Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu obserwacji podstawowych procesów podczas wzrostu komórek drobnoustrojów

15.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56497

⸱

24 listopada 2017

 ,  , 
1Division of Biological Sciences, University of Missouri

W tym artykule

Podsumowanie

Zrozumienie funkcji podstawowych procesów zachodzących w bakteriach jest wyzwaniem. Mikroskopia fluorescencyjna z barwnikami specyficznymi dla celu może dostarczyć kluczowych informacji na temat wzrostu komórek drobnoustrojów i progresji cyklu komórkowego. W tym przypadku Agrobacterium tumefaciens jest używany jako bakteria modelowa w celu podkreślenia metod obrazowania żywych komórek w celu scharakteryzowania podstawowych procesów.

Streszczenie

Podstawowe procesy komórkowe, takie jak replikacja i segregacja DNA, synteza białek, biosynteza ściany komórkowej i podział komórek, opierają się na funkcji białek, które są niezbędne do przetrwania bakterii. Seria barwników specyficznych dla celu może być wykorzystana jako sondy, aby lepiej zrozumieć te procesy. Barwienie barwnikami lipofilowymi umożliwia obserwację struktury błony, wizualizację mikrodomen lipidowych oraz detekcję pęcherzyków błonowych. Zastosowanie fluorescencyjnych aminokwasów d (FDAA) do badania miejsc biosyntezy peptydoglikanu może wskazywać na potencjalne defekty w biogenezie ściany komórkowej lub wzorcu wzrostu komórek. Wreszcie, barwienie kwasami nukleinowymi może wskazywać na możliwe defekty w replikacji DNA lub segregacji chromosomów. Barwienie cyjaninowym DNA oznacza żywe komórki i nadaje się do mikroskopii poklatkowej, umożliwiając obserwację morfologii nukleoidów w czasie rzeczywistym podczas wzrostu komórek. Protokoły znakowania komórek można zastosować do mutantów zubożonych w białka w celu identyfikacji defektów w strukturze błony, biogenezie ściany komórkowej lub segregacji chromosomów. Co więcej, mikroskopia poklatkowa może być wykorzystywana do monitorowania zmian morfologicznych po usunięciu niezbędnego białka i może dostarczyć dodatkowych informacji na temat funkcji białka. Na przykład wyczerpanie podstawowych białek podziału komórkowego powoduje filamentację lub rozgałęzienie, podczas gdy wyczerpanie białek wzrostu komórek może spowodować, że komórki staną się krótsze lub bardziej okrągłe. W tym miejscu przedstawiono protokoły wzrostu komórek, znakowania specyficznego dla celu i mikroskopii poklatkowej dla bakteryjnego patogenu roślin Agrobacterium tumefaciens. Razem, barwniki specyficzne dla celu i mikroskopia poklatkowa umożliwiają scharakteryzowanie podstawowych procesów zachodzących u A. tumefaciens. Wreszcie, dostarczone protokoły można łatwo modyfikować w celu zbadania podstawowych procesów zachodzących u innych bakterii.

Wprowadzenie

Postęp w cyklu komórkowym bakterii wymaga koordynacji wielu procesów, w tym biosyntezy błony i ściany komórkowej, replikacji i segregacji DNA oraz podziału komórek. Aby w pełni zrozumieć złożoność biologii komórek bakteryjnych, konieczne jest zbadanie tych podstawowych zdarzeń; Jest to jednak nietrywialne zadanie, ponieważ żywotność komórek jest zagrożona, gdy kluczowe składniki tych szlaków są mutagenne. Mikroskopia epifluorescencyjna w połączeniu z barwnikami specyficznymi dla celu jest skutecznym podejściem do badania tych podstawowych procesów w dzikich i zmutowanych szczepach bakterii.

Barwniki specyficzne dla peptydoglikanu obejmują antybiotyki fluorescencyjne (wankomycyna-FL, bocylina-FL) i fluorescencyjne d-aminokwasy (na przykład kwas 7-hydroksykumaryno-3-karboksylowy-3-amino-d-alanina, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanina, NADA; tetrametylorodamino-3-amino-d-alanina; TADA). W przypadku bakterii Gram-dodatnich zastosowanie subletalnych stężeń fluorescencyjnych analogów antybiotyków do badania miejsc biosyntezy peptydoglikanu było skuteczną strategią ujawniania wzorców insercji peptydoglikanu1,2,3,4. Podczas gdy fluorescencyjne znakowanie wankomycyną zostało wykorzystane do uzyskania wglądu w wzorce wstawiania peptydoglikanu w utrwalonych bakteriach Gram-ujemnych5, błona zewnętrzna na ogół zapewnia barierę przepuszczalności, która uniemożliwia stosowanie antybiotyków fluorescencyjnych jako sondy do biosyntezy peptydoglikanu w żywych komórkach. W przeciwieństwie do tego, krótkie impulsy fluorescencyjnych d-aminokwasów lub d-aminokwasów z biortogalnymi grupami funkcyjnymi kowalencyjnie oznaczają regiony niedawnej insercji peptydoglikanu w szerokim zakresie żywych komórek bakteryjnych6,7. Wzorce insercji peptydoglikanu, które zaobserwowano w przypadku syntetycznych d-aminokwasów, obejmują punktowy i przegrodowy (Escherichia coli i Bacillus subtilis), polarny i przegrodowy (Agrobacterium tumefaciens i Listeria monocytogenes), samą przegrodę (Staphylococcus aureus) i wierzchołkową (Streptomyces venezuelae)6,7. Obserwacje te wskazują, że bakterie wykazują różne wzorce biogenezy ściany komórkowej i że stosowanie syntetycznych d-aminokwasów jako sond do badania wzorców wzrostu jest cenną strategią u wielu bakterii.

