Artykuł metodologiczny

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu obserwacji podstawowych procesów podczas wzrostu komórek drobnoustrojów

DOI:

10.3791/56497

⸱

24 listopada 2017

 ,  , 
1Division of Biological Sciences, University of Missouri

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie funkcji podstawowych procesów zachodzących w bakteriach jest wyzwaniem. Mikroskopia fluorescencyjna z barwnikami specyficznymi dla celu może dostarczyć kluczowych informacji na temat wzrostu komórek drobnoustrojów i progresji cyklu komórkowego. W tym przypadku Agrobacterium tumefaciens jest używany jako bakteria modelowa w celu podkreślenia metod obrazowania żywych komórek w celu scharakteryzowania podstawowych procesów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podstawowe procesy komórkowe, takie jak replikacja i segregacja DNA, synteza białek, biosynteza ściany komórkowej i podział komórek, opierają się na funkcji białek, które są niezbędne do przetrwania bakterii. Seria barwników specyficznych dla celu może być wykorzystana jako sondy, aby lepiej zrozumieć te procesy. Barwienie barwnikami lipofilowymi umożliwia obserwację struktury błony, wizualizację mikrodomen lipidowych oraz detekcję pęcherzyków błonowych. Zastosowanie fluorescencyjnych aminokwasów d (FDAA) do badania miejsc biosyntezy peptydoglikanu może wskazywać na potencjalne defekty w biogenezie ściany komórkowej lub wzorcu wzrostu komórek. Wreszcie, barwienie kwasami nukleinowymi może wskazywać na możliwe defekty w replikacji DNA lub segregacji chromosomów. Barwienie cyjaninowym DNA oznacza żywe komórki i nadaje się do mikroskopii poklatkowej, umożliwiając obserwację morfologii nukleoidów w czasie rzeczywistym podczas wzrostu komórek. Protokoły znakowania komórek można zastosować do mutantów zubożonych w białka w celu identyfikacji defektów w strukturze błony, biogenezie ściany komórkowej lub segregacji chromosomów. Co więcej, mikroskopia poklatkowa może być wykorzystywana do monitorowania zmian morfologicznych po usunięciu niezbędnego białka i może dostarczyć dodatkowych informacji na temat funkcji białka. Na przykład wyczerpanie podstawowych białek podziału komórkowego powoduje filamentację lub rozgałęzienie, podczas gdy wyczerpanie białek wzrostu komórek może spowodować, że komórki staną się krótsze lub bardziej okrągłe. W tym miejscu przedstawiono protokoły wzrostu komórek, znakowania specyficznego dla celu i mikroskopii poklatkowej dla bakteryjnego patogenu roślin Agrobacterium tumefaciens. Razem, barwniki specyficzne dla celu i mikroskopia poklatkowa umożliwiają scharakteryzowanie podstawowych procesów zachodzących u A. tumefaciens. Wreszcie, dostarczone protokoły można łatwo modyfikować w celu zbadania podstawowych procesów zachodzących u innych bakterii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postęp w cyklu komórkowym bakterii wymaga koordynacji wielu procesów, w tym biosyntezy błony i ściany komórkowej, replikacji i segregacji DNA oraz podziału komórek. Aby w pełni zrozumieć złożoność biologii komórek bakteryjnych, konieczne jest zbadanie tych podstawowych zdarzeń; Jest to jednak nietrywialne zadanie, ponieważ żywotność komórek jest zagrożona, gdy kluczowe składniki tych szlaków są mutagenne. Mikroskopia epifluorescencyjna w połączeniu z barwnikami specyficznymi dla celu jest skutecznym podejściem do badania tych podstawowych procesów w dzikich i zmutowanych szczepach bakterii.

Barwniki specyficzne dla peptydoglikanu obejmują antybiotyki fluorescencyjne (wankomycyna-FL, bocylina-FL) i fluorescencyjne d-aminokwasy (na przykład kwas 7-hydroksykumaryno-3-karboksylowy-3-amino-d-alanina, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanina, NADA; tetrametylorodamino-3-amino-d-alanina; TADA). W przypadku bakterii Gram-dodatnich zastosowanie subletalnych stężeń fluorescencyjnych analogów antybiotyków do badania miejsc biosyntezy peptydoglikanu było skuteczną strategią ujawniania wzorców insercji peptydoglikanu1,2,3,4. Podczas gdy fluorescencyjne znakowanie wankomycyną zostało wykorzystane do uzyskania wglądu w wzorce wstawiania peptydoglikanu w utrwalonych bakteriach Gram-ujemnych5, błona zewnętrzna na ogół zapewnia barierę przepuszczalności, która uniemożliwia stosowanie antybiotyków fluorescencyjnych jako sondy do biosyntezy peptydoglikanu w żywych komórkach. W przeciwieństwie do tego, krótkie impulsy fluorescencyjnych d-aminokwasów lub d-aminokwasów z biortogalnymi grupami funkcyjnymi kowalencyjnie oznaczają regiony niedawnej insercji peptydoglikanu w szerokim zakresie żywych komórek bakteryjnych6,7. Wzorce insercji peptydoglikanu, które zaobserwowano w przypadku syntetycznych d-aminokwasów, obejmują punktowy i przegrodowy (Escherichia coli i Bacillus subtilis), polarny i przegrodowy (Agrobacterium tumefaciens i Listeria monocytogenes), samą przegrodę (Staphylococcus aureus) i wierzchołkową (Streptomyces venezuelae)6,7. Obserwacje te wskazują, że bakterie wykazują różne wzorce biogenezy ściany komórkowej i że stosowanie syntetycznych d-aminokwasów jako sond do badania wzorców wzrostu jest cenną strategią u wielu bakterii.

