Artykuł metodologiczny

Metody analizy wpływu naturalnego uranu na osteoklastogenezę in vitro

DOI:

10.3791/56499

⸱

30 stycznia 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1UMR E-4320 TIRO-MATOs CEA/DRF/BIAM, Université Nice Sophia-Antipolis, 2UMR 7272 Institut de Chimie de Nice CNRS, Université Nice Sophia-Antipolis, 3CEA, Direction de la Recherche Fondamentale (DRF), Biosciences and Biotechnologies Institute (BIAM)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiadomo, że uran wpływa na metabolizm kości. W tym miejscu przedstawiamy protokół mający na celu zbadanie wpływu ekspozycji na naturalny uran na żywotność, różnicowanie i funkcję osteoklastów, komórek odpowiedzialnych za resorpcję kości.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazano, że uran zakłóca fizjologię kości i jest dobrze znane, że metal ten gromadzi się w kościach. Niewiele jednak wiadomo na temat wpływu naturalnego uranu na zachowanie komórek kostnych. W szczególności nie udokumentowano wpływu uranu na osteoklasty, komórki odpowiedzialne za resorpcję macierzy kostnej. Aby zbadać tę kwestię, ustaliliśmy nowy protokół wykorzystujący octan uranylu jako źródło naturalnego uranu i mysią linię komórkową RAW 264.7 jako model prekursorów osteoklastów. W niniejszym artykule szczegółowo opisaliśmy wszystkie testy wymagane do zbadania cytotoksyczności uranu na prekursorach osteoklastów i oceny jej wpływu na osteoklastogenezę i funkcję resorpcji dojrzałych osteoklastów. Wypracowane przez nas warunki, w szczególności do przygotowania pożywek hodowlanych zawierających uran oraz do wysiewu komórek RAW 264.7, pozwalają na uzyskanie wiarygodnych i wysoce reprodukcyjnych wyników. Ponadto zoptymalizowaliśmy wykorzystanie narzędzi programowych, aby ułatwić analizę różnych parametrów, takich jak wielkość osteoklastów czy procent zresorbowanej matrycy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uran jest naturalnie występującym pierwiastkiem radioaktywnym obecnym w glebach, powietrzu i wodzie; jako taki, zwierzęta i ludzie są narażeni na naturalny uran w swojej diecie. Oprócz źródeł naturalnych uran pochodzi z działalności antropogenicznej, co zwiększa jego obfitość w środowisku. Uran stwarza zagrożenia zarówno chemiczne, jak i radiologiczne. Ponieważ jednak uran naturalny (który jest mieszaniną izotopową zawierającą 99,27% 238U, 0,72% 235U i 0,006% 234U) ma niską aktywność właściwą (25,103 Bq.g-1), jego wpływ na zdrowie przypisuje się jego toksyczności chemicznej.

Bez względu na drogę wejścia (wdychanie, spożycie lub narażenie na skórę), większość uranu dostającego się do organizmu jest wydalana z kałem i tylko niewielka część dociera do krążenia ogólnoustrojowego. Około 67% uranu we krwi jest z kolei filtrowane przez nerki i opuszcza organizm wraz z moczem w ciągu 24 h1. Pozostała część jest głównie zdeponowana w nerkach i kościach, dwóch głównych narządach docelowych toksyczności uranu2,3,4. Ponieważ szkielet został zidentyfikowany jako główne miejsce długotrwałego przechowywania uranu2,3,4,5,6, przeprowadzono kilka badań mających na celu zbadanie wpływu uranu na fizjologię kości7.

Kość to zmineralizowana tkanka, która jest stale przebudowywana przez cały okres swojego życia. Przebudowa kości jest złożonym procesem, który zależy od wyspecjalizowanych typów komórek i składa się głównie z dwóch faz: resorpcji istniejącej wcześniej starej macierzy przez osteoklasty, a następnie budowy kości de novo przez osteoblasty. Osteoklasty to duże komórki wielojądrzaste powstałe w wyniku fuzji komórek prekursorowych pochodzenia krwiotwórczego, które migrują do miejsc resorpcji, gdzie przyczepiają się do bone8. Ich przywiązanie następuje równocześnie z rozległą reorganizacją ich cytoszkieletu9. Ta reorganizacja jest wymagana do ustanowienia izolowanego przedziału między komórką a powierzchnią kości, do którego osteoklast wydziela protony, prowadząc do rozpuszczenia hydroksyapatytu i proteaz biorących udział w degradacji macierzy organicznej. Powstałe produkty degradacji są endocytozyzowane, transportowane przez komórkę do obszaru błony przeciwnej do powierzchni kości i wydzielane w procesie zwanym transcytozą10,11.