Barwniki oznaczające chromosomy bakteryjne zawierają specyficzny dla kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) spoiwo drobnego rowka (4,6-diamidyn-2-fenyloindol; DAPI) i barwniki cyjaninowe o wysokim powinowactwie (zielony i pomarańczowy; patrz lista materiałów). Barwienie DAPI komórek stałych pomaga w wyliczaniu bakterii z próbek środowiskowych8, podczas gdy barwienie DAPI żywych komórek służy do wskazania żywotności bakterii9. W przeciwieństwie do tego, barwniki cyjaninowe, takie jak pomarańczowy i zielony, są często opisywane jako nieprzepuszczalne dla błony "martwe" barwniki komórkowe w celu wyliczenia komórek niezdolnych do życia9. Co ciekawe, gdy te odczynniki są używane do badania morfologii bakteryjnego nukleoidu podczas wzrostu komórek, wykazano, że DAPI, pomarańczowy i zielony są przepuszczalne przez błonę i zdolne do znakowania żywych komórek10. W żywych komórkach E. coli barwienie DNA DAPI wydaje się rozproszone z powodu autofluorescencji z cytoplazmy, a powtarzające się ekspozycje komórek barwionych DAPI na światło ultrafioletowe (UV) zaburzają strukturę nukleoidu10. Barwienie E. coli lub B. subtilis pomarańczą ujawnia, że barwnik ten jest przepuszczalny przez błonę i zapewnia długotrwałą fluorescencję po związaniu się z DNA w żywych komórkach bez wpływu na wzrost komórek, replikację DNA lub segregację chromosomów10. Obserwacje te sugerują, że cyjaninowe barwniki DNA mogą być używane do monitorowania morfologii nukleoidów podczas wzrostu komórek u wielu bakterii.

Specyficzne dla fosfolipidów barwniki strylowe, takie jak N-(3-trietyloamoniompropylo)-4-(6-(4-(dietyloamino)fenylo)heksatrienylo)pirydyny dibromek (4-64; zobacz listę materiałów) są związkami kationowymi i kojarzą się preferencyjnie z ujemnie naładowanymi fosfolipidami, takimi jak kardiolipina i fosfatydyloglicerol11. Wyraźne wzorce obserwuje się, gdy 4-64 jest używany do oznaczania błony różnych bakterii. U Escherichia coli 4-64 jest wzbogacony w biegunach, w pasmach wzdłuż ściany bocznej oraz w miejscach podziału późnych komórek przedpodziałowych12. U Bacillus subtilis znakowanie 4-64 umożliwia wizualizację spiral lipidowych13. U Agrobacterium tumefaciens, 4-64 oznacza błonę zewnętrzną i jest obserwowany w charakterystycznym "podkowiastym" wzorze, w którym biegun wzrostu jest pozbawiony etykietowania14,15. Obserwacje te wskazują, że bakterie te wykazują niejednorodne rozmieszczenie lipidów ze względu na obecność domen lipidowych, które przyczyniają się do asymetrii komórkowej. Zmiany we wzorcach znakowania 4-64, takie jak obecność znakowania rozproszonego, pęcherzyków lub pęcherzyków, wgłębień lub skurczu błony, mogą być pouczające w charakterystyce mutantów, które wpływają na dystrybucję lub biosyntezę lipidów.

Poza barwieniem komórek, konieczne jest określenie funkcji białek uczestniczących w podstawowych procesach. Charakterystyka niezbędnych białek jest technicznie trudna, ponieważ nie jest możliwe usunięcie niezbędnych genów i zbadanie konsekwencji fenotypowych. W ten sposób pojawiły się alternatywne podejścia, które zubażają białko. Na przykład, niezbędny gen może być poddany kontroli indukowalnego promotora, a nie jego natywnego promotora. Indukowalne promotory reagują na małe cząsteczki, takie jak; zinc16, izopropyl β-d-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)17,18,19,20,21, arabinose22, vanillate17,23, oraz xylose23, w ten sposób transkrypcja genu docelowego ustaje, a białko będące przedmiotem zainteresowania ulega wyczerpaniu po usunięciu induktora. Alternatywne podejścia do wyczerpywania się podstawowych białek obejmują syntetyczne ryboprzełączniki24, które wykorzystują interakcje małych cząsteczek z RNA, aby utrudnić transkrypcję docelowych genów, interferencja CRISPR25,26 w celu zablokowania transkrypcji docelowych genów oraz indukowalna degradacja białek27,28 który wykorzystuje znaczniki peptydowe do kierowania białek do degradacji przez proteazę ClpXP. Szczepy zubożone zapewniają tylko krótki czas na scharakteryzowanie, zanim komórki stracą żywotność, dlatego obrazowanie mikroskopowe komórek w czasie podczas zubożenia białka jest potężnym podejściem do charakteryzacji. Rzeczywiście, mikroskopia żywych komórek bakteryjnych umożliwiła naukowcom uzyskanie wglądu w podstawowe procesy biologiczne, w tym mechanizmy utrzymywania kształtu komórek, wydzielania i podziału na kompartmenty29.

A. tumefaciens to bakteryjny patogen roślin30 i naturalny inżynier genetyczny31,32. Tak więc mechanizmy związane z chorobotwórczością, w tym interakcje gospodarz-patogen33,34,35, secretion36 i transformacja hosta30,31,37 zostały dokładnie zbadane. Aby opracować strategie, które zapobiegają chorobom, w których pośredniczy A. tumefaciens, lub wspomagają transformację roślin, konieczne jest lepsze zrozumienie procesów niezbędnych do przetrwania A. tumefaciens. Zastosowanie barwników specyficznych dla celu i niedawne opracowanie strategii detruzji białek dla A. tumefaciens18 dostarcza środków do badania podstawowych procesów.