Barwniki oznaczające chromosomy bakteryjne zawierają specyficzny dla kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) spoiwo drobnego rowka (4,6-diamidyn-2-fenyloindol; DAPI) i barwniki cyjaninowe o wysokim powinowactwie (zielony i pomarańczowy; patrz lista materiałów). Barwienie DAPI komórek stałych pomaga w wyliczaniu bakterii z próbek środowiskowych8, podczas gdy barwienie DAPI żywych komórek służy do wskazania żywotności bakterii9. W przeciwieństwie do tego, barwniki cyjaninowe, takie jak pomarańczowy i zielony, są często opisywane jako nieprzepuszczalne dla błony "martwe" barwniki komórkowe w celu wyliczenia komórek niezdolnych do życia9. Co ciekawe, gdy te odczynniki są używane do badania morfologii bakteryjnego nukleoidu podczas wzrostu komórek, wykazano, że DAPI, pomarańczowy i zielony są przepuszczalne przez błonę i zdolne do znakowania żywych komórek10. W żywych komórkach E. coli barwienie DNA DAPI wydaje się rozproszone z powodu autofluorescencji z cytoplazmy, a powtarzające się ekspozycje komórek barwionych DAPI na światło ultrafioletowe (UV) zaburzają strukturę nukleoidu10. Barwienie E. coli lub B. subtilis pomarańczą ujawnia, że barwnik ten jest przepuszczalny przez błonę i zapewnia długotrwałą fluorescencję po związaniu się z DNA w żywych komórkach bez wpływu na wzrost komórek, replikację DNA lub segregację chromosomów10. Obserwacje te sugerują, że cyjaninowe barwniki DNA mogą być używane do monitorowania morfologii nukleoidów podczas wzrostu komórek u wielu bakterii.

Specyficzne dla fosfolipidów barwniki strylowe, takie jak N-(3-trietyloamoniompropylo)-4-(6-(4-(dietyloamino)fenylo)heksatrienylo)pirydyny dibromek (4-64; zobacz listę materiałów) są związkami kationowymi i kojarzą się preferencyjnie z ujemnie naładowanymi fosfolipidami, takimi jak kardiolipina i fosfatydyloglicerol11. Wyraźne wzorce obserwuje się, gdy 4-64 jest używany do oznaczania błony różnych bakterii. U Escherichia coli 4-64 jest wzbogacony w biegunach, w pasmach wzdłuż ściany bocznej oraz w miejscach podziału późnych komórek przedpodziałowych12. U Bacillus subtilis znakowanie 4-64 umożliwia wizualizację spiral lipidowych13. U Agrobacterium tumefaciens, 4-64 oznacza błonę zewnętrzną i jest obserwowany w charakterystycznym "podkowiastym" wzorze, w którym biegun wzrostu jest pozbawiony etykietowania14,15. Obserwacje te wskazują, że bakterie te wykazują niejednorodne rozmieszczenie lipidów ze względu na obecność domen lipidowych, które przyczyniają się do asymetrii komórkowej. Zmiany we wzorcach znakowania 4-64, takie jak obecność znakowania rozproszonego, pęcherzyków lub pęcherzyków, wgłębień lub skurczu błony, mogą być pouczające w charakterystyce mutantów, które wpływają na dystrybucję lub biosyntezę lipidów.

Poza barwieniem komórek, konieczne jest określenie funkcji białek uczestniczących w podstawowych procesach. Charakterystyka niezbędnych białek jest technicznie trudna, ponieważ nie jest możliwe usunięcie niezbędnych genów i zbadanie konsekwencji fenotypowych. W ten sposób pojawiły się alternatywne podejścia, które zubażają białko. Na przykład, niezbędny gen może być poddany kontroli indukowalnego promotora, a nie jego natywnego promotora. Indukowalne promotory reagują na małe cząsteczki, takie jak; zinc16, izopropyl β-d-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)17,18,19,20,21, arabinose22, vanillate17,23, oraz xylose23, w ten sposób transkrypcja genu docelowego ustaje, a białko będące przedmiotem zainteresowania ulega wyczerpaniu po usunięciu induktora. Alternatywne podejścia do wyczerpywania się podstawowych białek obejmują syntetyczne ryboprzełączniki24, które wykorzystują interakcje małych cząsteczek z RNA, aby utrudnić transkrypcję docelowych genów, interferencja CRISPR25,26 w celu zablokowania transkrypcji docelowych genów oraz indukowalna degradacja białek27,28 który wykorzystuje znaczniki peptydowe do kierowania białek do degradacji przez proteazę ClpXP. Szczepy zubożone zapewniają tylko krótki czas na scharakteryzowanie, zanim komórki stracą żywotność, dlatego obrazowanie mikroskopowe komórek w czasie podczas zubożenia białka jest potężnym podejściem do charakteryzacji. Rzeczywiście, mikroskopia żywych komórek bakteryjnych umożliwiła naukowcom uzyskanie wglądu w podstawowe procesy biologiczne, w tym mechanizmy utrzymywania kształtu komórek, wydzielania i podziału na kompartmenty29.

