Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Frakcjonowanie subkomórkowe w celu aktywacji ERK po leczeniu peptydami pochodzącymi z mitochondriów

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56496

⸱

25 września 2017

 ,  ,  , 
1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak stymulować komórki peptydami pochodzącymi z mitochondriów i oceniać kaskadę sygnałową oraz lokalizację fosfobiałek.

Streszczenie

Wprowadzenie

Pojawiające się badania pokazują, że peptydy pochodzenia mitochondrialnego (MDP) odgrywają ważną rolę w cytoprotekcji i metabolizmie1,2,3. Zrozumienie szlaku transdukcji sygnału w obecności MDP daje nam wgląd w mechanizm, za pomocą którego MDP modulują różne funkcje. Wykazano, że pierwszy zidentyfikowany MDP, humanina, zwiększa fosforylację kinazy 1/2 regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK1/2) poprzez wiązanie z receptorem4,5. Jednak dalszy efekt aktywacji ERK1/2 jest nadal niedostatecznie zbadany.

Kaskada ERK1/2 służy jako niezbędny mediator w różnych procesach komórkowych, w tym proliferacji, migracji komórek, metabolizmu komórkowego, przeżycia i apoptozy6,7,8. Aby zaaranżować wszystkie te odrębne procesy komórkowe, aktywność i subkomórkowa lokalizacja ERK1/2 są ściśle regulowane przez fosfatazy i białka rusztowania9,10. Oprócz modyfikacji potranslacyjnej, dynamiczne przenoszenie ERK1/2 reguluje również jego funkcję sygnalizacyjną, aktywność i swoistość11,12. ERK1/2 jest przede wszystkim zlokalizowany w klasie cytozol13. Zestaw białek kotwiczących i rusztujących pomaga zatrzymać ERK1/2 w elementach cytoszkieletu, na powierzchni organelli lub rozproszonych w cytoplazmie13. Po stymulacji ERK1/2 ulega fosforylacji i zostaje odłączony od białek kotwiczących, umożliwiając translokację ERK1/2 do innych przedziałów subkomórkowych, w tym jądra, mitochondriów, Golgiego i lizosomów14,15,16.

Chociaż wiadomo, że humanina aktywuje szlak sygnałowy ERK1/2, aktywacja ERK1/2 jest obserwowana tylko w całkowitych lizatach komórkowych. Jak opisano wcześniej, ponieważ lokalizacja subkomórkowa ERK1 / 2 odgrywa kluczową rolę w jego dalszym efekcie, analiza zarówno lokalizacji subkomórkowej, jak i całkowitych poziomów fosforylowanego ERK1 / 2 jest konieczna, aby zapewnić kompleksowe zrozumienie indukowanej przez człowieka aktywacji ERK1 / 2 i aktywacji dalszych celów.

Aby zrozumieć docelowe organelle aktywowanego ERK1/2, przeprowadzono subkomórkowe frakcjonowanie, a następnie western blot dla fosforylowanego ERK1/2. Ta metoda może być łatwo wdrożona, ponieważ wykorzystuje standardowy sprzęt laboratoryjny i odczynniki. Izolowane przedziały subkomórkowe mają wysoką czystość, co pozwala na bezpośrednią interpretację wyników. Barwienie immunologiczne ERK1/2 może dać podobne wyniki. Jednak niektóre przedziały subkomórkowe są stosunkowo trudne do uwidocznienia i wymagają specjalnych metod utrwalania i przepuszczalności. Poziomy ERK1/2 różnią się w przedziałach subkomórkowych, a ta zmienność może powodować fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne sygnały, gdy patrzy się na lizaty całych komórek. Dlatego immunoblot wykorzystujący izolowane przedziały subkomórkowe daje nam lepsze zrozumienie lokalizacji ERK1/2.

