków. Dwie górne komory to przedsionki, a dolne to komory. Komory działają jak pompa wyrzucająca krew do krążenia ogólnoustrojowego lub płucnego. Przedsionki otrzymują krew powracającą z żył układowych lub płucnych i pomagają w transporcie krwi do komór w celu uzyskania wydajnej funkcji pompy serca. Z punktu widzenia elektrofizjologicznego ważną funkcją przedsionków jest regulacja rytmu serca. Sygnały elektryczne pochodzą z węzła zatokowego znajdującego się na styku żyły głównej górnej (SVC) i prawego przedsionka (RA), a następnie rozchodzą się do RA i lewego przedsionka (LA) i kierują się do komory przez węzeł przedsionkowo-komorowy i układ przewodzenia Hisa-Purkinjego.

Zaburzenia rytmu serca, które są zaburzeniami rytmu serca, dzielą się na przedsionkowe i komorowe w zależności od ich pochodzenia. Migotanie przedsionków (AF) jest najczęstszą utrzymującą się postacią arytmii, charakteryzującą się losowym i szybkim pobudzeniem przedsionków. Ostatnie analizy genetyczne i badania asocjacyjne całego genomu (GWAS) wykazały związek między AF a mutacjami genetycznymi lub monopolymorfizmami1,2,3,4. Wyniki te wskazują, że migotanie przedsionków jest przynajmniej częściowo związane z przyczyną genetyczną. Dlatego tak ważna jest ocena interakcji genotyp-fenotyp w przedsionkach przy użyciu genetycznie zmodyfikowanego modelu zwierzęcego. Powszechnie przyjmuje się, że mysz jest najbardziej uznanym ssakiem do modyfikacji genetycznej.

Technika mapowania optycznego została opracowana do oceny pobudzenia tkanki serca. Jednak obserwacja mysiego przedsionka za pomocą mapowania optycznego jest utrudniona ze względu na jego stosunkowo niewielkie rozmiary. Staramy się uzyskać szczegółową ocenę mysiego przedsionka z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną.

Protokół

Ten eksperyment na zwierzętach został zatwierdzony i przeprowadzony zgodnie z regulacjami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego i Dentystycznego w Tokio.

1. Przygotowanie

  1. Roztwory podstawowe
    1. Rozpuść barwniki wrażliwe na napięcie (di-4-ANEPPS i RH237) oraz wskaźnik Ca2+ (Rhod-2 AM) w 100% sulfotlenku dimetylu (DMSO), aby uzyskać roztwory podstawowe o stężeniach odpowiednio 6 mM, 10 mM i 10 mM.
    2. Rozpuścić rozprzęgacz wzbudzenia-skurczu (E-C), blibstatynę, w 90% DMSO, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 mM.
    3. Podwielokrotnić roztwory podstawowe w probówce PCR o pojemności 0,2 ml w ciemnym pomieszczeniu i zastąpić powietrze w probówce podstawowej azotem, aby uniknąć utleniania.
    4. Owiń probówki pojedynczo folią aluminiową w celu ochrony przed światłem i przechowuj je w temperaturze -20 °C.
  2. Rozwiązania robocze
    1. Przygotować 1 l soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) bez Ca2+ (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,0 mM Na2HPO4 i 1,5 mM KH2PO4, pH 7,40 dostosowane przez NaOH)
    2. Przygotuj 1 l roztworu Tyrode'a (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,53 mM MgCl2, 0,33 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-glukozy i 5,0 mM HEPES, pH 7,40 dostosowane przez NaOH).
    3. Przefiltruj roztwór Tyrode'a za pomocą filtra butelkowego o średnicy 0,22 μm i dobrze go napowietrz przez napowietrzanie pęcherzykowe za pomocą kamienia napowietrzającego podłączonego do butli gazowejO2.

