Wykrywanie liczby kopii w surowicy i osoczu za pomocą PCR w czasie rzeczywistym

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje analizę zmienności liczby kopii przeprowadzoną w DNA surowicy lub osocza przy użyciu metody PCR w czasie rzeczywistym. Metoda ta jest odpowiednia do przewidywania oporności na leki u pacjentów z rakiem gruczołu krokowego opornym na kastrację, ale może być również pouczająca w przypadku innych chorób.

Streszczenie

Wykazano, że wolne od DNA w surowicy i komórkach plazmatycznych (cfDNA) jest informacyjnym, nieinwazyjnym źródłem biomarkerów do diagnozowania raka, prognozowania, monitorowania i przewidywania oporności na leczenie. Wychodząc od hipotezy, że przyrost liczby kopii genu (CN) receptora androgenowego (AR) jest częstym zdarzeniem w raku prostaty z opornością na kastrację z przerzutami (mCRPC), proponujemy analizę tego zdarzenia w cfDNA jako potencjalnego biomarkera predykcyjnego.

Oceniliśmy AR CN w cfDNA za pomocą 2 różnych testów PCR w czasie rzeczywistym i 2 genów referencyjnych (RNaseP i AGO1). Do każdej kombinacji testów użyto ilości DNA wynoszącej 60 ng. Ar Przyrost CN potwierdzono przy użyciu Digital PCR jako dokładniejszej metody. Wykazano już, że analiza zmienności CN dostarcza informacji w przewidywaniu oporności na leczenie w warunkach mCRPC, ale może być również przydatna do innych celów w różnych warunkach pacjentów. Analiza CN cfDNA ma kilka zalet: jest nieinwazyjna, szybka i łatwa do przeprowadzenia, a zaczyna się od niewielkiej objętości surowicy lub osocza.

Wprowadzenie

Wykazano, że krążące wolne DNA komórkowe (cfDNA) we krwi jest optymalnym źródłem biomarkerów do diagnozowania raka, prognozowania, monitorowania i przewidywania oporności na leczenie^1,2. Wiele badań wykazało dobrą zgodność między zmianami DNA (mutacje, zmiany liczby kopii, modyfikacje epigenetyczne) w tkankach a tymi znalezionymi w odpowiednich próbkach osocza¹, potwierdzając, że krążące DNA guza (ctDNA) jest informacyjne dla pierwotnych i przerzutowych zmian w tkance nowotworowej³. Możliwość badania ctDNA pozwala zatem na rekonstrukcję rearanżacji genomu i zmian liczby kopii (CNV) w określonych onkogenach⁴, identyfikując potencjalnie przerzutowe komórki klonalne i subklonalne. Wykazano, że CtDNA jest klinicznie przydatny, szczególnie do monitorowania leczenia raka, ponieważ zawiera specyficzne mutacje i CNV, związane ze specyficznymi terapiami celowanymi^5,6. Eliminuje również potrzebę wykonywania biopsji tkanek i pozwala na uzyskanie wyników w różnych momentach podczas określonego leczenia raka w sposób nieinwazyjny.

W odniesieniu do raka prostaty, wykazano istotną korelację między krążącymi CNV receptorów androgenowych wolnych komórek (AR) a odpowiedzią na leczenie abirateronem i enzalutamidem, co wskazuje, że liczba kopii genu AR (CN) w cfDNA może być obiecującym biomarkerem zdolnym do przewidywania oporności na leczenie7^,8,9,10,11. CNV określonych genów w ctDNA mogą być oceniane przy użyciu różnych podejść o różnej czułości, kosztach i szybkości (np. sekwencjonowanie w czasie rzeczywistym, Digital PCR i Next Generation Sequencing).