Wszechstronność metody umożliwia modyfikacje protokołu w celu zbadania efektów innych stymulantów, w tym innych MDP, lub translokacji innych cząsteczek sygnałowych, takich jak STAT3. Niedawno odkryte małe peptydy podobne do humaniny (THLP) są kodowane z regionu 16S rRNA, w którym kodowana jest humanina, i mają podobne, ale odrębne właściwości w porównaniu do HN17. Na przykład SHLP2 i SHLP3 aktywują ERK1/2 po 8 godzinach, chociaż humanin aktywuje ERK1/2 w ciągu 5 minut. Badanie subkomórkowej lokalizacji ERK1/2 w odpowiedzi na różne peptydy pozwoli nam lepiej zrozumieć biologię tych peptydów. Pojawiające się dowody wykazały, że subkomórkowa lokalizacja cząsteczek sygnałowych odgrywa kluczową rolę w ich dalszych skutkach. Na przykład, tradycyjnie wiadomo, że STAT3 jest pierwotnie zlokalizowany w cytozolu w komórkach w stanie spoczynku, a następnie przemieszcza się do jądra, aby aktywować ekspresję genów w odpowiedzi na cytokiny18. STAT3 również translokuje się do mitochondriów i reguluje cykl TCA oraz produkcję ATP19. Jeśli chodzi o regulację autofagii, różna subkomórkowa lokalizacja STAT3 moduluje autofagię na różne sposoby20. Na przykład jądrowy STAT3 transkrypcyjnie reguluje geny związane z autofagią i działa jako modulator autofagii. Cytoplazmatyczny STAT3 konstytutywnie hamuje autofagię poprzez interakcję z cząsteczkami sygnalizacyjnymi autofagii. Mitochondrialny STAT3 hamuje i zapobiega mitofagii poprzez tłumienie autofagii wywołanej stresem oksydacyjnym. Dlatego ta metoda izolacji przedziałów subkomórkowych ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia roli innych cząsteczek sygnałowych, a także ERK1/2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Leczenie komórek peptydami

  1. Umieść dwa miliony komórek SH-SY5Y lub HEK293 (2 x 106) w naczyniu o średnicy 10 cm i hoduj je przez 2 dni
  2. (Opcjonalnie) Następnego dnia przemyj komórki jednokrotnie zmodyfikowanym podłożem Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco bez surowicy i inkubuj z DMEM bez surowicy przez noc, jeśli zabieg musi być wykonany w pożywce wolnej od surowicy.
  3. W dniu 3 rozpuść peptydy S14G-humaniny w przefiltrowanej wodzie destylowanej o stężeniu 0,2 μm i rozpuść je w postaci 1 mM roztworu podstawowego.
    UWAGA: Peptydy powinny być rozpuszczone w odpowiednim rozpuszczalniku, który można określić na podstawie charakterystyki sekwencji peptydu (np. całkowitego ładunku) i może być dostarczony przez producenta, jeśli peptydy są dostępne w handlu. Na przykład S14G-humanina, SHLP2 i SHLP6 oraz MOTS-c rozpuszczają się w wodzie. Podwielokrotność peptydów należy podać w odpowiedniej objętości (np. 50 μl), aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania. Po rozmrożeniu nie używaj ich ponownie.
  4. Podwielokrotnić wstępnie ogrzaną pożywkę zawierającą surowicę lub bezsurowicę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodać 1 mM roztworu podstawowego o temperaturze pokojowej, aby uzyskać stężenie robocze (np. 1 μM, 10 μM).
  5. Zastąp pożywkę 6 ml roztworu peptydowego z kroku 1.4. i inkubuj komórki przez odpowiedni czas.
    UWAGA: Wybierz czas inkubacji w zależności od swojego stanu, który aktywuje ERK.

2. Subkomórkowe frakcjonowanie cytozolu i jądra

  1. Umyj komórki dwukrotnie 10 ml lodowatego PBS, zeskrob komórki z płytki w 5 ml lodowatego PBS i przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  2. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Odessać PBS i ponownie zawiesić osad w 200 μl lodowatego buforu frakcjonującego (10 mM HEPES pH = 7,6, 3 mM MgCl2, 10 mM KCl, 5% (v/v) glicerol, 1% niejonowy środek powierzchniowo czynny (C13H22O(C2H4O)n), inhibitory proteazy/fosfatazy).
    UWAGA: Aby utrzymać białka w stanie fosforylacji, inhibitor fosfatazy oraz inhibitor proteazy powinny być świeżo dodane, a próbki powinny być przez cały czas przechowywane na lodzie. Należy unikać powtarzania cykli zamrażania i rozmrażania próbek. Podwielokrotność próbek rozdrabnia się do niewielkiej ilości (np. 50 μg) przed zamrożeniem w temperaturze -80 °C.
  4. Zawiesinę zawiesiny inkubować na lodzie przez 15 minut, a następnie odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Zbierz supernatant jako frakcję cytoplazmatyczną i zachowaj osad dla frakcji jądrowej.
  6. Odwirować supernatant w celu usunięcia resztek komórkowych i innych zanieczyszczeń w temperaturze 18 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. To jest frakcja cytozolu.
  7. Zawiesić osad w 200 μl lodowatego buforu do przemywania (10 mM HEPES pH = 7,6, 1,5 mM MgCl2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) glicerolu, 0,2 mM EDTA, inhibitory proteazy/fosfatazy) i odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C
  8. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl lodowatego buforu do ekstrakcji jądrowej (20 mM HEPES pH = 7,6, 1,5 mM MgCl2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) glicerol, 0,2 mM EDTA, inhibitory proteazy/fosfatazy) i sonikować 10 razy (5 s wł., 10 s wyłącz., 30% amp.) na lodzie.
  9. Wirować przy 18 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. To jest frakcja jądrowa.
  11. Określić ilościowo ilość białka za pomocą testu BCA