2. Mapowanie optyczne w sercach perfundowanych Langendorffem

  1. Zmontuj system mapowania optycznego za pomocą dwóch uzupełniających się kamer z półprzewodnikiem z tlenkiem metalu (CMOS) (Rysunek 1a&b)
    1. Zmontuj kamery CMOS, rozdzielacz wiązki, soczewki obiektywowe, rewolwer obiektywu, źródło światła, lustra dichroiczne, filtry i inne części w systemie mapowania optycznego, jak pokazano na Rysunek 1a&b.
    2. Wybierz powiększenie, zmieniając soczewkę obiektywu w wieżyczce, wyposażonej w różne powiększenia (1,6x i 5x).
      UWAGA: Rozmiar matrycy CMOS wynosi 10 mm × 10 mm, przy rozdzielczości 100 × 100, co oznacza, że przy obiektywie 5X system ten zapewnia rozdzielczość przestrzenną 20 μm.
    3. Ustaw światło wzbudzenia za pomocą lampy z diodą elektroluminescencyjną (LED) o środkowej długości fali 530 nm, przepuszczonej przez filtr pasmowo-przepustowy (520/35 nm) i odbitej przez zwierciadło dichroiczne (560 nm).
    4. Rejestruj sygnał emisyjny podzielony przez rozdzielacz (665 nm), w którym ustawienie kamery 1 z filtrem długoprzepustowym (697/75 nm) wykrywa fluorescencję za pomocą barwnika membranowego wrażliwego na napięcie (di 4-ANEPPS lub RH237), a kamera 2 z filtrem pasmowo-przepustowym (572/28 nm) wykrywa sygnał wskaźnika Ca2+ (Rhod2-AM).
  2. Zmontuj obwód perfuzyjny Langendorffa
    1. Podłącz rurki z polichlorku winylu (PVC) do pompy perystaltycznej.
    2. Umieścić rurkę PVC po stronie wlotowej w roztworze Tyrode'a napowietrzonym 100%O2, jak wspomniano w kroku 1.2.3.
    3. Podłącz stronę tłoczną rurki PVC do ręcznie wykonanego detektora pęcherzyków powietrza, a następnie ułóż kolejno filtr 5 μm, zawory odcinające trójdrogowe, przetwornik ciśnienia, cewkę szkła grzewczego i igłę o rozmiarze 21 (rozmiar igły można zmieniać w zależności od rozmiaru aorty), używając innych rurek PVC.
    4. Napełnij obwód perfuzyjny roztworem Tyrode'a, unikając pęcherzyków powietrza w obwodzie, i zatrzymaj przepływ, dopóki serce nie zostanie podłączone do obwodu.
  3. Heparynizacja i znieczulenie
    1. Wstrzyknąć niefrakcjonowaną heparynę (200 j.m., niezależnie od masy ciała) dootrzewnowo myszy za pomocą igły o rozmiarze 25 i strzykawki o pojemności 1 ml.
    2. Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu (65 mg / kg) 10 minut po wstrzyknięciu heparyny.
  4. Kaniulacja i perfuzja
    1. Umieść mysz w pozycji leżącej. Potwierdź, że zwierzę jest znieczulone brakiem reakcji na szczypanie palca. Otwórz ścianę brzucha poniżej poziomu wyrostka mieczykowatego za pomocą nożyczek. Wykonaj poprzeczne nacięcie w przeponie, przetnij obie strony żeber w przyśrodkowej linii pachowej bez uszkodzenia serca i odwróć przednią ścianę klatki piersiowej do góry. Przesuwaj zakrzywione kleszcze za sercem i przytrzymaj aortę zstępującą, przełyk i żyłę główną dolną. Następnie szybko wytnij serce nożyczkami wraz z sąsiednimi naczyniami i tkankami, takimi jak aorta, płuca, tchawica, przełyk, tkanka tłuszczowa i grasica.
    2. Umyj serce 10 ml lodowatego PBS na szalce Petriego i usuń przylegającą tkankę.
    3. Wprowadź końcówkę igły o rozmiarze 21 podłączonej do obwodu perfuzyjnego do aorty wstępującej i przymocuj ją gwintem pod mikroskopem stereoskopowym.
    4. Rozpocznij perfuzję serca przez 10 minut roztworem Tyrode'a napowietrzonym 100%O2.
    5. Monitoruj ciśnienie perfuzji w sposób ciągły za pomocą przetwornika ciśnienia podłączonego do amplifier i rejestrator.
    6. Utrzymuj ciśnienie perfuzji w zakresie 80-100 mmHg (zwykle odpowiada 2-5 ml / min dla natężenia przepływu) podczas wszystkich kolejnych kroków.
    7. Podczas wstępnej perfuzji (krok 2.4.4.) włóż cienką rurkę z polietylenu (PE) (średnica zewnętrzna: 0,8 mm) do SVC i przymocuj ją gwintem. Następnie umieść serce w rozgrzanej szklanej komorze (Rysunek 1b&c).