A. tumefaciens to bakteryjny patogen roślin30 i naturalny inżynier genetyczny31,32. Tak więc mechanizmy związane z chorobotwórczością, w tym interakcje gospodarz-patogen33,34,35, secretion36 i transformacja hosta30,31,37 zostały dokładnie zbadane. Aby opracować strategie, które zapobiegają chorobom, w których pośredniczy A. tumefaciens, lub wspomagają transformację roślin, konieczne jest lepsze zrozumienie procesów niezbędnych do przetrwania A. tumefaciens. Zastosowanie barwników specyficznych dla celu i niedawne opracowanie strategii detruzji białek dla A. tumefaciens18 dostarcza środków do badania podstawowych procesów.

Tutaj znajdują się szczegółowe protokoły do analizy mikroskopowej szczepów A. tumefaciens typu dzikiego, zmutowanego i zubożającego białka. Pierwsze dwa protokoły opisują, w jaki sposób przygotować komórki i oznaczyć je barwnikami specyficznymi dla celu. Trzeci protokół zawiera instrukcje krok po kroku, jak przygotować płatki agarozowe (Rysunek 1) i obrazować komórki bakteryjne (Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4). Protokoły te mogą być również odpowiednie dla innych bakterii z dodatkowymi adaptacjami w celu uwzględnienia różnych warunków pożywki, tempa wzrostu, zapotrzebowania na tlen i struktur komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wzrost szczepów A. tumefaciens

  1. Hodowla szczepów A. tumefaciens
    1. Użyj sterylnego drewnianego patyczka lub końcówki pipety, aby zaszczepić 1 ml pożywki wzrostowej ATGN (przepis znajduje się na liście materiałów) pojedynczą kolonią pożądanego szczepu.
      UWAGA: W przypadku szczepów zubożających A. tumefaciens, ATGN powinien zawierać 1 mM IPTG jako induktor w celu utrzymania biosyntezy niezbędnego białka.
    2. Szczepy A. tumefaciens należy uprawiać przez noc w ATGN w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem przy 225 obr./min.
    3. Zmierzyć gęstość optyczną komórek przy 600 nm (OD600) za pomocą spektrofotometru. Rozcieńczyć kulturę komórkową do OD600 = ~0,2 i kontynuować wzrost, aż zostanie osiągnięty OD600 = ~0,6. W przypadku szczepów zubożających kontynuuj wzrost z induktorem, aż zostanie osiągnięty OD600 = ~0,6.
    4. Stosować dzikie i zmutowane szczepy A. tumefaciens przy OD600 = ~0,6 do barwienia specyficznego dla celu i/lub mikroskopii poklatkowej (patrz sekcje 2 i 3.1). W przypadku szczepów zubożających należy przepłukać induktor (patrz punkt 1.2).
  2. Usunięcie induktora w celu scharakteryzowania szczepów zubożających białko A. tumefaciens
    1. Osad 1 ml kultury wykładniczej (OD600 = ~0,4-0,6) przez odwirowanie przy 7,000 x g przez 5 minut w wirówce stacjonarnej w temperaturze pokojowej.
    2. W celu przemycia, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w świeżym podłożu bez induktora i zagnieździć ogniwa w sposób opisany powyżej (1.2.1). Umyj komórki w sumie 3 razy na świeżym podłożu.
    3. Ponownie zawiesić końcowe osady w świeżej pożywce i skoncentrować komórki do OD600 = ~ 0,8 w celu natychmiastowego barwienia barwnikami specyficznymi dla celu (sekcja 2 i Rysunek 4B-D) lub mikroskopia poklatkowa (sekcja 3.2 i Figura 4A). Alternatywnie, wstępnie zuboż komórki przez żądany czas, hodując komórki w pożywce bez induktora przed barwieniem i obrazowaniem komórek.

