Ten manuskrypt opisuje analizę zmienności liczby kopii przeprowadzoną w DNA surowicy lub osocza przy użyciu metody PCR w czasie rzeczywistym. Metoda ta jest odpowiednia do przewidywania oporności na leki u pacjentów z rakiem gruczołu krokowego opornym na kastrację, ale może być również pouczająca w przypadku innych chorób.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie liczby kopii w surowicy i osoczu za pomocą PCR w czasie rzeczywistym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykazano, że wolne od DNA w surowicy i komórkach plazmatycznych (cfDNA) jest informacyjnym, nieinwazyjnym źródłem biomarkerów do diagnozowania raka, prognozowania, monitorowania i przewidywania oporności na leczenie. Wychodząc od hipotezy, że przyrost liczby kopii genu (CN) receptora androgenowego (AR) jest częstym zdarzeniem w raku prostaty z opornością na kastrację z przerzutami (mCRPC), proponujemy analizę tego zdarzenia w cfDNA jako potencjalnego biomarkera predykcyjnego.
Oceniliśmy AR CN w cfDNA za pomocą 2 różnych testów PCR w czasie rzeczywistym i 2 genów referencyjnych (RNaseP i AGO1). Do każdej kombinacji testów użyto ilości DNA wynoszącej 60 ng. Ar Przyrost CN potwierdzono przy użyciu Digital PCR jako dokładniejszej metody. Wykazano już, że analiza zmienności CN dostarcza informacji w przewidywaniu oporności na leczenie w warunkach mCRPC, ale może być również przydatna do innych celów w różnych warunkach pacjentów. Analiza CN cfDNA ma kilka zalet: jest nieinwazyjna, szybka i łatwa do przeprowadzenia, a zaczyna się od niewielkiej objętości surowicy lub osocza.
Wprowadzenie
Wykazano, że krążące wolne DNA komórkowe (cfDNA) we krwi jest optymalnym źródłem biomarkerów do diagnozowania raka, prognozowania, monitorowania i przewidywania oporności na leczenie1,2. Wiele badań wykazało dobrą zgodność między zmianami DNA (mutacje, zmiany liczby kopii, modyfikacje epigenetyczne) w tkankach a tymi znalezionymi w odpowiednich próbkach osocza1, potwierdzając, że krążące DNA guza (ctDNA) jest informacyjne dla pierwotnych i przerzutowych zmian w tkance nowotworowej3. Możliwość badania ctDNA pozwala zatem na rekonstrukcję rearanżacji genomu i zmian liczby kopii (CNV) w określonych onkogenach4, identyfikując potencjalnie przerzutowe komórki klonalne i subklonalne. Wykazano, że CtDNA jest klinicznie przydatny, szczególnie do monitorowania leczenia raka, ponieważ zawiera specyficzne mutacje i CNV, związane ze specyficznymi terapiami celowanymi5,6. Eliminuje również potrzebę wykonywania biopsji tkanek i pozwala na uzyskanie wyników w różnych momentach podczas określonego leczenia raka w sposób nieinwazyjny.
W odniesieniu do raka prostaty, wykazano istotną korelację między krążącymi CNV receptorów androgenowych wolnych komórek (AR) a odpowiedzią na leczenie abirateronem i enzalutamidem, co wskazuje, że liczba kopii genu AR (CN) w cfDNA może być obiecującym biomarkerem zdolnym do przewidywania oporności na leczenie7,8,9,10,11. CNV określonych genów w ctDNA mogą być oceniane przy użyciu różnych podejść o różnej czułości, kosztach i szybkości (np. sekwencjonowanie w czasie rzeczywistym, Digital PCR i Next Generation Sequencing).