Wyniki badań in vivo i in vitro wskazują, że uran hamuje tworzenie kości oraz zmienia liczbę i aktywność osteoblastów7,12. Natomiast wpływ uranu na resorpcję kości i osteoklasty został słabo zbadany. Kilka badań in vivo wykazało poprawę resorpcji kości po podaniu azotanu uranylu myszom lub szczurom13,14. Co więcej, dochodzenie epidemiologiczne sugerowało, że wzrost spożycia uranu poprzez wodę pitną był zwykle związany ze wzrostem poziomu markera resorpcji kości w surowicy u mężczyzn15. Podsumowując, odkrycia te doprowadziły do wniosku, że uran, który gromadzi się w kościach, może sprzyjać resorpcji kości. Jednak mechanizmy komórkowe zaangażowane w ten potencjalny efekt uranu pozostają kwestią otwartą. Z tego powodu postanowiliśmy zbadać wpływ uranu na zachowanie resorpcji komórek kostnych.

Tutaj opisujemy protokół, który ustanowiliśmy, aby scharakteryzować i określić ilościowo wpływ naturalnego uranu na żywotność preosteoklastów oraz na różnicowanie i aktywność resorpcyjną osteoklastów. Opisane tutaj eksperymenty zostały przeprowadzone na mysiej transformowanej linii komórkowej makrofagów RAW 264.7, która może łatwo różnicować się w osteoklasty, gdy jest hodowana w obecności cytokiny RANKL przez 4 lub 5 dni, i która jest klasycznie stosowana do badania różnicowania i funkcji osteoklastów16. Opracowane procedury są wiarygodne, dają wysoce powtarzalne wyniki i mają pełne zastosowanie do pierwotnych osteoklastów. Z tych wszystkich powodów uważamy, że ta metodologia jest przydatna do lepszego zrozumienia mechanizmów molekularnych związanych z toksycznością uranu w kościach. Co więcej, uważamy, że podejście to może zostać zaadaptowane jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji nowych czynników chelatujących uran.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworu octanu uranylu

  1. Aby przygotować 2 ml 100 mM roztworu octanu uranylu, dodać 85 mg octanu uranylu (UO2(OCOCH3)2, 2H2O; M = 424 g.mol-1) w stanie stałym do plastikowej probówki o pojemności 5 ml.
  2. Dodaj 2 ml wody destylowanej do plastikowej rurki i załóż do niej plastikowy korek.
  3. Energicznie wstrząsać probówką, aż do całkowitego rozpuszczenia ciała stałego. Wstaw roztwór do lodówki na 24 godziny
    UWAGA: Manipulowanie uranylem [U(VI)] stwarza pewne zagrożenia chemiczne i radiologiczne. Wszystkie próbki powinny być przygotowane i scharakteryzowane za pomocą doraźnego sprzętu w określonych laboratoriach. Wszystkie płyny zawierające U(VI) powinny być zbierane w specjalnie przeznaczonych do tego pojemnikach na odpady i utylizowane jako odpady toksyczne. Suche odpady (pipety, probówki itp.) można umyć 0,1 N roztworem HNO3, który rozpuści i usunie U(VI).
  4. Sprawdzić pH roztworu za pomocą mikroelektrody i pH-metru.
    UWAGA: Mikroelektrodę należy wcześniej skalibrować przy użyciu dostępnych w handlu roztworów buforowych (pH = 4 i pH = 7).