2. Specyficzne dla celu barwienie komórek A. tumefaciens

  1. Fluorescencyjne znakowanie ściany komórkowej d-aminokwasów
    UWAGA: FDAA są nietoksycznymi fluorescencyjnymi d-aminokwasami, które są łatwo włączane do peptydoglikanu A. tumefaciens. Ta prosta procedura etykietowania bada wzorce wzrostu w żywych komórkach6. Dostępne są protokoły syntezy czterech FDAA38.
    1. Granulat 500 μL kultury wykładniczej (OD600 = ~0,4-0,6) przez odwirowanie przy 7,000 x g przez 5 minut w wirówce stacjonarnej. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl świeżej pożywki.
    2. Dodać 5 μl 5 mM FDAA do umytych i skoncentrowanych komórek i inkubować przez 2 minuty w ciemności.
      UWAGA: Ogranicz ekspozycję FDAA na światło. Czas inkubacji będzie się różnił w zależności od tempa wzrostu szczepu. Zazwyczaj czas inkubacji powinien wynosić 5-10% czasu podwojenia6.
    3. Osadzać komórki przez odwirowanie i trzykrotnie przemywać granulki komórek solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
    4. Zawiesić granulat w ~50 μL PBS.
      UWAGA: Objętość PBS użytego do ponownego zawieszenia może się różnić w zależności od wielkości granulki.
    5. Nałożyć 0,8-1 μl komórek na podkładkę agarozową i natychmiast zobrazować za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej (patrz punkty 3.1 i 3.2).
      1. Alternatywnie, zaprzestań dalszego umieszczania etykiet, mocując ogniwa lodowatym 70% etanolem. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml lodowatego 70% etanolu i inkubować na lodzie przez 15 minut.
      2. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić w małej objętości PBS do obrazowania w późniejszym czasie. Zawiesiny komórek należy przechowywać w temperaturze 4 °C i wykonać zdjęcie w ciągu 48 godzin.
  2. Barwienie DNA za pomocą DAPI lub Orange stain
    UWAGA: Aby zaobserwować strukturę DNA, komórki są znakowane DAPI lub pomarańczowo (barwienie martwych komórek). Chociaż klasycznie opisywany jako "plama martwych komórek", pomarańczowy jest przepuszczalny, fotostabilny i nie wpływa na wzrost komórek bakteryjnych, umożliwiając obrazowanie DNA żywych komórek10. U A. tumefaciens znakowanie pomarańczowe działa dobrze w żywych komórkach i nadaje się do mikroskopii poklatkowej (Ryc. 3). W przeciwieństwie do tego, ekspozycja na światło ultrafioletowe (UV) niezbędna do obrazowania komórek barwionych DAPI jest fototoksyczna (Rysunek 3), a zatem barwienie DAPI najlepiej nadaje się do barwienia żywych komórek w celu natychmiastowego obrazowania lub barwienia utrwalonych komórek.
    1. Barwienie komórek DAPI
      1. Osad 1 ml kultury wykładniczej (OD600 = ~ 0,4-0,6) przez wirowanie przy 7,000 x g przez 5 minut w wirówce stacjonarnej.
      2. Opcjonalnie, aby utrwalić komórki przed barwieniem, ponownie zawieś osad komórek w 1 ml 70% lodowatego etanolu. Inkubować na lodzie przez 10-15 minut. Zebrać komórki przez odwirowanie, jak opisano w ppkt 2.2.1.1.
      3. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS zawierającym 1 μl roztworu podstawowego DAPI (1 mg/ml; patrz tabela materiałów). Delikatnie wymieszać pipetując i inkubować przez 5 minut w ciemności.
      4. Komórki osadu należy odwirować przy 7 000 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w 1 ml PBS w celu usunięcia nadmiaru DAPI. Umyj komórki jeszcze dwa razy i ponownie zawieś osad w 50 μl PBS lub pożywce.
      5. Nałożyć 0,8-1 μl komórek na podkładkę agarozową i natychmiast zobrazować za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Patrz sekcje 3.1 i 3.2.
        UWAGA: Ten protokół nie jest optymalny dla mikroskopii poklatkowej do obserwacji dynamiki chromosomów (Rysunek 3). Rozważ użycie barwienia pomarańczowego jako alternatywy (patrz sekcja 2.2.2).
    2. Pomarańczowe barwienie żywych komórek
    3. Osad 1 ml kultury wykładniczej (OD600 = ~ 0,4-0,6) przez wirowanie przy 7,000 x g przez 5 minut w wirówce stacjonarnej. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS zawierającym 1 μl roztworu podstawowego pomarańczy (patrz lista materiałów). Delikatnie wymieszać pipetując i inkubować przez 5 minut w ciemności.
    4. Komórki osadu przez odwirowanie i ponowne zawieś w 1 ml PBS w celu usunięcia nadmiaru pomarańczy. Umyj komórki jeszcze dwa razy i ponownie zawieś granulat w 50 μl PBS.
    5. Nałożyć 0,8-1 μl komórek na podkładkę agarozową i natychmiast zobrazować za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Patrz sekcje 3.1 i 3.2.
      UWAGA: Ten protokół działa dobrze z żywymi komórkami i nadaje się do mikroskopii poklatkowej w celu obserwacji dynamiki chromosomów (Rysunek 3). Jeśli natychmiastowe obrazowanie nie jest wygodne, komórki można utrwalić w lodowatym 70% etanolu (patrz sekcja 2.2.1.2).
  3. Etykietowanie membran<br /> UWAGA: Lipofilowy styrylowy barwnik fluorescencyjny 4-64 jest szeroko stosowany do obserwacji błony komórek bakteryjnych. W przeciwieństwie do wielu bakterii, komórki A. tumefaciens znakowane 4-64 nie są jednolicie oznakowane, ale raczej często wykazują wzór "podkowy" 14,15. Co ciekawe, słup wzrostu jest prawie pozbawiony plam, podczas gdy stary słup jest intensywnie oznakowany. Tak więc 4-64 umożliwia wizualizację zarówno wzorców wzrostu komórek, jak i struktury błony u A. tumefaciens.
    1. Dodać FM 4-64 do końcowego stężenia 8 μg/ml w 1 ml hodowli komórkowej w fazie wykładniczej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut w ciemności.
    2. Komórki oznakowane osadkami przez odwirowanie przy 7,000 x g przez 5 minut w wirówce stacjonarnej i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS. Umyj komórki w sumie trzy razy, aby usunąć nadmiar barwnika.
    3. Ponownie zawiesić komórki w małej objętości PBS i umieścić na podkładce agarozowej, aby natychmiast zobrazować. (Patrz punkty 3.1 i 3.2)
      UWAGA: Komórki muszą być natychmiast zobrazowane, aby zaobserwować charakterystyczne wzorce etykietowania.