Tutaj znajdują się szczegółowe protokoły do analizy mikroskopowej szczepów A. tumefaciens typu dzikiego, zmutowanego i zubożającego białka. Pierwsze dwa protokoły opisują, w jaki sposób przygotować komórki i oznaczyć je barwnikami specyficznymi dla celu. Trzeci protokół zawiera instrukcje krok po kroku, jak przygotować płatki agarozowe (Rysunek 1) i obrazować komórki bakteryjne (Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4). Protokoły te mogą być również odpowiednie dla innych bakterii z dodatkowymi adaptacjami w celu uwzględnienia różnych warunków pożywki, tempa wzrostu, zapotrzebowania na tlen i struktur komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla szczepów A. tumefaciens

  1. Hodowla szczepów A. tumefaciens
    1. Za pomocą sterylnego drewnianego patyczka lub końcówki pipety zaszczep 1 mL pożywki wzrostowej ATGN (przepis znajduje się w liście materiałów) pojedynczą kolonią pożądanego szczepu.
      UWAGA: W przypadku szczepów deplekcyjnych A. tumefaciens, pożywka ATGN powinna zawierać 1 mM IPTG jako induktor w celu utrzymania biosyntezy niezbędnego białka.
    2. Hoduj szczepy A. tumefaciens przez noc w pożywce ATGN w temperaturze 28 °C przy wytrząsaniu z prędkością 225 rpm.
    3. Zmierz gęstość optyczną komórek przy 600 nm (OD600) za pomocą spektrofotometru. Rozcieńcz hodowlę komórek do OD600 = ~0.2 i kontynuuj wzrost, aż osiągnięta zostanie wartość OD600 = ~0.6. W przypadku szczepów deplekcyjnych kontynuuj hodowlę z induktorem do momentu osiągnięcia OD600 = ~0.6.
    4. Wykorzystaj szczepy typu dzikiego oraz szczepy mutanty A. tumefaciens przy OD600 = ~0.6 do barwienia specyficznego dla celu i/lub mikroskopii poklatkowej (patrz sekcje 2 i 3.1). W przypadku szczepów deplekcyjnych usuń induktor poprzez przemywanie (patrz sekcja 1.2.).
  2. Usuwanie induktora w celu charakterystyki szczepów deplekcyjnych białek A. tumefaciens
    1. Odwiruj 1 mL hodowli w fazie wykładniczej (OD600 = ~0.4-0.6) poprzez wirowanie przy 7,000 x g przez 5 min w wirówce laboratoryjnej w temperaturze pokojowej.
    2. Aby przemyć komórki, usuń nadsącz i resuspenduj osad w świeżej pożywce bez induktora, a następnie ponownie odwiruj komórki zgodnie z opisem powyżej (1.2.1). Przemyj komórki łącznie 3 razy w świeżej pożywce.
    3. Resuspenduj końcowy osad w świeżej pożywce i zagęść komórki do OD600 = ~0.8 do natychmiastowego barwienia barwnikami specyficznymi dla celu (sekcja 2 i Rycina 4B-D) lub mikroskopii poklatkowej (sekcja 3.2 i Rycina 4A). Alternatywnie, przeprowadź wstępną deplekcję komórek przez pożądany czas, hodując je w pożywce bez induktora przed barwieniem i obrazowaniem.