    8. Nakłuć igłę do montażu w locie o rozmiarze 24 (średnica zewnętrzna: 0,7 mm) do jamy lewej komory (LV) przez wierzchołek komory, aby uniknąć uszkodzenia przedsionka, i usunąć igłę wewnętrzną, pozostawiając zewnętrzną kaniulę w LV.
    9. Wprowadź wykonany na zamówienie cewnik elektrodowy w rozmiarze 1 French przez rurkę PE w SVC, aby przeprowadzić stymulację elektryczną w RA. W razie potrzeby wsuń cewnik do prawej komory (RV) w celu stymulacji komór.
    10. Włóż elektrodę szpilkową do wierzchołka komory, aby w sposób ciągły rejestrować bipolarne elektrokardiogramy (EKG) między elektrodą szpilkową a igłą kaniulacyjną w aorcie wstępującej (Rysunek 1c).
    11. Kontynuuj monitorowanie EKG i ciśnienia perfuzyjnego przez cały czas trwania badania.
    12. Wyłącz światło i wykonaj następujący eksperyment w ciemnym pomieszczeniu.
    13. Przejdź do kroku 2.5. dla pojedynczego zapisu napięcia membrany lub 2.6. dla podwójnego zapisu napięcia membrany i stanu nieustalonego Ca2+.
  5. Barwienie do pojedynczego zapisu napięcia membrany
    1. Roztwór perfuzyjny należy utrzymywać podgrzany do temperatury 37 °C podczas tego protokołu barwienia w celu pojedynczego zapisu napięcia membrany.
    2. Rozcieńczyć 8,3 μl roztworu podstawowego di-4-ANEPPS (6 mM) 10 ml roztworu Tyrode'a (końcowe stężenie wynosi 5 μM).
    3. Wlewać całkowitą objętość (10 ml) rozcieńczonego roztworu di-4-ANEPPS do serca drogą perfuzyjną przez 2-5 minut, a następnie wypłukiwać roztworem Tyrode'a przez 5 minut.
    4. Rozcieńczyć 5 μl roztworu podstawowego blibstatyny (50 mM) 1 ml roztworu Tyrode'a (końcowe stężenie wynosi 250 μM).
    5. Podać całkowitą ilość rozcieńczonego roztworu blebbistatyny drogą perfuzyjną.
    6. Pomiń krok 2.6 i przejdź do kroku 2.7 w celu wypłukiwania.
  6. Barwienie w celu podwójnego zapisu napięcia membrany i stanu nieustalonego Ca2+
    1. Roztwór Tyrode należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: To początkowe ustawienie temperatury różni się od tego w przypadku barwienia dla pojedynczego zapisu napięcia membrany (krok 2.5.).
    2. Blabistatynę należy podawać w taki sam sposób, jak w krokach 2.5.4 i 2.5.5.
    3. Zmieszać 3 μl roztworu podstawowego Rhod2AM (10 mM) i 30 μl polioksyetylenowo-polioksypropylenowego kopolimeru blokowego F-127 (20% w DMSO), a następnie rozcieńczyć mieszaninę 10 ml roztworu Tyrode'a.
    4. Załadować całkowitą ilość roztworu Rhod2AM (3 μM) w ciągu 2-5 minut tą samą trasą, co blebbistatyna.
    5. Rozcieńczyć 7 μl roztworu podstawowego RH237 (10 mM) 10 ml roztworu Tyrode'a.
    6. Podawać całkowitą ilość rozcieńczonego roztworu RH237 (7 μM) przez 2-5 minut.
    7. Po wykonaniu powyższej procedury należy rozpocząć podgrzewanie roztworu Tyrode w temperaturze 37 °C.
  7. Rozmycie
    1. Utrzymuj temperaturę roztworu Tyrode'a na poziomie 37 °C w następnym doświadczeniu.
    2. Perfuzjuj serce roztworem Tyrode'a przez co najmniej 5 minut, aby wypłukać nadmiar barwników.
      UWAGA: Nie ma potrzeby zwiększania natężenia przepływu podczas tego etapu wymywania (patrz krok 2.4.6.)
    3. Potwierdź zniknięcie jakiegokolwiek artefaktu ruchu z powodu skurczów i jednorodnego zabarwienia w perfundowanym sercu.
  8. Pobieranie próbek i analiza danych
    1. Ostrożnie umieść szkło nakrywkowe (25 mm × 60 mm) na perfundowanym sercu, aby spłaszczyć powierzchnię przedsionka bez zbyt dużego naprężenia mechanicznego i zapobiec drganiom roztworu artefaktu ruchu. Upewnij się, że przedsionek jest prawidłowo przymocowany do szkła nakrywkowego.
    2. Rejestruj fluorescencję za pomocą kamer CMOS z częstotliwością próbkowania do 0,1 ms dla di 4-ANEPPS i 1 ms dla barwienia RH237 i Rhod2AM.
    3. Uzyskane nagrania należy przeanalizować za pomocą oprogramowania analizującego, zgodnie z instrukcją producenta dotyczącą rzeczywistego działania oprogramowania.
    4. Utwórz mapę aktywacji i film po wyodrębnieniu obszaru zainteresowania, usunięciu dryfu, filtrowaniu czasowym i 3 X 3 binning5.