2. RAW 264.7 Hodowla komórkowa

  1. Konserwacja komórek.
    1. Hodować komórki RAW 264,7 (ATCC, TIB-71) w kolbach o długości 75 cm2 w następujących pożywkach wzrostowych: zmodyfikowana pożywka Eagle's Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełniona 5% płodową surowicą bydlęcą i antybiotykami: 100 j.m./ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny. Utrzymywać komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    2. Zmieniaj podłoże co 2 do 3 dni. Gdy komórki są w 85-90% zlewne, należy je mechanicznie usunąć z kolby hodowlanej za pomocą skrobaka do komórek (zgodnie z zaleceniami ATCC) i podzielić je w stosunku 1:6,
      UWAGA: Tylko komórki między przejściami od 3 do 10 są używane do eksperymentów różnicowania.
  2. Przygotowanie komórek do eksperymentów
    1. Usunąć komórki z podłoża kolby, jak opisano powyżej, i przenieść je do sterylnej probówki o pojemności 50 ml. Wymieszaj komórki, pipetując w górę i w dół, aby rozbić grudki. Policz je za pomocą hemocytometru. Spodziewaj się 35-40 milionów komórek na kolbę o długości75 cm2.
    2. Obliczyć objętość zawiesiny komórek niezbędną do każdego eksperymentu w następujący sposób:
      Liczba warunków eksperymentalnych x 3 (trzykrotnie) x 1 ml/studzienkę + 3-4 ml (straty po pipetowaniu).
      UWAGA: Gęstość wysiewu dla wszystkich testów opisanych w tym protokole wynosi 5,000 komórek/cm2. Dlatego dla płytki 24-dołkowej oznacza to 10 000 komórek na studzienkę w 1 ml pożywki, a gęstość zawiesiny komórek wynosi zatem 10 000 komórek/ml.
    3. Przygotuj niezbędną objętość 10 000 komórek/ml zawiesiny komórek i umieść komórki na 24-dołkowych płytkach. Do testów cytotoksyczności należy użyć normalnej pożywki wzrostowej. Do testów różnicowania i resorpcji należy użyć zmodyfikowanego alfa minimalnego niezbędnego podłoża (αMEM) uzupełnionego 2 mM L-glutaminą, 5% FBS i 50 ng/ml GST-RANKL17.
      UWAGA: Białko GST-RANKL produkowane we własnym zakresie można zastąpić dowolną dostępną na rynku cytokiną RANKL. Podczas pracy z nową partią RANKL przydatne może być przetestowanie jej skuteczności w indukowaniu osteoklastogenezy poprzez przeprowadzenie eksperymentu z odpowiedzią na dawkę ze stężeniem RANKL w zakresie od 20 do 150 ng / ml.

3. Rozcieńczenie 100 mM roztworu octanu uranylu w pożywce hodowlanej

UWAGA: Jony uranylowe [U(VI)] w pożywce hodowlanej tworzą wiele kompleksów z innymi składnikami pożywki, które mogą modyfikować jego toksyczność komórkową18,19,20,21. Z tego powodu podłoża zawierające uran powinny być przygotowywane doraźnie, bez pomijania lub skracania etapów równoważenia.

  1. Należy wybrać stężenia ekspozycji na uranyl i obliczyć objętości pożywek hodowlanych wymaganych do przeprowadzenia eksperymentu (biorąc pod uwagę, że każdy warunek przeprowadza się w trzech egzemplarzach).
  2. Zaczynając od badanej sterylnej hodowli komórkowej 7,5% wodnego roztworu wodorowęglanu sodu ([HCO3-] = 893 mM), przygotuj 100 mM roztwór HCO3- w wodzie i ostudź go na lodzie.
  3. Dodaj kropla po kropli 1 objętość octanu uranylu 100 mM roztworu podstawowego do 9 objętości lodowatego roztworu 100 mM HCO3-, delikatnie wstrząsając probówką do mieszania. Ta operacja spowoduje rozcieńczenie roztworu podstawowego octanu uranylu ([UO22+] = 100 mM, pH 4) do 10 mM i doprowadzenie pH do około 7.
  4. Dodać 1 objętość sterylnej wody do 9 objętości lodowatego 100 mM roztworu HCO3 do osiągnięcia 90 mM HCO3 - (równego stężeniu HCO3 w roztworze 10 mM uranylu), który posłuży do przygotowania pożywki kontrolnej.
  5. Pozostawić przygotowane roztwory na 3 godziny w temperaturze pokojowej (RT) w celu zrównoważenia.
  6. W międzyczasie przygotuj podstawowe podłoże ekspozycyjne: αMEM z 2 mM L-Glutaminą i 5% FBS.
    UWAGA: W przypadku testów różnicowania i resorpcji dodać 50 ng/ml GST-RANKL do podstawowego podłoża ekspozycyjnego.
  7. Po 3 godzinach rozcieńczyć odpowiednie ilości 10 mM roztworu uranylu kropla po kropli w podłożu ekspozycyjnym, tak aby osiągnąć pożądane stężenia robocze uranylu. Przygotować jednocześnie pożywkę kontrolną, dodając do pożywki ekspozycyjnej ilość wodorowęglanu użytego w najbardziej skoncentrowanych warunkach poddanych działaniu uranu.
  8. Pozostawić przygotowane podłoża na 3 godziny w temperaturze pokojowej w celu zrównoważenia.
  9. Usunąć pożywkę wzrostową ze studzienek i zastąpić ją pożywką kontrolną i pożywką zawierającą uranyl.