2. Barwienie specyficzne dla celu komórek A. tumefaciens

  1. Fluorescencyjne znakowanie ściany komórkowej d-aminokwasami
    UWAGA: FDAA to nietoksyczne fluorescencyjne d-aminokwasy, które są łatwo wbudowywane w A. tumefaciens peptydoglikan. Ta prosta procedura znakowania pozwala badać wzorce wzrostu w żywych komórkach6Dostępne są protokoły syntezy czterech FDAA.38.
    1. Osad 500 µL hodowli w fazie wzrostu wykładniczego (OD600 = ~0,4-0,6) poprzez wirowanie przy 7 000 x g przez 5 min w wirówce stołowej. Osad komórkowy zawiesić ponownie w 100 µL świeżej pożywki.
    2. Dodaj 5 µL dodać 5 mM FDAA do przemytych i skoncentrowanych komórek i inkubować przez 2 min w ciemności.
      UWAGA: Należy ograniczyć ekspozycję FDAA na światło. Czas inkubacji będzie się różnić w zależności od tempa wzrostu szczepu. Zazwyczaj czas inkubacji powinien wynosić od 5% do 10% czasu podwojenia.6.
    3. Odwirować komórki w celu uzyskania osadu, a następnie trzykrotnie przemyć osady komórkowe solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS).
    4. Resuspendować osad w ~50 µL PBS
      UWAGA: Objętość PBS używanego do resuspensji może się różnić w zależności od wielkości osadu.
    5. Nanieść 0,8-1 µL komórek na podkładkę agarozową i natychmiast przeprowadzić obrazowanie z wykorzystaniem mikroskopii epifluorescencyjnej (patrz sekcje 3.1 i 3.2).
      1. Alternatywnie można zatrzymać dalszą inkorporację znacznika poprzez utrwalenie komórek w lodowatym 70% etanolu. Osad komórkowy należy resuspender w 1 ml lodowatego 70% etanolu i inkubować na lodzie przez 15 minut.
      2. Zebrać komórki poprzez wirowanie i resuspendować w niewielkiej objętości PBS w celu późniejszego obrazowania. Przechowywać zawiesiny komórkowe w 4 °C i obraz w ciągu 48 godzin.
  2. Barwienie DNA za pomocą DAPI lub barwnika pomarańczowego
    UWAGA: W celu obserwacji struktury DNA komórki barwi się barwnikiem DAPI lub Orange (barwnikiem do komórek martwych). Mimo że klasycznie opisuje się go jako „barwnik do komórek martwych”, Orange jest przenikalny, fotostabilny i nie wpływa na wzrost komórek bakteryjnych, co umożliwia obrazowanie DNA w żywych komórkach.10W A. tumefaciensznakowanie na pomarańczowo sprawdza się w żywych komórkach i jest odpowiednie do mikroskopii poklatkowej (Rycina 3). W przeciwieństwie do tego, ekspozycja na światło ultrafioletowe (UV), niezbędna do obrazowania komórek barwionych DAPI, jest fototoksyczna (Rysunek 3) w związku z czym barwienie DAPI najlepiej nadaje się do barwienia żywych komórek w celu natychmiastowego obrazowania lub do barwienia komórek utrwalonych.
    1. Barwienie komórek DAPI
      1. Odwiruj 1 ml kultury w fazie wzrostu wykładniczego (OD600 = ~0,4-0,6) poprzez wirowanie w wirówce laboratoryjnej z prędkością 7 000 x g przez 5 min.
      2. Opcjonalnie, aby utrwalić komórki przed barwieniem, resuspendować osad komórkowy w 1 ml 70% lodowatego etanolu. Inkubować na lodzie przez 10-15 min. Komórki zebrać poprzez wirowanie zgodnie z opisem w punkcie 2.2.1.1.
      3. Resuspender osad komórkowy w 1 ml PBS zawierającego 1 µL roztworu zapasowego DAPI (1 mg/ml; patrz Tabela materiałów). Delikatnie wymieszać poprzez pipetowanie i inkubować przez 5 minut w ciemności.
      4. Odwirować komórki przy 7 000 x g przez 5 min i zawiesić ponownie w 1 ml PBS, aby usunąć nadmiar DAPI. Przemyć komórki jeszcze dwukrotnie, a następnie zawiesić osad w 50 µL PBS lub pożywka.
      5. Nanieść 0,8-1 µL komórek na podkładkę agarozową i niezwłocznie obrazować za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Patrz sekcje 3.1 i 3.2.
        UWAGA: Niniejszy protokół nie jest optymalny do mikroskopii time-lapse w celu obserwacji dynamiki chromosomów (Rysunek 3). Jako alternatywę można rozważyć barwienie pomarańczowe (patrz sekcja 2.2.2).
    2. Pomarańczowe barwienie żywych komórek
    3. Odwiruj 1 ml hodowli w fazie wykładniczej (OD600 = ~0,4-0,6) poprzez wirowanie przy 7 000 x g przez 5 min w wirówce laboratoryjnej. Resuspender osad komórkowy w 1 ml PBS zawierającego 1 µL roztworu zapasowego Orange (patrz lista materiałów). Delikatnie wymieszać poprzez pipetowanie i inkubować przez 5 min w ciemności.
    4. Odwiruj komórki w celu uzyskania osadu, a następnie resuspenduj je w 1 ml PBS, aby usunąć nadmiar barwnika Orange. Przemyj komórki jeszcze dwukrotnie i resuspenduj osad w 50 µL PBS
    5. Nanieść 0,8-1 µL komórek na podkład z agarozy i natychmiast wykonać obrazowanie przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej. Patrz sekcje 3.1 i 3.2.
      UWAGA: Niniejszy protokół sprawdza się w pracy z żywymi komórkami i jest odpowiedni do mikroskopii time-lapse w celu obserwacji dynamiki chromosomów (Rycina 3). Jeśli natychmiastowe obrazowanie nie jest możliwe, komórki można utrwalić w lodowatym 70% etanolu (patrz sekcja 2.2.1.2).
  3. Znakowanie błon
    UWAGA: Lipofilowy styrylowy barwnik fluorescencyjny 4-64 był szeroko stosowany do obserwacji błony komórkowej bakterii. W przeciwieństwie do wielu bakterii, znakowane 4-64 A. tumefaciens komórki nie wykazują jednolitego znakowania, lecz często przyjmują wzór w kształcie „podkowy”14,15Co niezwykłe, biegun wzrostu jest niemal całkowicie pozbawiony barwnika, podczas gdy stary biegun jest intensywnie oznakowany. Zatem 4-64 umożliwia wizualizację zarówno wzorców wzrostu komórek, jak i struktury błony w A. tumefaciens.
    1. Dodać FM 4-64 do stężenia końcowego wynoszącego 8 µg/mL w 1 ml hodowli komórkowej w fazie wykładniczej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut w ciemności.
    2. Wirować oznakowane komórki w wirówce laboratoryjnej przy 7 000 x g przez 5 minut w celu uzyskania osadu, a następnie resuspender osad komórkowy w 1 ml PBS. Przemyć komórki łącznie trzy razy, aby usunąć nadmiar barwnika.
    3. Resuspendować komórki w niewielkiej objętości PBS i nanieść na podkładkę agarozową w celu natychmiastowego obrazowania. (Patrz sekcje 3.1 i 3.2)
      UWAGA: Obrazowanie komórek należy przeprowadzić niezwłocznie, aby zaobserwować charakterystyczne wzory znakowania.