Tutaj opisujemy proste i szybkie podejście, oparte na testach dupleksowych w technologii PCR w czasie rzeczywistym, do oceny AR CN w cfDNA z próbek surowicy i osocza7,8. Rozważyliśmy dwa różne testy PCR zaprojektowane na dwóch różnych regionach genomu w obrębie intronu 5 AR (Xq12) i dwóch innych genów, jako wewnętrznych standardowych genów referencyjnych, o których wiadomo, że mają normalny status liczby kopii w raku prostaty (RNaseP, zlokalizowany na 14q11; AGO1, znajduje się na 1p34). Wybraliśmy dwa geny referencyjne, a nie jeden, aby zwiększyć precyzję i czułość wyników. Ilość DNA wynosząca 60 ng amplifikowano dla każdej kombinacji testów (test łączony dla AR-assay_1+RNaseP i dla AR-assay_2+AGO1). Trzy próbki DNA surowicy lub osocza od zdrowych mężczyzn zostały połączone i użyte jako kalibrator. Wzięliśmy pod uwagę wartości graniczne >1,5 dla wzmocnienia AR i <0,5 dla usuwania. Jedną z głównych zalet tej metody jest to, że jest ona elastyczna i że inne geny mogą być również oceniane, zmieniając standardowe wewnętrzne geny referencyjne na podstawie typu i cech guza.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół polega na izolacji DNA z próbek surowicy lub osocza w celu przeprowadzenia PCR w czasie rzeczywistym w celu analizy liczby kopii. Przeprowadzono ekstrakcję DNA, kontrolę ilości DNA (spektrofotometr) oraz PCR w czasie rzeczywistym dla określonych celów. W Rysunek 1, przedstawione jest podsumowanie procedur i oś czasu.
Protokół jest zgodny z wytycznymi Komitetu Etyki Badań Naukowych IRST.
1. Pobieranie i przetwarzanie surowicy
- Zebrać około 5 ml krwi pełnej do probówki z surowicą bez antykoagulantu, aby uzyskać surowicę. Utrzymać probówki z krwią w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia.
- Probówki wirówkowe o ciśnieniu 1 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
- Ostrożnie przenieś surowicę do probówek o pojemności 2 ml.
- Wyrzucić probówkę zbiorczą i natychmiast zamrozić supernatant w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
2. Pobieranie i przetwarzanie osocza
- Zebrać około 10 ml krwi pełnej do probówki osocza z EDTA, aby uzyskać osocze. Całkowicie napełnij rurkę, a następnie odwróć ją 8 razy. Utrzymać probówki z krwią w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia.
- Odwirować probówkę o stężeniu 1 800 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej bez ustawiania hamulca na wirówce.
- Ostrożnie przenieść górną część osocza do probówek o pojemności 2 ml. Powtórzyć transfer, pozostawiając co najmniej 1 ml supernatantu nad warstwą krwinek białych.
UWAGA: Przeniesienie górnej części supernatantu zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia przez komórki lub szczątki komórek. - Wyrzucić probówkę zbiorczą i natychmiast zamrozić supernatant w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
3. Izolacja DNA z surowicy lub osocza
UWAGA: Izolacja DNA z surowicy lub osocza powinna być przeprowadzona przy użyciu komercyjnego protokołu zmodyfikowanego w następujących krokach.
- Rozmrozić jedną podwielokrotność (zawierającą od 0,5 do 2 ml) surowicy lub osocza w temperaturze pokojowej.
- Odwirować i wymieszać próbkę i przenieść 0,5 ml surowicy lub osocza do przezroczystej probówki o pojemności 1,5 ml. Resztę materiału zamrozić w temperaturze -80 °C.
- Dodać 50 μl proteinazy k (20 mg/ml) bezpośrednio do próbki.
- Dodać 0,5 ml buforu do lizy do próbki i dobrze wymieszać przez pipetowanie.
- Zamknąć probówki i inkubować próbki w temperaturze 56 °C przez 15 minut w bloku grzewczym.
- Dodaj wskazaną ilość 100% etanolu w buforze do przemywania 1 i 2, zgodnie z instrukcjami producenta.
- Doprowadzić próbki z powrotem do temperatury pokojowej, dodać 0,5 ml absolutnego alkoholu etylowego i dobrze wymieszać przez pipetowanie.