3. Obrazowanie komórek A. tumefaciens

  1. Preparat z podkładki agarozowej
    UWAGA: Rysunek 1 zawiera sekwencję obrazów (panel A) i schemat (panel B) typowej podkładki agarozowej przygotowanej do mikroskopii poklatkowej. Płatki agarozowe są zazwyczaj przygotowywane w razie potrzeby.
    1. 3.1.1. Użyć szkiełka nakrywkowego jako prowadnicy i wyciąć kwadrat folii laboratoryjnej o wymiarach 22 mm x 22 mm (patrz wykaz materiałów), przesuwając skalpel wokół krawędzi.
    2. Wytnij kwadrat ze środka folii laboratoryjnej, pozostawiając obramowanie ~ 2-5 mm, które posłuży jako uszczelka do podkładki agarozowej. Wyrzuć środkowe wycięcie.
    3. Umieść uszczelkę folii na szkiełku podstawowym (75 mm x 25 mm) oczyszczonym środkiem czyszczącym bez amoniaku i alkoholu (patrz lista materiałów) i podgrzewaj, aż folia lekko stopi się na szkle (górny obraz w Rysunek 1A). Aby stopić folię laboratoryjną, użyj krawędzi bloku grzewczego ustawionego na 70 °C lub lekko rozpuść nad płomieniem.
    4. Przygotować roztwór agarozy, mieszając ~0,075 g agarozy (patrz lista materiałów) w 5 ml pożywki w małej kolbie. Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej z okresowym wirowaniem, aby mieszać, aż agaroza się rozpuści, a roztwór będzie klarowny. Roztwór agarozy należy przechowywać w temperaturze 55-70 °C i użyć do budowy wielu płatków agarozowych w ciągu 48 godzin.
    5. Pipeta zawierająca 1,2-1,5% agarozy do środka uszczelki.
      UWAGA: Objętość nośnika wynosi zwykle 50 - 60 μl, ale będzie się różnić w zależności od rozmiaru uszczelki. Dodanie podłoża do zimnego szkiełka może spowodować zbyt szybkie zestalenie się agarozy, dlatego szkiełko powinno być trzymane na ciepłej powierzchni. Krawędź bloku grzewczego ustawionego na 70 °C działa dobrze. Agaroza wodna lub buforowane roztwory agarozy, takie jak sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), mogą być używane zamiast pożywek zawierających agarozę do zastosowań, w których nie jest wymagany ciągły wzrost komórek. W przypadku obrazowania szczepów zubożających induktor może być obecny lub nieobecny w pożywce. Obecność induktora może być wykorzystana jako kontrola, podczas gdy brak induktora ujawni fenotyp zubożenia.
    6. Umieść szkiełko nakrywkowe na uszczelce, aby równomiernie rozprowadzić agarozę.
    7. Umieść szkiełko na chłodnej, równej powierzchni do zestalenia się przez ~2 min. Unikaj przesuszenia podkładki agarozowej, ponieważ spowoduje to pomarszczenie powierzchni na podkładce agarozowej i gromadzenie się zawiesiny komórek po nałożeniu na powierzchnię.
    8. Ostrożnie zsunąć szkiełko nakrywkowe z wacika agarozowego.
      Uwaga: Nie spiesz się z tym krokiem. Podkładka agarozowa może się łatwo rozerwać, a nierówna podkładka agarozowa może utrudnić obrazowanie.
    9. Pozostaw podkładkę agarozową do wyschnięcia na powietrzu przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej, aż powierzchnia podkładki będzie wyglądać na suchą. Za pomocą skalpela usuń mały pasek agarozy, aby utworzyć kieszeń powietrzną (środkowy obraz, Rysunek 1A); kieszeń powietrzna ma zwykle wymiary ~2 mm x 7-10 mm, a komórki A. tumefaciens mają tendencję do wzrostu najlepiej w pobliżu kieszeni powietrznej (Rysunek 1C).
      UWAGA: Do obrazowania nieruchomych komórek lub w warunkach, w których wzrost nie jest monitorowany, kieszeń powietrzna nie jest konieczna.
    10. Umieść 0,8-1 μl komórek na podkładce agarozowej i przykryj nowym szkiełkiem nakrywkowym. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu wacika agarozowego, aby rozprowadzić komórki na powierzchni wacika agarozowego.
    11. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego za pomocą stopionego VALAP (przepis znajduje się w tabeli materiałów; Rysunek 1A, dolny obrazek). Brak uszczelnienia wzdłuż wszystkich krawędzi i rogów szkiełka nakrywkowego może spowodować wysuszenie podkładki agarozowej, co doprowadzi do dryfowania komórek podczas obrazowania. UWAGA: Uszczelnienie szkiełka nakrywkowego jest potrzebne tylko w przypadku długotrwałego obrazowania poklatkowego.