3. Obrazowanie komórek A. tumefaciens

  1. Przygotowanie podkładki agarozowej
    UWAGA: Rysunek 1 zawiera sekwencję obrazów (panel A) oraz schemat (panel B) typowej podkładki agarozowej przygotowanej do mikroskopii time-lapse. Podkładki agarozowe przygotowuje się zazwyczaj na bieżąco, w zależności od potrzeb.
    1. 3.1.1. Używając szkiełka nakrywkowego jako prowadnicy, wyciąć skalpelem kwadrat z folii laboratoryjnej o wymiarach 22 mm x 22 mm (patrz lista materiałów).
    2. Wyciąć kwadrat ze środka folii laboratoryjnej, pozostawiając obramowanie o szerokości ~2-5 mm, które będzie pełnić funkcję uszczelki podkładki agarozowej. Wycięty środek usunąć.
    3. Umieścić uszczelkę z folii na szkiełku przedmiotowym (75 mm x 25 mm) oczyszczonym środkiem bezamoniakalnym i bezalkoholowym (patrz lista materiałów) i podgrzewać, aż folia lekko przytopi się do szkła (górny obraz na Rysunku 1A). Aby stopić folię laboratoryjną, należy użyć krawędzi bloku grzejnego ustawionego na 70 °C lub delikatnie stopić ją nad płomieniem.
    4. Przygotować roztwór agarozy, mieszając ~0,075 g agarozy (patrz lista materiałów) w 5 mL pożywki w małej kolbie. Podgrzewać roztwór w kuchence mikrofalowej, okresowo potrząsając w celu wymieszania, aż agaroza się rozpuści, a roztwór stanie się klarowny. Przechowywać roztwór agarozy w temperaturze 55-70 °C i wykorzystać do przygotowania wielu podkładek agarozowych w ciągu 48 godzin.
    5. Nanieść pipetą pożywkę zawierającą 1,2-1,5% agarozy do wnętrza uszczelki.
      UWAGA: Objętość pożywki wynosi zazwyczaj 50 - 60 µL, ale może się różnić w zależności od rozmiaru uszczelki. Dodanie pożywki na zimne szkiełko może spowodować zbyt szybkie zestalenie się agarozy, dlatego szkiełko należy trzymać na ciepłej powierzchni. Dobrze sprawdza się krawędź bloku grzejnego ustawionego na 70 °C. W zastosowaniach, w których nie jest wymagany dalszy wzrost komórek, zamiast pożywki z agarozą można zastosować roztwory agarozy w wodzie lub roztwory buforowane, takie jak bufor fosforanowy (PBS). W przypadku obrazowania szczepów z ubytkiem (depletion strains), w pożywce może znajdować się induktor lub nie. Obecność induktora może służyć jako kontrola, natomiast jego brak ujawni fenotyp ubytku.
    6. Położyć szkiełko nakrywkowe na uszczelce, aby równomiernie rozprowadzić agarozę.
    7. Położyć szkiełko na chłodnej, płaskiej powierzchni i pozostawić do zestalenia na ~2 min. Należy unikać nadmiernego wysuszenia podkładki agarozowej, ponieważ spowoduje to zmarszczenie jej powierzchni i gromadzenie się zawiesiny komórkowej po naniesieniu na powierzchnię.
    8. Ostrożnie zsunąć szkiełko nakrywkowe z podkładki agarozowej.
      Uwaga: Nie należy spieszyć się na tym etapie. Podkładka agarozowa może łatwo ulec rozerwaniu, a nierówna powierzchnia podkładki może utrudnić obrazowanie.
    9. Pozostawić podkładkę agarozową do wyschnięcia na powietrzu przez 1-2 min w temperaturze pokojowej, aż jej powierzchnia będzie wydawać się sucha. Za pomocą skalpela usunąć niewielki pasek agarozy, aby stworzyć kieszonkę powietrzną (środkowy obraz, Rysunek 1A); kieszonka powietrzna ma zazwyczaj wymiary ~2 mm x 7-10 mm, a komórki A. tumefaciens wykazują tendencję do najlepszego wzrostu w pobliżu tej kieszonki (Rysunek 1C).
      UWAGA: W przypadku obrazowania utrwalonych komórek lub w warunkach, w których wzrost nie jest monitorowany, kieszonka powietrzna nie jest konieczna.
    10. Nanieść 0,8-1 µL komórek na podkładkę agarozową i przykryć nowym szkiełkiem nakrywkowym. Delikatnie położyć szkiełko nakrywkowe na górnej części podkładki agarozowej, aby rozprowadzić komórki po jej powierzchni.
    11. Uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego za pomocą stopionego VALAP (przepis znajduje się w Tabeli Materiałów; Rysunek 1A, dolny obraz). Brak uszczelnienia wszystkich krawędzi i rogów szkiełka nakrywkowego może spowodować wysychanie podkładki agarozowej, co doprowadzi do dryfowania komórek podczas obrazowania. UWAGA: Uszczelnianie szkiełka nakrywkowego jest wymagane wyłącznie przy długoterminowym obrazowaniu time-lapse.