- Dodać 650 μl mieszaniny otrzymanej w kroku 3.7 do kolumny rozdzielającej i odwirować przy 6 000 x g przez 1 minutę.
- Wyrzuć probówkę, przez którą przepływa przepływ, i umieść kolumnę na nowej czystej probówce zbiorczej. Powtórz kroki 3.8 i 3.9 jeszcze raz.
- Dodać 500 μl buforu do przemywania 1, nie zwilżając brzegu kolumny i odwirować przy 6 000 x g przez 1 min.
- Wyrzuć probówkę, przez którą przepływa przepływ, i zastąp ją nową czystą probówką zbiorczą.
- Dodać 500 μl buforu płuczącego 2, nie zwilżając brzegu kolumny i odwirować z pełną prędkością (20 000 x g) przez 3 min.
- Wyrzuć probówkę, przez którą przepływa przepływ, i zastąp ją nową czystą probówką zbiorczą.
- Wirować z pełną prędkością (20 000 x g) przez 3 minuty, aby usunąć resztki buforu myjącego.
- Umieść kolumnę w czystej probówce o pojemności 1.5 ml. Dodać 150 μl buforu elucyjnego i odczekać 7 minut, aby upewnić się, że bufor zwilżył kolumnę.
- Wirować przy 8 000 x g przez 1 min.
- Ponownie pipetować elucję z kroku 3.16 do tej samej kolumny i wirować z pełną prędkością (20 000 x g) przez 1 minutę, aby zapewnić maksymalny odzysk DNA.
4. Kwantyfikacja i rozcieńczenie DNA
- Przeprowadzić kwantyfikację DNA za pomocą spektrofotometru. Użyć 2 μl próbki na spektrofotometrze laboratoryjnym zgodnie z instrukcjami producenta.
UWAGA: Jeśli ilość DNA nie jest wystarczająca do przeprowadzenia PCR w czasie rzeczywistym (co najmniej 120 ng), wykonaj nowy proces izolacji DNA. - Rozcieńczyć DNA z surowicy lub osocza do 2,5 ng/μl w końcowej objętości wystarczającej do przeprowadzenia wszystkich testów PCR w czasie rzeczywistym (około 50 μl).
5. PCR w czasie rzeczywistym
- Testy liczby kopii rozmrażających, referencyjne testy genetyczne, próbki rozcieńczone DNA i kalibratory zebrane w lodzie. W temperaturze pokojowej zrównoważyć mieszankę wzorcową, która jest przechowywana w temperaturze 4 °C.
- Przygotować mieszaninę 1 μl testu docelowego, 1 μl referencyjnego testu genetycznego i 10 μl mieszanki wzorcowej dla 3 powtórzeń każdej próbki i połączonych kalibratorów. Przygotować mieszaninę wraz z kontrolą ujemną (woda) i 2 dodatkowymi próbkami.
- W 96-dołkowej płytce podwielokrotnie 12 μl mieszanki do każdej studzienki. Nie pipetować ani nie wirować probówek.
- Dodać 8 μl (stężenie 2,5 ng/μl) każdej próbki DNA i skalibrować je w każdym dołku. Nie pipetować ani nie wirować probówek. Zmień końcówkę dla każdej studzienki.
UWAGA: 30 próbek DNA można przetworzyć dla każdego eksperymentu w czasie rzeczywistym przy użyciu płytki 96-dołkowej: 30 x 3 próbki + 1 x 3 kalibratory połączone + kontrola ujemna = 94. - Krótko odwiruj talerz przy 1 000 x g.
- Uruchomić płytkę zgodnie z następującym protokołem: utrzymać stolik w temperaturze 95 °C przez 10 minut, 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 minutę.