3. Surowa frakcja mitochondrialna

  1. Umyj komórki w każdym 10 cm naczyniu 10 ml lodowatego PBS, dodaj 5 ml lodowatego PBS i odłącz komórki za pomocą skrobaka do komórek.
    UWAGA: Użyj trzech 10-centymetrowych szalek komórek, aby uzyskać dobrą wydajność mitochondriów do Western Blotting.
  2. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i połączyć wszystkie z trzech 10-centymetrowych szalek w jedną stożkową probówkę o pojemności 15 ml.
  3. Odwirować komórki przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Odessać PBS i ponownie zawiesić osad w 1 ml lodowatego buforu do izolacji mitochondriów (10 mM Tris-MOPS, 1 mM EGTA/Tris, 200 mM sacharozy, dostosować do pH = 7,4).
  5. Homogenizować komórki za pomocą 25 pociągnięć homogenizatora o pojemności 2 ml tłuczkiem pokrytym politetrafluoroetylenem na lodzie.
    UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla utrzymania integralności mitochondriów i maksymalizacji wydajności frakcji mitochondrialnej. Liczba pociągnięć powinna być zoptymalizowana dla każdego typu komórki. Wstępnie schłodzić homogenizator przed rozpoczęciem procedury.
  6. Przenieść homogenat do probówki do mikrowirówki i odwirować go przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia jąder i nieuszkodzonych komórek.
  7. Zebrać supernatant, przenieść go do nowej probówki do mikrowirówki i odwirować przy 7 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Osad jest luźny, należy ostrożnie zebrać supernatant i starać się nie naruszyć osadu.
  8. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad z 200 μl lodowatego buforu do izolacji mitochondriów i przenieść roztwór do nowej probówki do mikrowirówki. Odwirować probówkę o sile 7 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Powtórz krok 3.8, aby umyć granulkę. Na tym etapie nie jest konieczne przenoszenie supernatantu do nowej probówki do mikrowirówki.
  10. Usunąć supernatant z przemytego osadu i ponownie zawiesić osad zawierający mitochondria za pomocą 50 μl buforu RIPA.
  11. Inkubować zawiesinę na lodzie przez 10 minut.
  12. Odwirować zawiesinę o sile 16 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  13. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. To jest frakcja mitochondrialna.
  14. Określ ilościowo ilość białka za pomocą testu BCA.