figure-protocol-1
Rycina 1: Przygotowanie padu agarozowego. (A) Sekwencja obrazu protokołu przygotowania padu agarozowego. Zdjęcie 1 to szkiełko z uszczelką z folii laboratoryjnej. Na rysunku 2 pokazano poduszkę agarozową i kieszeń powietrzną. Wreszcie, zdjęcie 3 pokazuje kompletną podkładkę agarozową z komórkami pod szkłem nakrywkowym i uszczelnioną VALAP. (B) Przedstawiono schemat podkładki agarozowej do mikroskopii poklatkowej. Kluczowe cechy podkładki agarozowej są oznaczone na schemacie. (C) Kieszeń powietrzna sprzyjała wzrostowi A. tumefaciens na poduszkach agarozowych. Pokazano obrazy komórek A. tumefaciens typu dzikiego hodowanych na podkładce agarozowej przez 20 godzin. Zdjęcia wykonywano w miejscach coraz bardziej oddalonych od kieszeni powietrznej. Odległość od najbliższej krawędzi obrazu do kieszeni powietrznej jest pokazana nad każdym obrazem. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Obrazowanie
    UWAGA: Różnicowe obrazowanie kontrastu interferencyjnego, kontrastu fazowego i epifluorescencji odbywa się za pomocą mikroskopu odwróconego wyposażonego w sprzętowy autofokus, zautomatyzowanego stolika, standardowych filtrów, źródła światła LED, obiektywów 60X z olejkiem immersyjnym (1,4 NA) dla kontrastu fazowego lub różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) oraz kamery 1K z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem zwielokrotnionym elektronami (EMCCD). Mikroskop należy umieścić w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze. Alternatywnie można użyć podgrzewacza lub komory scenicznej, aby utrzymać stałą temperaturę podczas obrazowania.
    1. Mikroskopia epifluorescencyjna
      UWAGA: W przypadku obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek konieczne jest ograniczenie liczby akwizycji obrazu i optymalizacja czasu naświetlania w celu zminimalizowania fotowybielania i fototoksyczności. Do obrazowania każdego barwnika zaleca się znalezienie optymalnego czasu ekspozycji, który zapewnia wystarczającą detekcję fluorescencji, ale nie prowadzi do fotowybielania lub fototoksyczności. Na rysunkach 2-4 dla wszystkich obrazów fluorescencyjnych zastosowano czasy naświetlania wynoszące 200 ms. W przypadku sekwencji poklatkowych pokazanych w Rysunek 3, obrazy były rejestrowane co 10 minut przez 3 godziny.
      1. Umieść olejek immersyjny na żądanym celu i umieść odwróconą prowadnicę w uchwycie szkiełka na scenie. Użyj pokręteł ostrości, aby ustawić ostrość komórek.
      2. Uzyskuj obrazy w fazie (lub DIC) i żądanym filtrze fluorescencyjnym.
        UWAGA: Maksymalne długości fal wzbudzenia i emisji dla barwników używanych w Rysunek 2, Rysunek 3 i Rysunek 4 są następujące: HADA (405/460), NADA (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), Orange (547/570).
    2. Mikroskopia poklatkowa
      UWAGA: Podczas mikroskopii poklatkowej następujące funkcje są sterowane komputerowo: pozycja x, y i z, przesłony i filtry fluorescencyjne. Sprzętowy system automatycznego ustawiania ostrości jest optymalny do utrzymania ostrości podczas obrazowania poklatkowego. Alternatywnie można użyć pętli automatycznego ustawiania ostrości opartej na oprogramowaniu.
      1. Umieść olejek immersyjny na żądanym celu i umieść odwróconą prowadnicę w uchwycie szkiełka na scenie. Użyj pokręteł ostrości, aby ustawić ostrość komórek.
      2. Opcjonalnie: Zajmij wiele pozycji (x,y). Losowo wybierz 10 pól komórek w bliskiej odległości od kieszeni powietrznej poduszek agarozowych.
      3. Ustaw akwizycję sekwencji czasowej do obrazowania w fazie lub DIC w żądanym przedziale czasu.
        UWAGA: W przypadku sekwencji poklatkowej pokazanej na Rysunek 4, obrazy DIC były rejestrowane z ekspozycją 30 ms co 10 minut przez 14 godzin. W przypadku korzystania z obrazowania fluorescencyjnego podczas mikroskopii poklatkowej należy dostosować interwał akwizycji i czas ekspozycji, aby zminimalizować fotowybielanie i fototoksyczność.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Specyficzne dla celu oznaczanie komórek A. tumefaciens typu dzikiego
W celu zilustrowania, że na morfologię komórek nie mają wpływu etapy płukania lub traktowania 1% DMSO (który jest używany do rozcieńczania barwników fluorescencyjnych), komórki zobrazowano bezpośrednio z hodowli (Rysunek 2A, skrajny lewy panel), po umyciu komórek przez odwirowanie, jak opisano w 1.2 (Rysunek 2A, lewy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten zawiera szereg procedur do badania szczepów A. tumefaciens typu dzikiego, zmutowanego i zubożonego. Warto zauważyć, że wszystkie procedury wymienione w sekcji protokołu można łatwo dostosować do innych szczepów bakterii z dodatkowymi modyfikacjami w celu uwzględnienia pożywki wzrostowej, temperatur i tempa wzrostu.