4. Analiza żywotności prekursorów RAW 264.7 w obecności U(VI) (testy cytotoksyczne MTT)

UWAGA: Zarówno MTT, jak i DMSO mogą powodować podrażnienia skóry i oczu. Podczas obchodzenia się z nimi należy nosić rękawice i okulary ochronne. Zbieraj odpady do specjalnie przeznaczonych pojemników na odpady.

  1. Rozpuścić odpowiednią ilość bromku 3-[4,5-dimetylotiazol-2-ylo]-2,5-difenylotetrazolium (MTT) w proszku w PBS, aby otrzymać 10-krotny roztwór podstawowy o stężeniu 5 mg/ml. Wysterylizuj go przez filtrację filtrem 0,22 μm i przechowuj porcje w temperaturze -20 °C.
  2. Komórki płytkowe na płytkach 24-dołkowych (3 dołki na warunek doświadczalny na płytkę). Nie zapomnij zarezerwować 3 pustych dołków na płytkę na ślepe próby spektrofotometru.
  3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 22-24 godziny przed ekspozycją na uran, aby umożliwić komórkom przyłączenie.
  4. Przygotować pożywki zawierające uran w sposób opisany w punkcie 3.
  5. Zastąp pożywkę wzrostową w płytkach z nasionami komórkowymi pożywką zawierającą uranyl. Inkubować przez 24 godziny.
  6. Oblicz niezbędną objętość 1x roztworu MTT w następujący sposób:
    (liczba warunków eksperymentalnych + ślepa próba) x 3 (trzy próby) x 0,4 ml/studzienkę + 10% objętości dla strat po pipetowaniu.
  7. Przygotuj wymaganą objętość 1x roztworu MTT, rozcieńczając 10x roztwór podstawowy MTT w Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) bez czerwieni fenolowej.
    UWAGA: Aby test kolorymetryczny zakończył się sukcesem, MTT należy chronić przed światłem. Zaleca się rozcieńczenie MTT do EMEM, a nie do DMEM, w celu ograniczenia sygnału tła.
  8. Usunąć pożywkę zawierającą uran ze studzienek, przemyć je PBS i dodać 400 μl roztworu MTT do każdej studzienki (w tym 3 puste studzienki na ślepe próby). Inkubować 2,5 godziny w temperaturze 37 °C w ciemności. Sprawdź pod mikroskopem, czy ciemnofioletowe kryształy formazanu utworzyły się w żywotnych komórkach.
  9. Odrzucić roztwór MTT i dodać 220 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do studzienki. Zawiń płytki w folię aluminiową, aby chronić je przed światłem i delikatnie mieszaj przez 10 minut, aby rozpuścić kryształy formazanu.
  10. Za pomocą czytnika spektrometru mikropłytkowego określić gęstość optyczną (OD) przy długości fali 570 nm (specyficzna dla formazanu) i 690 nm (dla tła). Dla każdej studzienki odejmij 690 nm OD od 570 nm, aby dostosować się do możliwych niespecyficznych wahań wartości OD spowodowanych zadrapaniami lub zmętnieniem22.
  11. Obliczyć skorygowaną próbę OD dla każdej studzienki, odejmując średnią OD ślepej próby od OD uzyskanej w poprzednim kroku. Określić średnią wartość OD dla każdego warunku doświadczalnego.
  12. Ustawić średnią OD warunku kontrolnego ([UO22+] = 0 mM) na 100% żywotności i obliczyć odpowiedni procent żywotności komórek dla innych badanych stężeń uranylu. Wykreślić krzywą dawka-odpowiedź. Oceń wskaźnik cytotoksyczności 50 (CI50), zdefiniowany jako stężenie uranylu prowadzące do 50% śmierci komórek po 24-godzinnej ekspozycji.