4. Western Blotting dla białek fosfospecyficznych

  1. Wykonaj elektroforezę w żelu poliakrylamidowym SDS (8-16% wstępnie przygotowanego żelu) i przenieś białko do membrany PVDF4.
  2. Inkubować membranę z 5% BSA w TBST (0,1% Polisorbat 20) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania tła.
    UWAGA: W celu wykrycia fosforylowanego białka, zablokuj błonę za pomocą BSA, a nie Milk. Mleko zawiera kazeinę, obficie występującą fosfoproteinę, która powoduje wysoki sygnał niespecyficzny.
  3. Inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem (anty-fosfo-ERK1/2) w temperaturze 4 °C przez noc.
  4. Następnego dnia przemyj membranę TBST (0,1% polisorbatu 20) trzykrotnie przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym (anty-króliczym HRP) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  6. Umyć membranę TBST (0,1% polisorbatu 20) trzy razy przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Inkubować membranę z roztworem ECL i obrazować membranę w analizatorze obrazu.
  8. Zdjąć membranę z buforem do oddzielania przez 15 minut w temperaturze pokojowej i przemyć membranę TBST trzy razy przez 5 minut.
  9. Powtórzyć kroki od 4.2 do 4.7 przy użyciu przeciwciała anty-całkowitego ERK1/2.
  10. Aby sprawdzić czystość każdej frakcji, uruchom SDS-PAGE i wykonaj immunobloty przy użyciu przeciwciał rozpoznających markery dla każdego przedziału (np. Lamina B1 dla jądra, GAPDH dla cytozolu i TOM20 dla mitochondriów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując przedstawioną tutaj procedurę, traktowaliśmy komórki HEK293 i SH-SY5Y odpowiednio 1 μM i 100 μM S14G-humaniny, silnego analogu humaniny21, w pożywce kompletnej przez wskazane okresy czasu (Rycina 1A i Rycina 1B). Następnie w całkowitych ekstraktach białkowych badaliśmy całkowitą i fosforylowaną formę ERK1/2 w obrębie Thr202/Tyr204. Leczenie S...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj wykazaliśmy, że aktywacja ERK1 / 2 za pośrednictwem peptydu humaniny zachodzi w dwóch różnych typach komórek, a subkomórkowa lokalizacja aktywowanego ERK1 / 2 może być różna w zależności od warunków (np. dawki peptydu, punktu czasowego i typu komórki). Wykazano, że humanina wysyła sygnały przez dwa różne receptory22,23, co może wyjaśniać różnice w sygnalizacji między dwiema liniami komórkowymi, a także zapotrzebowanie na różne dawki humaniny. Fizjo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Pinchas Cohen jest udziałowcem i konsultantem w CohBar, Inc. Kelvin Yen pełnił funkcję konsultanta w CohBar, Inc.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Ellison/AFAR Postdoctoral Fellowship in Aging Research Program dla SJK, oraz Glenn Foundation Award i granty NIH dla PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). W filmie pojawiają się wszyscy autorzy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
p44 / 42 MAPK (ERK1 / 2)Sygnalizacja komórkowa9102Rozcieńczenie 1: 1,000
phospho-p44 / 42 MAPK (ERK1 / 2) (Thr202 / Tyr204)Sygnalizacja komórkowa4370Rozcieńczenie 1: 1,000
Lamina B1Sygnalizacja komórkowa12586Marker jądrowy, Rozcieńczenie 1: 1,000
GAPDHSygnalizacja komórkowa5174Marker cytoplazmatyczny, Rozcieńczenie 1: 2,000
Tom20Santa cruzSC-17764Marker mitochondriów, Rozcieńczenie 1:2,000
Sprzężony anty-Rabbit-HRPSygnalizacja komórkowa7074Rozcieńczenie 1:30,000
Bufor do lizy i ekstrakcji RIPAThermoFisher SCIENTIFIC89900
100 mm Naczynie hodowlaneThermoFisher SCIENTIFIC12556002
Peptyd HNGGenescript
25mm Filtr filtracyjnyThermoFisher SCIENTIFIC09-719A
HEPESSigmaH3375
MgCl2SigmaM8266
KClSigmaP9333
GlicerolSigmaG9012
Triton X-100ThermoFisher SCIENTIFICBP151-100
EDTASigma3609
MOPSSigmaM1254
EGTASigmaE3889
SacharozaSigmaS7903
Tris-baseThermoFisher SCIENTIFICBP152-1
HCLSigmaH1758
PBSLonza17-512F
Skrobak do komórekFALCON353085
Zatrzymaj się i handluj; Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy (100X)ThermoFisher SCIENTIFIC78440
Thomas Pulle Młynek do tkanek z gładkimi tłuczkamiThomas Scientific3432S90
Tween-20ThermoFisher SCIENTIFICBP337-500
BSAThermoFisher SCIENTIFICBP1600-100
8-16% prefabrykowane żelebiałkowe Mini-PROTEAN TGXBIO RAD4561104
Mini moduł Trans-BlotBIO RAD1658030
System Turbotransferu Trans-BlotBIO RAD1704150
Zestaw transferowy Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDFBIO RAD1704272
Clarity Zachodnie podłoża do bibułowania ECLRAD1705060
Restore Bufordo usuwania plam Western blotThermoFisher SCIENTIFIC21059
Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle MediumThermoFisher SCIENTIFIC11965-092
Sonikator, Nazwa: FB120ThermoFisher SCIENTIFIC695320-07-12
BIO

Bibliografia

  1. Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance. J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).
  2. Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action. PloS one. 4 (7), 6334(2009).
  3. Lee, C., Yen, K., Cohen, P. Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides. Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).
  4. Kim, S. J., Guerrero, N., et al. The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus. Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).
  5. Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
  6. Zhang, W., Liu, H. T. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).
  7. Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. MAP kinases and cell migration. J. Cell Sci. 117, Pt 20 4619-4628 (2004).
  8. Cagnol, S., Chambard, J. -C. ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence. FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).
  9. Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
  10. Morrison, D. K., Davis, R. J. Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).
  11. Wainstein, E., Seger, R. The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles. Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).
  12. Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus. Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).
  13. Kolch, W. Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).
  14. Horbinski, C., Chu, C. T. Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death. Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).
  15. Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization. Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).
  16. Zhu, J. -H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases. Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).
  17. Cobb, L. J., Lee, C., et al. Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers. Aging. 8 (4), 796-809 (2016).
  18. Ihle, J. N. The Stat family in cytokine signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).
  19. Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism. Sci. Rep. 6 (1), 39517(2016).
  20. You, L., Wang, Z., et al. The role of STAT3 in autophagy. Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).
  21. Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults. The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).
  22. Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
  23. Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Peptydy pochodzenia mitochondrialnegoWestern blottinghodowla komórkowafrakcja cytoplazmatycznafrakcja jądrowaizolacja mitochondriówtraktowanie humaninąfosforylacja ERK
Frakcjonowanie subkomórkowe w celu aktywacji ERK po leczeniu peptydami pochodzącymi z mitochondriów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.