Zastosowanie barwników specyficznych dla celu jest cennym narzędziem do szczegółowej charakterystyki zdarzeń cyklu komórkowego w komórkach bakteryjnych. Tutaj ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Michaelowi VanNieuwenhze (Indiana University) za dar FDAA użytych w Rysunek 2 i Rysunek 4. Dziękujemy członkom laboratorium Browna za informacje zwrotne podczas przygotowywania tego manuskryptu. Badania w laboratorium Browna nad wzrostem i podziałem komórek A. tumefaciens są wspierane przez National Science Foundation (IOS1557806).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szczepy bakteryjne
Agrobacterium tumefaciens C58ATCC33970Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plazmid niezbędny do zjadliwości Agrobacterium tumefaciens. J Bakteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58Δ tetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA Δ ctrAFigueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Wprowadzenie Mini-Tn7 do sztucznego miejsca attTn7 umożliwia usunięcie głównego regulatora essentail CtrA w fitopatogenie Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Media Components
ATGN Minimalny średniDo 1 l wysterylizowanej wody dodać 50 ml 20X Bulek, 50 ml 20X Soli, 12,5 ml 40% glukozy. W przypadku talerzy dodaj 15 g agaru Bacto do 1 l wody i autoklawu. Schłodzić do 55 stopni C i dodać 50 ml 20X Bulek, 50 ml 20X Sole, 12,5 ml 40% glukozy.
20X AT BufferDodaj 214 g / L KH2PO4 do wody i dostosuj pH do 7,0 za pomocą wodorotlenku sodu. Autoklaw.
NaOHFisher BioReagentsBP359
KH2PO4Fisher ChemicalP288
20X AT SoleDodaj 40 g/L (NH4)2SO4, 3,2 g/L MgSO4• 7H2O, 0,2 g/L CaCl2• 2H2O oraz 0,024 g/L MnSO4• H2O do wody. Autoklaw.
(NH4)2SO4Fisher ChemicalA701
MgSO4• 7H2OFisher BioReagentsBP213
CaCl2• 2H2OFisher BioReagentsBP510
MnSO4• H2OFisher ChemicalM114
GlukozaFisher ChemicalD16Przygotuj 40% bulionu w wodzie. Filtruj sterylizację.
Bacto AgarFisher BioReagentsBP1423Podczas przygotowywania talerzy dodaj 15 g do 1 l wody.
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Opcjonalnie Dodatki do mediów
KanamycinGoldBioK-120Przygotować jako roztwór podstawowy 100 mg/ml w wodzie i przefiltrować sterylizować. Stosować przy końcowym stężeniu 200 &mikro; g/ml.
IPTGGoldBioI2481C5Przygotować jako 1 M roztwór podstawowy w wodzie i przefiltrować sterylizować. Stosować w końcowym stężeniu 1 mM, zgodnie z potrzebami do indukcji.
NazwaFirma>Numer katalogowy>Komentarze
Materiały mikroskopowe
Szkiełka mikroskopoweFisherbrand12-550D25 X 75 X 1,0 mm. Wyczyść środkiem do czyszczenia szkła Sparkle.
Szklana osłona mikroskopuFisherbrand12-541-B22 X 22 mm. Nr 1.5. Wyczyść za pomocą środka do czyszczenia szkła Sparkle.
Sparkle Glass CleanerHome Depot203261385Nie zawiera amoniaku i alkoholu.
Ultra Pure AgarozaInvitrogen16500-100Dodać do wody, PBS lub pożywki do końcowego stężenia 1 - 1,5%. Rozpuść w kuchence mikrofalowej i umieść na 70 C
PBSFisher BioReagentsBP399500roztworze 10X, który należy rozcieńczyć do 1X sterylną wodą.
ParafilmBemisPM-999Folia laboratoryjna stosowana jako uszczelka w preparacie wacików agarozowych.
VALAPDodaj równe masy lanoliny, wosku parafinowego i wazeliny do stożkowej probówki. Rura grzewcza w zakresie 70 stopni; C wysuszyć, perełkować lub kąpiel wodną do stopienia i wymieszać. Zastosuj VALAP, gdy jest jeszcze stopiony.
Masło lanolinoweSAAQINSQ-LAB-R1
Petroleum JellyTarget Corp.06-17644
Wosk parafinowyCrafty Candles263012
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
>Barwniki specyficzne dla celu
DMSOFisher BioReagentsBP231-1Stosować do rozcieńczania roztworów podstawowych barwników w razie potrzeby.
FDAA (NADA, HADA, TADA)FDAAmogą być syntetyzowane lub nabywane po uzgodnieniu z Mike'em VanNieuwenhze (Indiana University). Przygotować 100 mM roztwór podstawowy w DMSO. Stosować w końcowym stężeniu 5 mM.
DAPIThermoFisher Scientific62247Przygotować 1 mg/ml roztworu podstawowego w DMSO. Stosować przy końcowym stężeniu 1 &mikro; g/ml.
SYTOX Pomarańczowy barwnik kwasu nukleinowegoInvitrogenS11368Stężenie zapasów wynosi 5 mM w DMSO. Stosować w końcowym stężeniu 5 &mikro;M.
FM4-64InvitrogenT3166Przygotować roztwór podstawowy 8 mg/ml w DMSO. Stosować przy końcowym stężeniu 8 &mikro; g/ml.
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
Dry bathSheldon Manufacturing, Inc.52120-200
Metaliczne kulki termiczneLab Armor42370-002
mikroskop epifluorescencyjny wyposażony w kameręNikon Eclipse TiE wyposażony w kamerę QImaging Rolera em-c2 1K z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem zwielokrotnionym elektronami (EMCCD).
W tej pracy używany jest EMCDD