5. Analiza różnicowania osteoklastów w obecności U(VI)

  1. Różnicowanie komórek RAW 264.7 w obecności uranylu i barwienia TRAP (kwaśna fosfataza odporna na winiany).
    1. Płytka RAW 264.7 komórek na 24-dołkowej płytce, 3 dołki na warunki eksperymentalne. Inkubować w temperaturze 37 °C przez około 6 godzin, czas potrzebny na przygotowanie i zrównoważenie pożywki ekspozycyjnej zawierającej uranyl.
    2. Przygotować pożywkę różnicującą o pożądanych stężeniach uranylu zgodnie z opisem w punkcie 3 (nie zapomnieć o dodaniu GST-RANKL do pożywki).
    3. Delikatnie zastąpić podłoże zasadowe w studzienkach podłożem zawierającym uranyl. Ten dzień jest uważany za dzień 0 różnicowania osteoklastycznego.
    4. Zmień pożywkę w 2 lub 3 dniu różnicowania osteoklastycznego, powtarzając kroki 5.1.2 i 5.1.3. Wielojądrzaste osteoklasty powinny pojawić się między 3 a 4 dniem.
    5. Barwienie TRAP należy wykonać za pomocą dostępnego w handlu zestawu do fosfatazy kwasowej leukocytów zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Kwaśna fosfataza odporna na winian (TRAP), zwana również kwaśną fosfatazą 5, odporna na winian (ACP5) ulega silnej ekspresji w dojrzałych osteoklastach i jest szeroko stosowana jako marker różnicowania osteoklastów. Dlatego barwienie TRAP wykonuje się w celu uwidocznienia osteoklastów. W zależności od warunków eksperymentalnych i tempa osteoklastogenezy, można to zrobić w 4 lub 5 dniu procesu różnicowania.
    6. Studzienki barwione metodą TRAP należy przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C do dalszej analizy (można je przechowywać w tych warunkach do 3 lub 4 tygodni).
  2. Analiza wielkości/morfologii osteoklastów.
    1. Uzyskaj obraz całej powierzchni każdej studni. Rozdzielczość obrazu powinna być wystarczająca do rozróżnienia jąder komórkowych. Weźmy pod uwagę komórki TRAP-dodatnie z 3 lub więcej jądrami, jako osteoklasty.
    2. Otwórz obraz jednej studzienki w oprogramowaniu ImageJ: "Plik" → "Otwórz".
    3. Sprawdź jednostki skali w lewym górnym rogu obrazu. Do względnej kwantyfikacji można użyć dowolnej jednostki. Jeśli wymagana jest bezwzględna wartość rozmiaru osteoklastów, przelicz jednostki skali na μm: "Obraz" → "Właściwości". Zaznacz pole "globalne" w wyskakującym okienku, aby nowe jednostki skali zostały zastosowane do wszystkich obrazów otwartych później.
      UWAGA: Jeśli do akwizycji obrazu użyto mikroskopu, rozmiar piksela w μm jest wskazany dla każdego obiektywu w oprogramowaniu do obrazowania.
    4. Określ parametry pomiarowe, które mają być analizowane: "Analizuj" → "Ustaw pomiary". W oknie Ustaw pomiary zaznacz pola "Obszar" i "Wyświetl etykietę" i odznacz wszystkie inne pola.
    5. Otwórz menedżera ROI (obszar zainteresowania): "Analizuj" → "Narzędzia" → "Menedżer ROI".
    6. W oknie głównym wybierz narzędzie do zaznaczania prostokątnego. Użyj go w dowolnym miejscu obrazu, aby obrysować sektor o wymiarach około 1 000 x 1 000 μm. Ten wybór określa teraz pierwszy region, w którym będzie analizowana wielkość osteoklastów.