3. Badanie elektrofizjologiczne

  1. Ustawianie elektrod stymulujących i stymulatora
    1. Potwierdź kontakt końcówki specjalnie wykonanej elektrody stymulacyjnej w RA z tkanką w celu stymulacji (patrz krok 2.4.9.).
    2. Dostarczyć wszystkie bodźce stymulacyjne z cewnika stymulacyjnego podłączonego do programowalnego stymulatora.
  2. Wyznaczanie progu stymulacji
    1. Ustaw interwał stymulacji w zakresie od 100 do 150 ms (szerokość impulsu 0,4 ms), unikając jakiegokolwiek wewnętrznego rytmu wyprzedzającego tempo stymulacji.
    2. Zapewnij stałą stymulację stymulacji przez co najmniej 20 uderzeń, aby uzyskać stabilną stymulację przedsionków.
    3. Ustaw wyjście stymulacji na 5 mV, a następnie stopniowo je zmniejszaj, aż dostarczone napięcie nie spowoduje depolaryzacji przedsionka.
    4. Potwierdzić wzbudzenie przedsionkowe przez obecność załamków P w EKG i/lub sygnał wzbudzenia przedsionków przez zapis optyczny.
    5. Określ minimalną moc wyjściową stymulacji, która jest w stanie zdepolaryzować przedsionek jako próg stymulacji.
    6. Ustaw wyjście stymulacji dla kolejnych badań na poziomie dwukrotnie wyższym od progu stymulacji.
  3. Stałe i seryjne tempo
    1. Zapewnij stałe tempo przez 99 uderzeń, z interwałem tempa zaczynającym się od 150 ms lub najdłuższym interwałem, który unika wyprzedzania rytmu wewnętrznego.
    2. Stopniowo zmniejszaj odstęp stymulacji co 5 ms, do 40 ms lub do osiągnięcia interwału, który nie pozwala na uchwycenie przedsionka w stosunku 1:1.
  4. Stymulacja pojedynczego dodatkowego bodźca
    1. Ustaw długość cyklu stymulacji napędu podstawowego (S1) na 120 ms, 100 ms i 80 ms, chyba że rytm wewnętrzny wyprzedza napęd podstawowy lub stymulacja nie uzyska wzbudzenia przedsionkowego 1:1.
    2. Ustaw liczbę bodźców stymulacji na 10 uderzeń dla podstawowego układu napędowego.
    3. Ustaw pierwszy dodatkowy bodziec (S2) na -10 ms dla podstawowej długości cyklu.
    4. Dostarcz S2 po ostatnim bodźcu stymulacyjnym dysku podstawowego.
    5. Skracaj interwał sprzężenia S2 stopniowo co 5 ms, aż S2 nie zdoła zdepolaryzować przedsionka.
    6. Określ efektywny okres refrakcji (ERP) jako najdłuższy interwał S2, który nie powoduje depolaryzacji przedsionka.
    7. Oceń ERP z co najmniej 3 różnymi długościami cykli podstawowych, aby ocenić dostosowanie szybkości ERP.
  5. Podwójne i potrójne stymulacje pozabodźcowe w celu wywołania tachyarytmii przedsionkowych
    1. Zresetuj interwał S2 do punktu znajdującego się 20 ms poza ERP S2, jeśli nie obserwuje się żadnych arytmii.
    2. Dodaj drugi dodatkowy bodziec (S3), zaczynając od tego samego interwału co S2.
    3. Zmniejszaj interwał sprzężenia między S2 i S3 stopniowo w krokach co 5 ms, aż S3 nie zdoła zdepolaryzować przedsionka.
    4. Zresetuj interwał S2 do punktu znajdującego się 10 ms poza systemem ERP, a następnie powtórz krok 3.5.3.
    5. Zresetuj interwały S2 i S3 do punktów znajdujących się 20 ms poza każdym systemem ERP.
    6. Dodaj trzeci dodatkowy bodziec (S4), zaczynając od tego samego interwału co S3.
    7. Zmniejszaj interwał sprzężenia między S3 i S4 stopniowo co 5 ms, aż S4 nie zdoła zdepolaryzować przedsionka.
    8. Zresetuj interwał S3 do punktu znajdującego się 10 ms poza systemem ERP, a następnie powtórz krok 3.5.7.
    9. Zresetuj interwały S2 i S3 do punktów znajdujących się 10 ms poza ERP, a następnie powtórz krok 3.5.7.
    10. Określ indukowalność tachyarytmii przedsionkowych poprzez odtwarzalną indukcję przy użyciu podobnie zaprogramowanych bodźców.
  6. Ocena indukowalności tachyarytmii przedsionkowych
    1. Rejestruj EKG w sposób ciągły podczas wszystkich protokołów stymulacji (kroki 3.3 - 3.5.).
    2. Wykonuj zapisy optyczne w trakcie i po każdej stymulacji, aby zarejestrować indukcję częstoskurczu przedsionkowego (AT) lub powtarzającej się odpowiedzi przedsionkowej (RAR).
    3. Potwierdź odtwarzalność, stosując ten sam protokół stymulacji, gdy indukowany jest AF lub RAR.

Wyniki

Eksperymenty mapowania optycznego są przeprowadzane przy użyciu urządzeń przedstawionych na Rysunku 1a. Schemat układu optycznego zilustrowano na Rysunku 1b. System ten umożliwia wysokorozdzielczą analizę potencjału błonowego oraz przejściowych zmian stężenia Ca2+ w przedsionku.

Jak przedstawiono na Rycynie 1c i d, wyizolowane serce umieszczono w komorze z kontrolowaną temperaturą. Elektrody cewnikowe o rozmiarze 1-French umieszczono w prawym przedsionku (RA) poprzez rurkę PE wprowadzoną do żyły głównej górnej (SVC), a kolejną rurkę PE wprowadzono do jamy lewej komory (LV) od strony wierzchołka LV, aby uniknąć nadmiernego nacisku na jamę serca. Do jednoczesnego zapisu EKG katodę (odprowadzenie EKG [-]) podłączono do igły kaniulacyjnej, a anodę (odprowadzenie EKG [+]) do elektrody szpilkowej wprowadzonej do wierzchołka komory. Cechą tej konfiguracji jest zapobieganie jakimkolwiek uszkodzeniom mechanicznym przedsionków.

W celu oceny napięcia błony rejestrowano fluorescencję z wykorzystaniem di-4-ANEPPS przy częstotliwości próbkowania do 10 0 klatek/s (Rycina 2). Mapę aktywacji uzyskano podczas stałego stymulowania z prawego przedsionka (RA). Precyzyjne mapowanie umożliwia analizę szczegółowego wzorca przewodzenia w małych przedsionkach mysich.

Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne przebiegi napięć błonowych i przejściowych stężeń Ca2+ w lewym przedsionku (LA) przy użyciu RH237 i Rhod2AM podczas stałego stymulowania z prawego przedsionka (RA). Obniżyliśmy częstotliwość próbkowania mapowania do 10 klatek/s, aby uzyskać odpowiedni stosunek sygnału do szumu dla sygnału Rhod2AM przy obecnych ustawieniach. System zapewnia jednak wystarczającą jakość do analizy zależności między potencjałem czynnościowym a przejściowym stężeniem Ca2+ .

Następnie przeprowadzamy indukcję tachyarytmii przedsionkowej za pomocą stymulacji programowanej u myszy w stanie patologicznym. Rycina 4 przedstawia zapis optyczny indukowanej AT w przedsionku mysim barwionym di-4-ANEPPS. Na 10 dni przed eksperymentem u myszy wykonuje się zabieg przechyłki aorty w celu zastosowania przeciążenia ciśnieniowego w przedsionku6. Indukujemy AT poprzez potrójną stymulację dodatkową (120/10/10/80) i obserwujemy propagację obwodu reentry.