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Daniel, R. A., Errington, J. Control of cell morphogenesis in bacteria: two distinct ways to make a rod-shaped cell. Cell. 113 (6), 767-776 (2003).
  2. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  3. Turner, R. D., et al. Peptidoglycan architecture can specify division planes in Staphylococcus aureus. Nat Commun. 1, 26(2010).
  4. Wheeler, R., Mesnage, S., Boneca, I. G., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Super-resolution microscopy reveals cell wall dynamics and peptidoglycan architecture in ovococcal bacteria. Mol Microbiol. 82 (5), 1096-1109 (2011).
  5. Turner, R. D., Hurd, A. F., Cadby, A., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall elongation mode in Gram-negative bacteria is determined by peptidoglycan architecture. Nat Commun. 4, 1496(2013).
  6. Kuru, E., et al. In Situ probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  7. Siegrist, M. S., et al. (D)-Amino acid chemical reporters reveal peptidoglycan dynamics of an intracellular pathogen. ACS Chem Biol. 8 (3), 500-505 (2013).
  8. Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples: past and present. Microbiol Rev. 58 (4), 603-615 (1994).
  9. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. J Vis Exp. (79), (2013).
  10. Bakshi, S., et al. Nonperturbative imaging of nucleoid morphology in live bacterial cells during an antimicrobial peptide attack. Appl Environ Microbiol. 80 (16), 4977-4986 (2014).
  11. Barak, I., Muchova, K. The role of lipid domains in bacterial cell processes. Int J Mol Sci. 14 (2), 4050-4065 (2013).
  12. Fishov, I., Woldringh, C. L. Visualization of membrane domains in Escherichia coli. Mol Microbiol. 32 (6), 1166-1172 (1999).
  13. Barak, I., Muchova, K., Wilkinson, A. J., O'Toole, P. J., Pavlendova, N. Lipid spirals in Bacillus subtilis and their role in cell division. Mol Microbiol. 68 (5), 1315-1327 (2008).
  14. Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. MBio. 5 (3), e01219(2014).
  15. Zupan, J. R., Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zambryski, P. C. Dynamic FtsA and FtsZ localization and outer membrane alterations during polar growth and cell division in Agrobacterium tumefaciens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 9060-9065 (2013).
  16. Eberhardt, A., Wu, L. J., Errington, J., Vollmer, W., Veening, J. W. Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems. Mol Microbiol. 74 (2), 395-408 (2009).
  17. Iniesta, A. A., Garcia-Heras, F., Abellon-Ruiz, J., Gallego-Garcia, A., Elias-Arnanz, M. Two systems for conditional gene expression in Myxococcus xanthus inducible by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside or vanillate. J Bacteriol. 194 (21), 5875-5885 (2012).
  18. Figueroa-Cuilan, W., Daniel, J. J., Howell, M., Sulaiman, A., Brown, P. J. Mini-Tn7 Insertion in an Artificial attTn7 Site Enables Depletion of the Essential Master Regulator CtrA in the Phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82 (16), 5015-5025 (2016).
  19. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  20. Khan, S. R., Gaines, J., Roop, R. M. 2nd, Farrand, S. K. Broad-host-range expression vectors with tightly regulated promoters and their use to examine the influence of TraR and TraM expression on Ti plasmid quorum sensing. Appl Environ Microbiol. 74 (16), 5053-5062 (2008).
  21. Yansura, D. G., Henner, D. J. Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (2), 439-443 (1984).
  22. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  23. Thanbichler, M., Iniesta, A. A., Shapiro, L. A comprehensive set of plasmids for vanillate- and xylose-inducible gene expression in Caulobacter crescentus. Nucleic Acids Res. 35 (20), e137(2007).
  24. Topp, S., et al. Synthetic riboswitches that induce gene expression in diverse bacterial species. Appl Environ Microbiol. 76 (23), 7881-7884 (2010).
  25. Peters, J. M., et al. A Comprehensive, CRISPR-based Functional Analysis of Essential Genes in Bacteria. Cell. 165 (6), 1493-1506 (2016).
  26. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  27. Griffith, K. L., Grossman, A. D. Inducible protein degradation in Bacillus subtilis using heterologous peptide tags and adaptor proteins to target substrates to the protease ClpXP. Mol Microbiol. 70 (4), 1012-1025 (2008).
  28. McGinness, K. E., Baker, T. A., Sauer, R. T. Engineering controllable protein degradation. Mol Cell. 22 (5), 701-707 (2006).
  29. Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1707), (2016).
  30. Escobar, M. A., Dandekar, A. M. Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Trends Plant Sci. 8 (8), 380-386 (2003).
  31. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol Mol Biol Rev. 67 (1), table of contents 16-37 (2003).
  32. Nester, E. W. Agrobacterium: nature's genetic engineer. Front Plant Sci. 5, 730(2014).
  33. Imam, J., Singh, P. K., Shukla, P. Plant Microbe Interactions in Post Genomic Era: Perspectives and Applications. Front Microbiol. 7, 1488(2016).
  34. Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front Plant Sci. 5, 322(2014).
  35. Yuan, Z. C., Williams, M. A really useful pathogen, Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell. 24 (10), (2012).
  36. Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
  37. Pitzschke, A. Agrobacterium infection and plant defense-transformation success hangs by a thread. Front Plant Sci. 4, 519(2013).
  38. Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ. Nat Protoc. 10 (1), 33-52 (2015).
  39. Curtis, P. D., Brun, Y. V. Identification of essential alphaproteobacterial genes reveals operational variability in conserved developmental and cell cycle systems. Mol Microbiol. 93 (4), 713-735 (2014).
  40. Kim, J., Heindl, J. E., Fuqua, C. Coordination of division and development influences complex multicellular behavior in Agrobacterium tumefaciens. PLoS One. 8 (2), e56682(2013).
  41. Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), (2011).
  42. Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469(2014).
  43. Zeng, L., Golding, I. Following cell-fate in E. coli after infection by phage lambda. J Vis Exp. (56), e3363(2011).
  44. Brown, P. J., et al. Polar growth in the Alphaproteobacterial order Rhizobiales. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (5), 1697-1701 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Time lapse MicroscopyBacterial Cell GrowthDNA ReplicationProtein SynthesisCell Wall BiosynthesisCell DivisionFluorescent DyesNucleic Acid StainsAgrobacterium Tumefaciens

Powiązane artykuły