Przygotowanie podkładki agarozowej, schemat, analiza wzrostu A. tumefaciens; mikroskopia, diagram eksperymentalny.
Rycina 1: Przygotowanie podkładki agarozowej. (A) Sekwencja obrazów przedstawiająca protokół przygotowania podkładki agarozowej. Obraz 1 przedstawia szkiełko z laboratoryjną uszczelką foliową. Na obrazie 2 widoczne są podkładka agarozowa i kieszonka powietrzna. Na koniec, obraz 3 pokazuje kompletną podkładkę agarozową z komórkami pod szkiełkiem nakrywką, uszczelnioną za pomocą VALAP. (B) Przedstawiono schemat podkładki agarozowej do mikroskopii time-lapse. Kluczowe elementy podkładki agarozowej zostały oznaczone na schemacie. (C) Kieszonka powietrzna wspomagała wzrost A. tumefaciens na podkładkach agarozowych. Przedstawiono obrazy komórek dzikiego typu A. tumefaciens hodowanych na podkładce agarozowej przez 20 godzin. Obrazy wykonano w pozycjach oddalonych od kieszonki powietrznej. Odległość od najbliższej krawędzi obrazu do kieszonki powietrznej jest podana nad każdym zdjęciem. Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Obrazowanie
    UWAGA: Obrazowanie w kontraście interferencyjnym, kontraście fazowym i epifluorescencyjnym wykonuje się za pomocą mikroskopu odwróconego wyposażonego w sprzętowy autofokus, zautomatyzowany stolik, standardowe filtry, źródło światła LED, obiektywy imersyjne olejowe 60X (1.4 NA) do kontrastu fazowego lub kontrastu interferencyjnego (DIC) oraz kamerę EMCCD (electron-multiplying charge-coupled-device) 1K. Mikroskop powinien znajdować się w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze. Alternatywnie można zastosować podgrzewacz stolika lub komorę w celu utrzymania stałej temperatury podczas obrazowania.
    1. Mikroskopia epifluorescencyjna
      UWAGA: W przypadku obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek konieczne jest ograniczenie liczby akwizycji obrazów i optymalizacja czasu ekspozycji, aby zminimalizować fotowyblakanie i fototoksyczność. Dla każdego barwnika zaleca się znalezienie optymalnego czasu ekspozycji, który zapewnia wystarczającą detekcję fluorescencji, ale nie prowadzi do fotowyblakania ani fototoksyczności. Na rysunkach 2-4 dla wszystkich obrazów fluorescencyjnych zastosowano czas ekspozycji 200 ms. Dla sekwencji time-lapse przedstawionych na rysunku 3 obrazy pozyskiwano co 10 min przez 3 h.
      1. Nanieść olej imersyjny na wybrany obiektyw i umieścić odwrócony preparat w uchwycie na stoliku. Za pomocą pokręteł ostrości ustawić ostrość obrazu komórek.
      2. Pozyskać obrazy w fazie (lub DIC) oraz z wybranym filtrem fluorescencyjnym.
        UWAGA: Maksymalne długości fal wzbudzenia i emisji dla barwników użytych na rysunku 2, rysunku 3 i rysunku 4 są następujące: HADA (405/460), NADA (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), Orange (547/570).
    2. Mikroskopia time-lapse
      UWAGA: Podczas mikroskopii time-lapse następujące funkcje są sterowane komputerowo: pozycja x, y i z, migawki oraz filtry fluorescencyjne. Sprzętowy system autofokusa jest optymalny dla utrzymania ostrości podczas obrazowania time-lapse. Alternatywnie można zastosować programową pętlę autofokusa.
      1. Nanieść olej imersyjny na wybrany obiektyw i umieścić odwrócony preparat w uchwycie na stoliku. Za pomocą pokręteł ostrości ustawić ostrość obrazu komórek.
      2. Opcjonalnie: Pozyskać obrazy z wielu pozycji (x,y). Losowo wybrać 10 pól z komórkami w bliskim sąsiedztwie pęcherzyka powietrznego podkładów agarowych.
      3. Skonfigurować sekwencję akwizycji czasowej w celu obrazowania w fazie lub DIC w wybranym odstępie czasu.
        UWAGA: Dla sekwencji time-lapse przedstawionej na rysunku 4 obrazy DIC pozyskiwano z czasem ekspozycji 30 ms co 10 min przez 14 h. Podczas stosowania obrazowania fluorescencyjnego w mikroskopii time-lapse należy dostosować interwał akwizycji i czas ekspozycji, aby zminimalizować fotowyblakanie i fototoksyczność.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Specyficzne znakowanie celu dla typu dzikiego A. tumefaciens komórki
Aby wykazać, że morfologia komórek nie ulega zmianom pod wpływem etapów płukania ani traktowania 1% DMSO (stosowanego do rozcieńczania barwników fluorescencyjnych), wykonano obrazowanie komórek bezpośrednio z hodowli (Rysunek 2A, panel skrajnie lewy), po wypłukaniu komórek przez wirowanie zgodnie z opisem w punkcie 1.2 (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten zawiera szereg procedur do badania szczepów A. tumefaciens typu dzikiego, zmutowanego i zubożonego. Warto zauważyć, że wszystkie procedury wymienione w sekcji protokołu można łatwo dostosować do innych szczepów bakterii z dodatkowymi modyfikacjami w celu uwzględnienia pożywki wzrostowej, temperatur i tempa wzrostu.