    7. W oknie Menedżera ROI kliknij przycisk "Dodaj", aby dodać ten obszar zainteresowania do menedżera ROI i zapisz go, klikając "Więcej" → "Zapisz". Zapisany zwrot z inwestycji można teraz ponownie załadować do menedżera ROI w dowolnym momencie, klikając "Więcej" → "Otwórz".
    8. Powtórz kroki 5.2.5 - 5.2.6, aby zdefiniować 4 dodatkowe regiony do analizy wielkości osteoklastów (Rysunek 2A i 2D).
      UWAGA: Zdefiniowane regiony zostaną użyte do analizy rozmiarów osteoklastów na wszystkich obrazach.
    9. Utwórz kopię jednego z 5 regionów do analizy: wybierz ten ROI w głównym menedżerze ROI (odpowiedni wybór pojawi się na głównym obrazie) → kliknij prawym przyciskiem myszy wewnątrz zaznaczenia → "Duplikuj". Użyj tego duplikatu do dalszej analizy.
    10. W oknie Menedżer ROI zaznacz pola "Pokaż Al" l i "Etykiety".
    11. W oknie głównym wybierz narzędzie do zaznaczania wielokątów, aby ręcznie obrysować jeden z osteoklastów w zaznaczeniu. Dodaj ten konspekt do menedżera ROI, klikając "Dodaj" w oknie menedżera ROI. Postępuj podobnie dla wszystkich osteoklastów, które leżą całkowicie w wybranym regionie (Rysunek 2B i 2E).
    12. W oknie Menedżer ROI zaznacz wszystkie kontury i zmierz ich powierzchnię, klikając "Zmierz". Przenieś pomiary, które pojawiły się w nowym oknie (okno Wyniki, Rysunek 2C i 2F) do arkusza kalkulacyjnego.
      UWAGA: W tym momencie region analizy ze wszystkimi konturami osteoklastów można zapisać jako niezależny obraz: "Plik" → wybranym formacie "Zapisz jako".
    13. Powtórz kroki 5.2.8 - 5.2.12 dla pozostałych obszarów analizy bieżącego obrazu. Następnie powtórz całą procedurę dla wszystkich pozostałych obrazów.
  3. Analiza liczby osteoklastów za pomocą oprogramowania ImageJ.
    UWAGA: Ponieważ rozmieszczenie osteoklastów w studzience rzadko jest jednorodne, liczenie należy przeprowadzić na całej studzience, a nie na kilku wybranych strefach. Biorąc pod uwagę, że osteoklasty są niejednorodne pod względem formy i wielkości, żadna metoda automatycznego liczenia komórek nie jest praktyczna.
    1. Otwórz obraz całej studzienki w oprogramowaniu ImageJ (do tej analizy użyj obrazów z poprzedniej podsekcji).
    2. Otwórz okno licznika komórek: "Wtyczki" → "Analizuj" → "Licznik komórek". Kliknij "Zainicjuj" i zaznacz pole "Wpisz 1" (lub dowolny preferowany numer typu). Sprawdź, czy pole "Pokaż numer" jest zaznaczone, a pole "Tryb usuwania" nie jest odznaczone.
    3. Na obrazku kliknij jeden osteoklast: kolorowa kropka, a w miejscu kliknięcia pojawi się liczba. Podobnie postępować ze wszystkimi osteoklastami. Regularnie zapisuj znaczniki, klikając "Zapisz znaczniki" w oknie licznika komórek
      UWAGA: Jeśli ostatni punkt ma zostać usunięty z liczenia, kliknij "Usuń" w oknie licznika komórek. Jeśli jest więcej niż jeden punkt do usunięcia, zaznacz pole "Tryb usuwania" i wskaż wszystkie nieprawidłowe punkty, klikając je. Następnie odznacz pole "Tryb usuwania", aby kontynuować liczenie.
    4. Wyświetl wynik zliczania, klikając Wyniki w oknie licznika komórek. Przenieś końcowe wyniki liczenia do arkusza kalkulacyjnego.