Układ perfuzji serca w metodzie Langendorffa, schemat optyczny i rozmieszczenie elektrod w badaniach kardiologicznych.
Rysunek 1. System mapowania optycznego. a. Ogólny montaż systemu elektrofizjologii/mapowania optycznego. b. Schemat budowy systemu mapowania optycznego: niebieska strzałka wskazuje światło wzbudzenia generowane przez źródło światła. Obiektyw można wymieniać za pomocą rewolweru. Światło emitowane przez barwione serce jest dzielone pomiędzy kamerę 1 i kamerę 2. Kamera 1 wykrywa sygnały o długiej fali dla napięcia błonowego, a kamera 2 rejestruje długości fal z filtrem przepustowym 580 ± 20 nm dla Ca2+ przejściowy. Podczas procedury stale rejestrowano EKG i ciśnienie perfuzyjne, a sygnał EKG importowano jednocześnie do oprogramowania do rejestracji mapowania optycznego. c. Przygotowanie izolowanych serc: Serca kaniuluje się za pomocą tępej igły poprzez aortę wstępującą w celu perfuzji. Do jednoczesnego zapisu EKG katodę podłącza się do igły kaniulacyjnej, a anodę z elektrodą szpilkową wprowadza się do wierzchołka komory. d. Kaniula i elektrody: Serce zostaje poddane kaniulacji za pomocą stępionej igły o rozmiarze 21 G w celu perfuzji (igła do kaniulacji). Elektrodę stymulującą o rozmiarze 1 French (Elektroda) umieszcza się w prawym przedsionku poprzez rurkę polietylenową wprowadzoną do żyły głównej górnej. Szklana komora jest ogrzewana do 37 ˚C za pomocą podgrzanej wody cyrkulującej w płaszczu komory. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza anatomii serca, mapowanie konturów z użyciem obiektywów 5X/1,6X, schemat, wyniki badań optycznych.
Rycina 2. Mapa aktywacji w przedsionku. a. Reprezentatywne mapy aktywacji w widoku przednim przy użyciu obiektywu 5X oraz b. w widoku tylnym przy użyciu obiektywu 1,6X. (Panel lewy) Schemat izolowanego serca i przedsionka. (Panel prawy) Mapa aktywacji lewego przedsionka uzyskana dzięki barwieniu di-4-ANEPPS przy 10 0 klatkach/s. Rejestracja jest przeprowadzana podczas stałego stymulowania z elektrodą stymulującą umieszczoną w prawym przedsionku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat obrazowania serca przedstawiający fluorescencję Vm i Ca²⁺ wraz ze stymulacjami EKG i złączonymi danymi.
Rysunek 3. Podwójny pomiar potencjału czynnościowego i Ca2+2+ przejściowy w lewym przedsionku. a. Schemat izolowanego serca. b. Reprezentatywny obraz intensywności fluorescencji w lewym przedsionku z użyciem RH237 dla napięcia błonowego (Vm) oraz Rhod2AM dla Ca2+2+ przejściowy. Rejestracja jest wykonywana z użyciem obiektywu 5X przy częstotliwości 10 klatek/s. c. Jednoczesny zapis EKG (góra), sygnału RH237 (środek) oraz sygnału Rhod2AM (dół) podczas stałego stymulowania z elektrodą stymulującą w prawym przedsionku. Czarne strzałki wskazują impulsy stymulujące, a żółte strzałki wzbudzenie komór. W sygnale RH237 oraz sygnale Rhod2AM widoczny jest również efekt rozproszenia światła z komory (żółte groty strzałek). d. Nałożone na siebie ślady RH237 i Rhod2AM. Potencjał czynnościowy i przejściowy wzrost stężenia Ca2+2+ zmiany są rejestrowane jednocześnie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mapy cieplne tachykardii przedsionkowej i rytmu zatokowego; elektrofizjologia serca, diagram analizy konturowej.
Rysunek 4. Mapowanie aktywacji podczas tachykardii przedsionkowej. (Panel lewy) Schemat izolowanego serca. (Panel środkowy) Mapa aktywacji podczas tachykardii przedsionkowej (AT). Tachykardia AT została wywołana za pomocą stymulacji potrójnym dodatkowym impulsem (triple extrastimuli pacing) podanym z prawego przedsionka. (Panel prawy) Mapa aktywacji podczas rytmu zatokowego w tym samym sercu myszy. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Film uzupełniający 1. Reprezentacyjny film przedstawiający potencjał błonowy w przedsionku z wykorzystaniem barwienia di-4-ANEPPS. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający 2. Reprezentatywne nagrania mapowania aktywacji podczas tachykardii przedsionkowej i rytmu zatokowego. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Mapowanie optyczne jest dobrze znanym manewrem w badaniu elektrofizjologii serca7 i jest bardzo przydatnym narzędziem do oceny nie tylko komorowych arytmii 8,9, ale także przedsionkowych10,11. Jednoczesne mapowanie potencjału transbłonowego i stanów przejściowych Ca2+ jest przydatne do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw arytmii w odniesieniu do niewydolności serca i innych chorób serca12,13. Porównując inne metody oceny elektrofizjologicznej, takie jak te wykorzystujące pojedynczą komórkę lub arkusz komórek, jedną z absolutnych zalet mapowania optycznego w perfundowanym sercu jest ocena wzorca przewodzenia w nienaruszonym przedsionku i komorze, nie tylko podczas rytmu zatokowego, ale także podczas indukowanych arytmii14. Próba wykorzystania mysich serc, zwłaszcza przedsionka, jako substytutu człowieka napotkała trudności głównie ze względu na ich niewielkie rozmiary, jednak mysz jest atrakcyjnym modelem eksperymentalnym pod względem oceny w genetycznie zmodyfikowanym modelu zwierzęcym i ten problem musi zostać przezwyciężony. Nasze podejście zapewnia jeden kierunek, aby go rozwiązać.