Zastosowanie barwników specyficznych dla celu jest cennym narzędziem do szczegółowej charakterystyki zdarzeń cyklu komórkowego w komórkach bakteryjnych. Tutaj ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Michaelowi VanNieuwenhze (Indiana University) za dar FDAA użytych w Rysunek 2 i Rysunek 4. Dziękujemy członkom laboratorium Browna za informacje zwrotne podczas przygotowywania tego manuskryptu. Badania w laboratorium Browna nad wzrostem i podziałem komórek A. tumefaciens są wspierane przez National Science Foundation (IOS1557806).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szczepy bakteryjne
Agrobacterium tumefaciens C58ATCC33970Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plazmid niezbędny do zjadliwości Agrobacterium tumefaciens. J Bakteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58Δ tetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA Δ ctrAFigueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Wprowadzenie Mini-Tn7 do sztucznego miejsca attTn7 umożliwia usunięcie głównego regulatora essentail CtrA w fitopatogenie Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Media Components
ATGN Minimalny średniDo 1 l wysterylizowanej wody dodać 50 ml 20X Bulek, 50 ml 20X Soli, 12,5 ml 40% glukozy. W przypadku talerzy dodaj 15 g agaru Bacto do 1 l wody i autoklawu. Schłodzić do 55 stopni C i dodać 50 ml 20X Bulek, 50 ml 20X Sole, 12,5 ml 40% glukozy.
20X AT BufferDodaj 214 g / L KH2PO4 do wody i dostosuj pH do 7,0 za pomocą wodorotlenku sodu. Autoklaw.
NaOHFisher BioReagentsBP359
KH2PO4Fisher ChemicalP288
20X AT SoleDodaj 40 g/L (NH4)2SO4, 3,2 g/L MgSO4• 7H2O, 0,2 g/L CaCl2• 2H2O oraz 0,024 g/L MnSO4• H2O do wody. Autoklaw.
(NH4)2SO4Fisher ChemicalA701
MgSO4• 7H2OFisher BioReagentsBP213
CaCl2• 2H2OFisher BioReagentsBP510
MnSO4• H2OFisher ChemicalM114
GlukozaFisher ChemicalD16Przygotuj 40% bulionu w wodzie. Filtruj sterylizację.
Bacto AgarFisher BioReagentsBP1423Podczas przygotowywania talerzy dodaj 15 g do 1 l wody.
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Opcjonalnie Dodatki do mediów
KanamycinGoldBioK-120Przygotować jako roztwór podstawowy 100 mg/ml w wodzie i przefiltrować sterylizować. Stosować przy końcowym stężeniu 200 &mikro; g/ml.
IPTGGoldBioI2481C5Przygotować jako 1 M roztwór podstawowy w wodzie i przefiltrować sterylizować. Stosować w końcowym stężeniu 1 mM, zgodnie z potrzebami do indukcji.
NazwaFirma>Numer katalogowy>Komentarze
Materiały mikroskopowe
Szkiełka mikroskopoweFisherbrand12-550D25 X 75 X 1,0 mm. Wyczyść środkiem do czyszczenia szkła Sparkle.
Szklana osłona mikroskopuFisherbrand12-541-B22 X 22 mm. Nr 1.5. Wyczyść za pomocą środka do czyszczenia szkła Sparkle.
Sparkle Glass CleanerHome Depot203261385Nie zawiera amoniaku i alkoholu.
Ultra Pure AgarozaInvitrogen16500-100Dodać do wody, PBS lub pożywki do końcowego stężenia 1 - 1,5%. Rozpuść w kuchence mikrofalowej i umieść na 70 C
PBSFisher BioReagentsBP399500roztworze 10X, który należy rozcieńczyć do 1X sterylną wodą.
ParafilmBemisPM-999Folia laboratoryjna stosowana jako uszczelka w preparacie wacików agarozowych.
VALAPDodaj równe masy lanoliny, wosku parafinowego i wazeliny do stożkowej probówki. Rura grzewcza w zakresie 70 stopni; C wysuszyć, perełkować lub kąpiel wodną do stopienia i wymieszać. Zastosuj VALAP, gdy jest jeszcze stopiony.
Masło lanolinoweSAAQINSQ-LAB-R1
Petroleum JellyTarget Corp.06-17644
Wosk parafinowyCrafty Candles263012
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
>Barwniki specyficzne dla celu
DMSOFisher BioReagentsBP231-1Stosować do rozcieńczania roztworów podstawowych barwników w razie potrzeby.
FDAA (NADA, HADA, TADA)FDAAmogą być syntetyzowane lub nabywane po uzgodnieniu z Mike'em VanNieuwenhze (Indiana University). Przygotować 100 mM roztwór podstawowy w DMSO. Stosować w końcowym stężeniu 5 mM.
DAPIThermoFisher Scientific62247Przygotować 1 mg/ml roztworu podstawowego w DMSO. Stosować przy końcowym stężeniu 1 &mikro; g/ml.
SYTOX Pomarańczowy barwnik kwasu nukleinowegoInvitrogenS11368Stężenie zapasów wynosi 5 mM w DMSO. Stosować w końcowym stężeniu 5 &mikro;M.
FM4-64InvitrogenT3166Przygotować roztwór podstawowy 8 mg/ml w DMSO. Stosować przy końcowym stężeniu 8 &mikro; g/ml.
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
Dry bathSheldon Manufacturing, Inc.52120-200
Metaliczne kulki termiczneLab Armor42370-002
mikroskop epifluorescencyjny wyposażony w kameręNikon Eclipse TiE wyposażony w kamerę QImaging Rolera em-c2 1K z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem zwielokrotnionym elektronami (EMCCD).
W tej pracy używany jest EMCDD