6. Analiza funkcji osteoklastów w obecności U(VI)

  1. Test resorpcji wgłów.
    1. Płytka komórek RAW 264,7 na 24-dołkowej płytce do badania kości serca, która zapewnia syntetyczną nieorganiczną powierzchnię osteomimetyczną, która może być resorbowana przez osteoklasty.
      UWAGA: Aby komórki mogły przyczepić się do powierzchni biomimetycznej, często lepiej jest pokryć je płytką dzień przed dodaniem pożywki różnicującej.
    2. Różnicować komórki RAW 246.7 w osteoklasty, jak opisano w sekcji 5 (kroki 5.1.2 - 5.1.4)
    3. W 5 dniu osteoklastogenezy usuń osteoklasty z powierzchni mimetycznej kości, zastępując pożywkę zawierającą uran 10% roztworem wybielacza. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umyj studzienki dwukrotnie wodą dejonizowaną i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
    4. Dodać 1% roztwór soli sodowej czerwieni sodowej Alizaryny S do studzienek, aby zabarwić sole wapnia w obszarach nieresorpcyjnych. Usuń roztwór alizaryny po 10-15 s inkubacji i delikatnie umyj studzienki 3-4 razy wodą. Niech studzienki wyschną na powietrzu.
      UWAGA: Opisana powyżej procedura barwienia ma na celu zwiększenie kontrastu między obszarami resorbowanymi i nieresorbowanymi, aby ułatwić ciągłą analizę. Procedurę tę należy wykonać ostrożnie, ponieważ jeśli studzienki nie wyschną całkowicie przed barwieniem, części pozostałej powierzchni mimetycznej kości mogą zostać przypadkowo usunięte. Co więcej, jeśli roztwór alizaryny zostanie pozostawiony zbyt długo w studzienkach, pojawi się trwałe, niespecyficzne zabarwienie. Należy zauważyć, że test opisany w tej sekcji dotyczy wpływu uranu zarówno na różnicowanie osteoklastów, jak i ich funkcję. Aby zbadać wpływ uranu na resorpcję niezależnie od tworzenia osteoklastów, komórki RAW 264.7 można traktować pożywką zawierającą uran przez 24 godziny, tylko po utworzeniu dojrzałych osteoklastów (w 4 lub 5 dniu procesu różnicowania) 23.
  2. Analiza resorpcji wżerów.
    1. Uzyskaj obraz całej powierzchni każdej studzienki płytki do testu kostnego.
      UWAGA: Metody pozyskiwania obrazów mogą się różnić, ale powinny być spójne przez cały czas trwania eksperymentów. Mogą to być zdjęcia wykonane obiektywem makro za pomocą aparatu stałopozycyjnego, skan o wysokiej rozdzielczości lub obraz mozaikowy wykonany za pomocą zautomatyzowanego mikroskopu o wysokiej przepustowości.
    2. Rozpocznij analizę, powtarzając kroki od 5.2.2 do 5.2.4 z poprzedniej sekcji.
    3. Konwertuj obraz RGB na 8-bitowy format w skali szarości: "Obraz" → "Typ" → "8-bitowy".
    4. W oknie głównym wybierz narzędzie do zaznaczania owalu. Użyj go, aby narysować okrąg wyznaczający całą powierzchnię studni, która ma być analizowana pod kątem resorpcji.
    5. Zapisz ten nowy zwrot z inwestycji, jak w kroku 5.2.6.
    6. Aby ułatwić wybór progu, usuń wszystkie cechy poza zdefiniowanym ROI: "Edytuj" → "Wyczyść na zewnątrz".
      UWAGA: W tym momencie często lepiej jest zrobić kilka kopii obrazu: odznacz ROI, klikając poza wybraną strefą → kliknij prawym przyciskiem myszy na obrazie → "Duplikuj". Takie działanie pozwoli uniknąć powtórzenia opisanego powyżej zabiegu obrazowego, jeśli próg wybrany w kolejnym kroku jest niezadowalający.
    7. Wybierz "Obraz" → "Dostosuj" → "Próg". W oknie Próg użyj suwaka, aby wybrać odpowiedni próg. Wszystkie obszary resorpowane powinny znajdować się poniżej progu (kolor biały), a obszary niezasorbowane powyżej (kolor czerwony). Aby sfinalizować wybór progu, kliknij "Zastosuj" w oknie Próg.
    8. Zapisz końcowy obraz binarny: "Plik" → "Zapisz jako" → wybranym formacie.
    9. Zdefiniuj pomiary, które mają być wykonane w obszarze zainteresowania: "Analizuj" → "Ustaw pomiary". W oknie Ustaw pomiary zaznacz pola "Powierzchnia", "Ułamek powierzchni" i "Ogranicz do progu" i odznacz wszystkie pozostałe.
    10. W celu uzyskania ułamka "resorbowanego" obszaru bezpośrednio w oknie Wyniki, odwróć obraz binarny ("Edycja" → "Odwróć"). Upewnij się, że główny zwrot z inwestycji jest wybrany na końcowym obrazie binarnym (w przeciwnym razie frakcja obszaru resorbowanego zostanie obliczona na podstawie powierzchni całego okna obrazu). Zmierz frakcję resorbowanego obszaru, klikając "Zmierz" w oknie menedżera ROI lub "Analizuj" → "Zmierz". Zapisz wynik.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odporne na winian barwienie kwaśną fosfatazą zostało użyte do wizualizacji osteoklastów jako dużych fioletowych komórek mających 3 lub więcej jąder. Reprezentatywne obrazy osteoklastów uzyskanych z komórek RAW 264.7 hodowanych w obecności jonów RANKL i uranylu pokazano na Rysunek 1. Zmiany w liczbie i wielkości osteoklastów w odpowiedzi na uran są łatwo widoczne na złożonych zdjęciach całych studni oraz na powiększonych zdjęciach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O ile nam wiadomo, po raz pierwszy opisano szczegółową procedurę mającą na celu zbadanie wpływu naturalnego uranu na komórki resorpcyjne kości. Podejście to będzie przydatne do lepszego zrozumienia wpływu uranu na fizjologię kości i może stanowić interesujące nowe narzędzie do badań przesiewowych chelatatorów uranu. Ponadto uważamy, że opisany tutaj protokół może być zastosowany do badania wpływu innych metali ciężkich na osteoklatogenezę.