Chociaż nasz aparat do mapowania optycznego był zasadniczo podobny do konwencjonalnego systemu dla całych mysich serc15, nasza metoda ma tę zaletę, że ocenia mysie przedsionek poprzez wprowadzenie do niego pewnych modyfikacji. Po pierwsze, dążyliśmy do uzyskania wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej do 0,1 ms/klatkę i 20 μm/piksel, a to mapowanie w wysokiej rozdzielczości przyczyniło się do bardziej precyzyjnego pomiaru prędkości przewodzenia i wzorca propagacji w mysim przedsionku. Po drugie, aby uniknąć niepotrzebnych uszkodzeń mechanicznych lub rozciągnięcia przedsionka, które mogłyby zmienić właściwości elektrofizjologiczne 16,17, igłę wprowadzającą się bezpośrednio do lewej komory wprowadza się bezpośrednio do lewej komory w celu zmniejszenia ciśnienia wewnątrzkomorowego, zamiast wprowadzać ją przez LA, jak to miało miejsce w poprzednim badaniu15. Ponadto bodziec stymulacyjny jest dostarczany przez specjalnie wykonany cewnik elektrodowy o rozmiarze 1 French umieszczony w RZS, ale nie przez elektrodę igłową, która może uszkodzić przedsionek. Unika się wszelkich szpilek w mocowaniu uszka przedsionkowego, które były używane w poprzednim badaniu15. Po trzecie, jeśli chodzi o ocenę mechanizmu leżącego u podstaw arytmii, kluczowy jest protokół zaprogramowanej stymulacji w celu wywołania tachyarytmii przedsionkowych18,19. Wykonujemy zaprogramowaną stymulację identyczną z tą w klinicznych badaniach elektrofizjologicznych, w tym stymulację impulsową i do potrójną stymulację pozabodźcową, z modyfikacją interwału stymulacji dla serca myszy. W związku z tym, oprócz podstawowych parametrów pomiarowych, protokół mógł ocenić indukowalność AT. W razie potrzeby ocenia się indukowalność AT za pomocą izoproterenolu lub innych leków. Z naszego doświadczenia wynika, że myszy typu dzikiego prawie nie wykazują żadnych AT, nawet po pełnym protokole stymulacji. W związku z tym indukowalność AT powinna być ważną informacją dla oceny udziału kilku stanów patologicznych, takich jak mutacje genetyczne, zabiegi chirurgiczne i podawanie leków11. Modyfikacje te mogą zoptymalizować precyzyjną ocenę elektrofizjologiczną w nienaruszonym mysim przedsionku.

Ta metoda ma również pewne ograniczenia. Po pierwsze, przy użyciu maksymalnej rozdzielczości przestrzennej z soczewką obiektywową 5X, pole widzenia (FOV) jest ograniczone do części przedsionka (tj. tylko uszka lewego przedsionka, jak pokazano na rysunku 2a). Aby uzyskać większe pole widzenia przedsionka, czasami preferowana jest soczewka obiektywowa 1,6X (ryc. 2b). Po drugie, bez zamocowania przedsionka za pomocą szpilek, czasami trudno jest prawidłowo zmierzyć właściwości przewodzenia przedsionków, ponieważ powierzchnia przedsionka jest zakrzywiona. Dlatego umieściliśmy szkło nakrywkowe na jego powierzchni, aby je spłaszczyć, zamiast mocować za pomocą kołków. Ta metoda jest również korzystna w zapobieganiu artefaktom ruchu spowodowanym wibracjami roztworu. Po trzecie, w przypadku naszej metody dość trudno jest uzyskać pełne pole widzenia, więc prawidłowe wykorzystanie widoku z przodu i z tyłu jest ważniejsze w naszym podejściu niż w drugim podejściu, jak pokazano na rysunku 2. Zaletą widoku przedniego byłaby wyraźna obserwacja ponownego wejścia w przypadku stanów patologicznych, zwłaszcza w wyrostku robaczkowym (ryc. 4). Z drugiej strony, widok tylny ma tę zaletę, że pozwala uzyskać dobry widok tylnej ściany przedsionka i może być szczegółowym zapisem aktywności wyzwalającej z rękawa mięśnia sercowego. Gdy trudno jest uzyskać odpowiedni widok i spłaszczyć jego zakrzywioną powierzchnię naszą metodą, przedsionek można przymocować przy minimalnym naprężeniu za pomocą kołków.

W przypadku naszej metody istnieją 3 możliwe problemy: niepowodzenie barwienia, stymulacja i indukcja arytmii. W przypadku niepowodzenia barwienia, jeśli nie obserwuje się fluorescencji lub obserwuje się ją nieznacznie, należy sprawdzić, czy aparat do mapowania optycznego jest prawidłowo zmontowany oraz czy odczynnik jest odpowiednio przechowywany i używany. Kluczowy jest również stan roztworu perfuzyjnego, który również może wpływać na właściwości elektrofizjologiczne samego serca, dlatego stan roztworu, w tym pH, temperatura i to, czy było wystarczające napowietrzenie, musi być ściśle monitorowany. Ważne jest również, aby unikać wszelkich zatorów powietrznych w sercu. W przypadku awarii stymulacji, jeśli bodźce stymulacyjne nie mogą pobudzić przedsionka, naukowcy powinni sprawdzić, czy okablowanie jest prawidłowe za pomocą testera obwodów. Gdy bodźce stymulacyjne są prawidłowo wyprowadzane, problemem jest kontakt elektrody z tkanką. Zmiana położenia elektrod może rozwiązać problem, a nasze podejście z użyciem cewnika stymulującego ułatwia to. W przypadku trudności w indukcji arytmii, stymulacja RV może być stosowana do indukcji AT w niektórych ograniczonych przypadkach. Za pomocą cewnika z elektrodą czterobiegunową, którego dwie dystalne elektrody i elektrody proksymalne mogą znajdować się odpowiednio w RV i RA, łatwo jest zmienić miejsce stymulacji z RA na RV. Cewnik ten jest również przydatny do przesuwania pobudzenia komorowego, gdy jednoczesny sygnał aktywacji komory maskuje sygnał wzbudzenia przedsionków.