Bibliografia

  1. Daniel, R. A., Errington, J. Control of cell morphogenesis in bacteria: two distinct ways to make a rod-shaped cell. Cell. 113 (6), 767-776 (2003).
  2. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  3. Turner, R. D., et al. Peptidoglycan architecture can specify division planes in Staphylococcus aureus. Nat Commun. 1, 26(2010).
  4. Wheeler, R., Mesnage, S., Boneca, I. G., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Super-resolution microscopy reveals cell wall dynamics and peptidoglycan architecture in ovococcal bacteria. Mol Microbiol. 82 (5), 1096-1109 (2011).
  5. Turner, R. D., Hurd, A. F., Cadby, A., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall elongation mode in Gram-negative bacteria is determined by peptidoglycan architecture. Nat Commun. 4, 1496(2013).
  6. Kuru, E., et al. In Situ probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  7. Siegrist, M. S., et al. (D)-Amino acid chemical reporters reveal peptidoglycan dynamics of an intracellular pathogen. ACS Chem Biol. 8 (3), 500-505 (2013).
  8. Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples: past and present. Microbiol Rev. 58 (4), 603-615 (1994).
  9. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. J Vis Exp. (79), (2013).
  10. Bakshi, S., et al. Nonperturbative imaging of nucleoid morphology in live bacterial cells during an antimicrobial peptide attack. Appl Environ Microbiol. 80 (16), 4977-4986 (2014).
  11. Barak, I., Muchova, K. The role of lipid domains in bacterial cell processes. Int J Mol Sci. 14 (2), 4050-4065 (2013).
  12. Fishov, I., Woldringh, C. L. Visualization of membrane domains in Escherichia coli. Mol Microbiol. 32 (6), 1166-1172 (1999).
  13. Barak, I., Muchova, K., Wilkinson, A. J., O'Toole, P. J., Pavlendova, N. Lipid spirals in Bacillus subtilis and their role in cell division. Mol Microbiol. 68 (5), 1315-1327 (2008).
  14. Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. MBio. 5 (3), e01219(2014).
  15. Zupan, J. R., Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zambryski, P. C. Dynamic FtsA and FtsZ localization and outer membrane alterations during polar growth and cell division in Agrobacterium tumefaciens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 9060-9065 (2013).
  16. Eberhardt, A., Wu, L. J., Errington, J., Vollmer, W., Veening, J. W. Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems. Mol Microbiol. 74 (2), 395-408 (2009).
  17. Iniesta, A. A., Garcia-Heras, F., Abellon-Ruiz, J., Gallego-Garcia, A., Elias-Arnanz, M. Two systems for conditional gene expression in Myxococcus xanthus inducible by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside or vanillate. J Bacteriol. 194 (21), 5875-5885 (2012).
  18. Figueroa-Cuilan, W., Daniel, J. J., Howell, M., Sulaiman, A., Brown, P. J. Mini-Tn7 Insertion in an Artificial attTn7 Site Enables Depletion of the Essential Master Regulator CtrA in the Phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82 (16), 5015-5025 (2016).
  19. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  20. Khan, S. R., Gaines, J., Roop, R. M. 2nd, Farrand, S. K. Broad-host-range expression vectors with tightly regulated promoters and their use to examine the influence of TraR and TraM expression on Ti plasmid quorum sensing. Appl Environ Microbiol. 74 (16), 5053-5062 (2008).
  21. Yansura, D. G., Henner, D. J. Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (2), 439-443 (1984).
  22. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  23. Thanbichler, M., Iniesta, A. A., Shapiro, L. A comprehensive set of plasmids for vanillate- and xylose-inducible gene expression in Caulobacter crescentus. Nucleic Acids Res. 35 (20), e137(2007).
  24. Topp, S., et al. Synthetic riboswitches that induce gene expression in diverse bacterial species. Appl Environ Microbiol. 76 (23), 7881-7884 (2010).
  25. Peters, J. M., et al. A Comprehensive, CRISPR-based Functional Analysis of Essential Genes in Bacteria. Cell. 165 (6), 1493-1506 (2016).
  26. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  27. Griffith, K. L., Grossman, A. D. Inducible protein degradation in Bacillus subtilis using heterologous peptide tags and adaptor proteins to target substrates to the protease ClpXP. Mol Microbiol. 70 (4), 1012-1025 (2008).
  28. McGinness, K. E., Baker, T. A., Sauer, R. T. Engineering controllable protein degradation. Mol Cell. 22 (5), 701-707 (2006).
  29. Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1707), (2016).
  30. Escobar, M. A., Dandekar, A. M. Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Trends Plant Sci. 8 (8), 380-386 (2003).
  31. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol Mol Biol Rev. 67 (1), table of contents 16-37 (2003).
  32. Nester, E. W. Agrobacterium: nature's genetic engineer. Front Plant Sci. 5, 730(2014).
  33. Imam, J., Singh, P. K., Shukla, P. Plant Microbe Interactions in Post Genomic Era: Perspectives and Applications. Front Microbiol. 7, 1488(2016).
  34. Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front Plant Sci. 5, 322(2014).
  35. Yuan, Z. C., Williams, M. A really useful pathogen, Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell. 24 (10), (2012).
  36. Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
  37. Pitzschke, A. Agrobacterium infection and plant defense-transformation success hangs by a thread. Front Plant Sci. 4, 519(2013).
  38. Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ. Nat Protoc. 10 (1), 33-52 (2015).
  39. Curtis, P. D., Brun, Y. V. Identification of essential alphaproteobacterial genes reveals operational variability in conserved developmental and cell cycle systems. Mol Microbiol. 93 (4), 713-735 (2014).
  40. Kim, J., Heindl, J. E., Fuqua, C. Coordination of division and development influences complex multicellular behavior in Agrobacterium tumefaciens. PLoS One. 8 (2), e56682(2013).
  41. Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), (2011).
  42. Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469(2014).
  43. Zeng, L., Golding, I. Following cell-fate in E. coli after infection by phage lambda. J Vis Exp. (56), e3363(2011).
  44. Brown, P. J., et al. Polar growth in the Alphaproteobacterial order Rhizobiales. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (5), 1697-1701 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia poka lowawzrost kom rek bakteryjnychreplikacja DNAsynteza bia ekbiosynteza ciany kom rkowejpodzia kom rkowybarwniki fluorescencyjnebarwniki do kwas w nukleinowychAgrobacterium tumefaciens
Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu obserwacji podstawowych procesów podczas wzrostu komórek drobnoustrojów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.