Wiadomo, że uranyl jest skompleksowany ze składnikami ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Chantal Cros za pomocną pomoc techniczną.
Badania te zostały sfinansowane z grantów "Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives" (URANOs - Programme Transversal de Toxicologie du CEA and CPRR CEA-AREVA) oraz ANR (Toxicity of URanium: Multi-level approach of biomineralization process in BOne, ANR-16-CE34-0003). Prace te były również wspierane przez Uniwersytet w Nicei Sophia-Antipolis i CNRS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMLonzaBE12-604F
α-MEMLonzaBE12-169F
EMEM bez czerwieni fenolowejLonza12-668E
Woda do hodowli komórkowychLonzaBE17-724F
PBSSigma-AldrichD8537
Roztwór penicyliny-streptomycynySigma-AldrichP4333
  Roztwór L-glutaminySigma-AldrichG7513
Roztwór błękitu trypanowego 0,4%Sigma-AldrichT8154
Hyklonowa płodowa surowica bydlęcaGE Life SciencesSH30071.03
7,5% wodny roztwór wodorowęglanu soduSigma-AldrichS8761
Zestaw fosfatazy kwasowej, lekocytów (TRAP)Sigma-Aldrich387A
Bromek tetrazolium (MTT) w proszkuSigma-AldrichM5655
DimetylosulfotlenekSigma-AldrichD5879
Sól sodowa czerwieni alizarynowej S, 1% w/v aq. sol.Alfa Aeros42746
Płytki do osteoaspekcji kości, płytki 24-dołkoweCorning Life Sciences3987
Multiwell 24-dołkowe płytkiFalcon353504
Kolba 75 cm2Falcon353133
Polipropylenowe probówki stożkowe 50 mlFalcon352070
Skrobaki do komórek 30 cmTPPNumer katalogowy 90003

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. Toxicological profile for uranium. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. , Atlanta, GA. (2013).
  2. Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat. Health Phys. 51 (6), 755-771 (1986).
  3. Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual. Health Phys. 57 (1), 17-21 (1989).
  4. Kurttio, P., et al. Renal effects of uranium in drinking water. Environ.Health Perspect. 110 (4), 337-342 (2002).
  5. Leggett, R. W. Basis for the ICRP's age-specific biokinetic model for uranium. Health Phys. 67 (6), 589-610 (1994).
  6. Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. Bone as target organ for metals: the case of f-elements. Chem. Res. Toxicol. 25 (6), 1161-1175 (2012).
  7. Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development. Toxicol. Lett. 236 (2), 123-130 (2015).
  8. Ikeda, K., Takeshita, S. The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis. J. Biochem. 159 (1), 1-8 (2016).
  9. Teiltelbaum, S. L. The osteoclast and its unique cytoskeleton. Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).
  10. Nesbitt, S. A., Horton, M. A. Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts. Science. 276 (5310), 266-269 (1997).
  11. Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis. Science. 276 (5310), 270-273 (1997).
  12. Pierrefite-Carle, V., et al. Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity. Arch. Toxicol. 91 (4), 1903-1914 (2017).
  13. Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling. Environ. Res. 54 (1), 17-23 (1991).
  14. Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate. Arch. Toxicol. 79 (8), 475-481 (2005).
  15. Kurttio, P., et al. Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water. Environ. Health Perspect. 113 (1), 68-72 (2005).
  16. Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells. Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).
  17. Beranger, G. E., et al. Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis. J. Bone Miner. Res. 22 (7), 975-983 (2007).
  18. Mirto, H., et al. Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells. Hum. Exp. Toxicol. 18 (3), 180-187 (1999).
  19. Carrière, M., et al. Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity. Chem. Res. Toxicol. 17 (3), 446-452 (2004).
  20. Milgram, S., Carrière, M., Malaval, L., Gouget, B. Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation. Toxicology. 252 (1-3), 26-32 (2008).
  21. Milgram, S., Carrière, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation. Toxicology. 250 (1), 62-69 (2008).
  22. Studzinski, G. P. Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. , Oxford University Press. Oxford. (1999).
  23. Gritsaenko, T., et al. Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts. Biochim Biophys Acta. 1861 (4), 715-726 (2017).
  24. Motiur Rahman, M., et al. Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation. Bone. 81, 392-399 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Natural UraniumOsteoclastogenesisRAW 264 7 CellsUranyl AcetateOsteoclast DifferentiationBone Resorption AssayImageJ AnalysisAlizarin Red StainingTartrate Resistant Acid PhosphataseOsteo Assay Plate

Powiązane artykuły