Metoda ta przyczyni się do oceny interakcji genotyp-fenotyp w genach związanych z migotaniem przedsionków, nowo odkrytych w nowych badaniach, takich jak GWAS, szczególnie w przypadku genów, w przypadku których badanie nie wykazało ich za pomocą innych podejść. Wraz z postępem urządzeń i technik za pomocą tego podejścia można ocenić właściwości elektrofizjologiczne rękawa żyły płucnej, która jest ważnym źródłem AF20 w nienaruszonym sercu.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez Program Poprawy Środowiska Badawczego dla Młodych Badaczy ze Specjalnych Funduszy Koordynacyjnych na rzecz Promocji Nauki i Technologii (SCF) (do T.S.), Grants-in-Aid dla Badań Naukowych (Nr 16K09494, do T.S., Nr 26293052, do T.F.) z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT) Japonii. Dziękujemy firmie Brainvision i Panu Kenjiemu Tsubokurze za pomoc techniczną, a także Panu Johnowi Martinowi za jego pomoc językową.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(-)-BlebbistatynaSIGMAB0560-1MGOdsprzęgacz EC w celu wyeliminowania artefaktu ruchu podczas mapowania optycznego
RH237Biotium61018Barwnik wrażliwy na napięcie
Rhod2AMBiotium50024Wskaźnik Ca
Pluronic F-127 20% roztwór w DMSOBiotium# 59000W celu wzmocnienia barwienia za pomocą Rhod2AM
Di-4-ANEPPSWako041-29111Barwnik wrażliwy na napięcie
DimetylosulfotlenekWako046-21981Rozpuszczalnik do odczynników
Filtr górny do butelkiCorning430513Do filtrowania roztworu Tyrode'a
Haparin SodiumMochida Pharmaceutical Co., LtdN/AAby uniknąć zakrzepów krwi w tętnicy wieńcowej
Kamień powietrzny (φ 8 mm x 10 mm)Tokyo Koshin Rikagaku SeisakushoN/Ado napowietrzania
PentobarbitalKyoritsu Seiyaku CorporationN/A Doznieczulenia
Programowalny stymulatorFukuda DenshiBC-05Fukuda Denshi uprzejmie nas wynajął.
Power LabAD InstrumentsPowerlab 26/8SPDo rejestracji ciśnienia krwi i elektrokardiogramu
Bio AmpAD InstrumentsML132Amprifier do elektrokardiogramu
BP AmpAD InstrumentsFE117Wzmacniacz ciśnienia krwi
LabChartADInstruments Version 7Oprogramowanie do rejestracji i analizy ciśnienia krwi oraz elektrokardiogramu
Jednorazowy przetwornik ciśnienia krwiAD InstrumentsMLT0670przetwornik ciśnienia
1-Fr wykonany na zamówienie cewnik elektrodowyUnikalny medycznyNie dotyczyDo tempa prawego przedsionka
Rurka polietylenowa (OD: 0,8 mm, ID: 0,5 mm)Natume SeisakujoSP31Umieść w żyle głównej górnej w celu wprowadzenia cewnika elektrody
Millex-SV 5,00 μ mMerk MilliporeSLSV025LSDo filtrowania krążącej igły do zamieszkania Tyrode
o rozmiarze 24TERUMOSR-FS2419Wprowadzany do lewej komory w celu zmniejszenia ciśnienia w komorze
Igła o rozmiarze 21TERUMOSN-2170Nacinamy końcówkę igły i stępiamy ją piłując
igłę 25-gwarowąTERUMONN-2525R
Strzykawka 1 mlTERUMORura PVC SS-01T
TERUMOSF-ET0525do obwodu perfuzyjnego Langendorffa
Zawór trójdrogowyTERUMOTS-TL2Kdo obwodu perfuzyjnego Langendorffa
szalka PetriegoJako jeden3-1491-01
Custum wykonane ze szkła grzewczegoMotohashi RikaN/Ado utrzymywania temperatury roztworu perfuzyjnego
Custum wykonana szklana komora ocieplającaMotohashi RikaN/Ado utrzymywania temperatury roztworu perfuzyjnego
Urządzenie cyrkulacyjne o stałej temperaturzeLaudaE100podłączone do wężownicy grzewczej i komory grzewczej
Szkło nakrywkowe (25 mm i razy 60 mm)MatsunamiC025601Załóż przedsionki, aby spłaszczyć obszar nagrywania
Pompa PeristaATTOSJ-1211perystaltyczna
Stemi DV4Carl ZeissN/AStereoskop
MiCAM ULTIMA-L2Brainvision Inc.System mapowania optycznegoUL-L2
BV_Ana oprogramowanieBrainvision Inc.BV_AnaOprogramowanie do analizy danych
THT MacroscopeBrainvision Inc.THT-ZSEpi-Illumination Unit
Źródło światła LEDBrainvision Inc.LEX2-G
560nmBrainvision Inc.DM560Epi-Illuminatinon
Filtr wzbudzenia 520/35nmSemrock, Inc.FF01-520/35-25
Obiektyw projekcyjny Plan S 1.0XCarl Zeiss435200-0000-000
Napęd ostrościCarl Zeiss435400-0000-000
Rewolwer obiektywuCarl Zeiss435302-0000-000
Kolumna ręcznego ustawiania ostrościCarl Zeiss435400-0000-000
Podstawa makroskopuCarl Zeiss435430-9901-000
Prosty światłowódMORITEX CorporationMSG10-2200SEpi-Illuminatinon
MORITEX CorporationML-50
PLANAPO 5.0XObiektyw Leica Microsystems10447243
PLANAPO 1.0XLeica Microsystems10447157Obiektyw
1.6XLeica Microsystems10447050Rozdzielacz wiązki soczewek obiektywowych
Brainvision Inc.FLSP-2
Lustro dichroiczne 665nmBrainvision Inc.DM665rozdzielający wiązkę
572/28nmEdmund Optics#84-100Rhod2-AM
697/75nmSemrock, Inc.FF01-697/75-25RH237 i Di-4-ANEPPS
0,2 ml probówka do PCRGreiner Bio-One671201
folia aluminiowaToyo alumi0020
pompa Lustro dichroiczne Soczewka kondensatora PLANAPO Filtr emisyjny Filtr emisyjny