6. Analiza i interpretacja danych
- W sekcji "opcja", poniżej wyników wykresu amplifikacji, ustaw próg Ct na 0,2 dla pierwszego analizowanego genu docelowego. Powtórz zestaw dla każdego genu docelowego lub referencyjnego. Aby wyeksportować plik PCR w czasie rzeczywistym w .txt rozszerzeniu, naciśnij "Eksportuj" na pasku narzędzi. Oznacz tylko "wyniki" w wybierz dane do eksportu → wybierz jako typ pliku rozszerzenie .txt → naciśnij "rozpocznij eksport"→ zamknąć narzędzie eksportu.
- Otwórz oprogramowanie analityczne i zaimportuj plik .txt (pasek narzędzi → importu).
- Wybierz nazwę pliku do analizy i wybierz ustawienie analizy według paska narzędzi (symbol odtwarzania).
- Określ próbkę kalibratora i znaną liczbę kopii celu (np. 1 kopia dla genu AR). Naciśnij "zastosuj".
- Dla każdej próbki należy pominąć jedną studzienkę o innej delcie Ct (ΔCt) w porównaniu z innymi studzienkami.
- Ponownie przeanalizuj eksperyment (naciśnij symbol odtwarzania).
- Oceń wyniki za pomocą wykresu słupkowego kopiowania numeru lub tabeli.
UWAGA: Tabela wyników zawiera wiele parametrów, takich jak ufność, wskaźnik Z i analizowane repliki, które mogą być przydatne do interpretacji wyników.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Całkowite stężenie cfDNA było mierzalne metodą spektrofotometryczną dla wszystkich analizowanych próbek, wykazując medianę 6,12 ng/µL (zakres: 2,0 - 23,71 ng/µL) dla próbek surowicy oraz medianę 3,21 ng/µL (zakres: 2,31 - 8,49 ng/µL) dla próbek osocza. Łącznie przeanalizowano 15 próbek za pomocą eksperymentów real-time PCR.
Czułość testu oceniono przy użyciu mieszanin DNA z surowicy pacjentów z wysokim lub niskim przyrostem licz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
AR Analiza CN w próbce surowicy i osocza stanowi nowe, nieinwazyjne podejście do stratyfikacji pacjentów z rakiem gruczołu krokowego opornym na kastrację (CRPC). Niedawno wykazano, że AR CN jest w stanie przewidzieć wyniki u pacjentów z CRPC leczonych abirateronem i enzalutamidem, przed i po chemioterapii 7,8,9,10.
Główną zaletą naszego podejścia je...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy Chiarze Molinari i Filippo Martignano za wsparcie w analizie danych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| BD Vacutainer Probówki do surowicy | Becton Dickinson | 367814 | probówka z krwią pełną do surowicy |
| BD Vacutainer EDTA Probówki | Becton Dickinson | 366643 | pełna probówka z krwią do osocza |
| Absolutny etanol | VWR | użytkownik może korzystać również z innych firm | |
| TaqMan Test liczby kopii | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Wstępnie zaprojektowane i zwalidowane testy z barwnikiem FAM. Użyliśmy następującego testu: AR_assay1: hs04107225 i AR_assay2: hs04511283 |
| Test liczby kopii TaqMan (zmodyfikowany) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Wstępnie zaprojektowany test zmodyfikowany barwnikiem VIC: AGO1: Hs02320401_cn |
| referencyjny numeru kopii TaqMan, człowiek, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Mieszanka główna do PCR w czasie rzeczywistym |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Zestaw do ekstrakcji DNA | Qiagen | 51304 |
| MicroAmp 96-dołkowe płytki | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | płytki do |
| spektrofotometru NanoDrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | - | użytkownik może użyć również innych metod spektrofotometrycznych do ilościowego określenia systemu |
| szybkiego PCR | w czasie rzeczywistym DNA 7500Applied Biosystem | - | użytkownik może korzystać również z innego instrumentu czasu rzeczywistego |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | - | oprogramowanie do analizy liczby kopii |
Bibliografia
- Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
- Murtaza, M., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies. Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).
- Diaz, L. A. Jr, et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
- Romanel, A., et al. Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer. Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).
- Conteduca, V., et al. Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study. Ann Oncol. , (2017).
- Attard, G., Antonarakis, E. S. Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide. Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).
- Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).
- Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