Bibliografia

  1. Gollob, M. H., et al. Somatic mutations in the Connexin 40 Gene (GJA5) in atrial fibrillation. New Engl J Med. 354, 2677-2688 (2006).
  2. Gudbjartsson, D. F., et al. Variants conferring risk of atrial fibrillation on chromosome 4q25. Nature. 448, 353-357 (2007).
  3. Ellinor, P. T., et al. Meta-analysis identifies six new susceptibility loci for atrial fibrillation. Nat. Genet. 44, 670-675 (2012).
  4. Sinner, M. F., et al. Integrating genetic, transcriptional, and functional analyses to identify 5 novel genes for atrial fibrillation. Circulation. 130, 1225-1235 (2014).
  5. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol-Heart C. 303, H753-H765 (2012).
  6. Oishi, S., et al. Stretch of Atrial myocytes stimulates recruitment of macrophages via ATP released through gap-junction channels. J. Pharmacol. Sci. 120, 296-304 (2012).
  7. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ. Res. 110, 609-623 (2012).
  8. Girouard, S. D., Pastore, J. M., Laurita, K. R., Gregory, K. W., Rosenbaum, D. S. Optical mapping in a new guinea pig model of ventricular tachycardia reveals mechanisms for multiple wavelengths in a single reentrant circuit. Circulation. 93, 603-613 (1996).
  9. Koizumi, A., et al. Genetic defects in a His-Purkinje system transcription factor, IRX3, cause lethal cardiac arrhythmias. Eur. Heart J. 37, 1469-1475 (2016).
  10. Glukhov, A. V., Uchida, K., Efimov, I. R., Nichols, C. G. Functional roles of KATP channel subunits in metabolic inhibition. J. Mol. Cell. Cardiol. 62, 90-98 (2013).
  11. Takahashi, K., et al. High-fat diet increases vulnerability to atrial arrhythmia by conduction disturbance via miR-27b. J. Mol. Cell. Cardiol. 90, 38-46 (2016).
  12. Choi, B. -R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. J. Physiol. 529, 171-188 (2000).
  13. Hwang, G. -S., et al. Intracellular calcium and vulnerability to fibrillation and defibrillation in Langendorff-perfused rabbit ventricles. Circulation. 114, 2595-2603 (2006).
  14. Kwaku, K. F., Dillon, S. M. Shock-induced depolarization of refractory myocardium prevents wave-front propagation in defibrillation. Circ. Res. 79, 957-973 (1996).
  15. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J. Vis. Exp. (55), e3275(2011).
  16. Eijsbouts, S. C. M., Majidi, M., Zandvoort, M. v, Allessie, M. A. Effects of acute atrial dilation on heterogeneity in conduction in the isolated rabbit heart. J. Cardiovasc. Electr. 14, 269-278 (2003).
  17. Ravelli, F., Allessie, M. Effects of Atrial dilatation on refractory period and vulnerability to atrial fibrillation in the isolated Langendorff-perfused rabbit heart. Circulation. 96, 1686-1695 (1997).
  18. Sasano, T., McDonald, A. D., Kikuchi, K., Donahue, J. K. Molecular ablation of ventricular tachycardia after myocardial infarction. Nat. Med. 12, 1256-1258 (2006).
  19. Wakimoto, H., et al. Induction of atrial tachycardia and fibrillation in the mouse heart. Cardiovasc. Res. 50, 463-473 (2001).
  20. Haissaguerre, M., et al. Spontaneous Initiation of Atrial Fibrillation by Ectopic Beats Originating in the Pulmonary Veins. New Engl J Med. 339, 659-666 (1998).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

obrazowanie o wysokiej rozdzielczo ciperfuzja Langendorffabarwnik wra liwy na napi cieprzej ciowy wzrost st enia wapniaczas trwania potencja u czynno ciowegomapa aktywacjipr dko przewodzenia
Elektrofizjologiczna ocena przedsionków myszy z mapowaniem optycznym o wysokiej rozdzielczości
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.