Tutaj opisujemy proste i szybkie podejście, oparte na testach dupleksowych w technologii PCR w czasie rzeczywistym, do oceny AR CN w cfDNA z próbek surowicy i osocza^7,8. Rozważyliśmy dwa różne testy PCR zaprojektowane na dwóch różnych regionach genomu w obrębie intronu 5 AR (Xq12) i dwóch innych genów, jako wewnętrznych standardowych genów referencyjnych, o których wiadomo, że mają normalny status liczby kopii w raku prostaty (RNaseP, zlokalizowany na 14q11; AGO1, znajduje się na 1p34). Wybraliśmy dwa geny referencyjne, a nie jeden, aby zwiększyć precyzję i czułość wyników. Ilość DNA wynosząca 60 ng amplifikowano dla każdej kombinacji testów (test łączony dla AR-assay_1+RNaseP i dla AR-assay_2+AGO1). Trzy próbki DNA surowicy lub osocza od zdrowych mężczyzn zostały połączone i użyte jako kalibrator. Wzięliśmy pod uwagę wartości graniczne >1,5 dla wzmocnienia AR i <0,5 dla usuwania. Jedną z głównych zalet tej metody jest to, że jest ona elastyczna i że inne geny mogą być również oceniane, zmieniając standardowe wewnętrzne geny referencyjne na podstawie typu i cech guza.

Protokół

Protokół polega na izolacji DNA z próbek surowicy lub osocza w celu przeprowadzenia PCR w czasie rzeczywistym w celu analizy liczby kopii. Przeprowadzono ekstrakcję DNA, kontrolę ilości DNA (spektrofotometr) oraz PCR w czasie rzeczywistym dla określonych celów. W Rysunek 1, przedstawione jest podsumowanie procedur i oś czasu.

Protokół jest zgodny z wytycznymi Komitetu Etyki Badań Naukowych IRST.

1. Pobieranie i przetwarzanie surowicy

1. Zebrać około 5 ml krwi pełnej do probówki z surowicą bez antykoagulantu, aby uzyskać surowicę. Utrzymać probówki z krwią w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia.
2. Probówki wirówkowe o ciśnieniu 1 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
3. Ostrożnie przenieś surowicę do probówek o pojemności 2 ml.
4. Wyrzucić probówkę zbiorczą i natychmiast zamrozić supernatant w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

2. Pobieranie i przetwarzanie osocza

1. Zebrać około 10 ml krwi pełnej do probówki osocza z EDTA, aby uzyskać osocze. Całkowicie napełnij rurkę, a następnie odwróć ją 8 razy. Utrzymać probówki z krwią w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia.
2. Odwirować probówkę o stężeniu 1 800 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej bez ustawiania hamulca na wirówce.
3. Ostrożnie przenieść górną część osocza do probówek o pojemności 2 ml. Powtórzyć transfer, pozostawiając co najmniej 1 ml supernatantu nad warstwą krwinek białych.
   UWAGA: Przeniesienie górnej części supernatantu zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia przez komórki lub szczątki komórek.
4. Wyrzucić probówkę zbiorczą i natychmiast zamrozić supernatant w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

3. Izolacja DNA z surowicy lub osocza

UWAGA: Izolacja DNA z surowicy lub osocza powinna być przeprowadzona przy użyciu komercyjnego protokołu zmodyfikowanego w następujących krokach.

1. Rozmrozić jedną podwielokrotność (zawierającą od 0,5 do 2 ml) surowicy lub osocza w temperaturze pokojowej.
2. Odwirować i wymieszać próbkę i przenieść 0,5 ml surowicy lub osocza do przezroczystej probówki o pojemności 1,5 ml. Resztę materiału zamrozić w temperaturze -80 °C.
3. Dodać 50 μl proteinazy k (20 mg/ml) bezpośrednio do próbki.
4. Dodać 0,5 ml buforu do lizy do próbki i dobrze wymieszać przez pipetowanie.
5. Zamknąć probówki i inkubować próbki w temperaturze 56 °C przez 15 minut w bloku grzewczym.
6. Dodaj wskazaną ilość 100% etanolu w buforze do przemywania 1 i 2, zgodnie z instrukcjami producenta.
7. Doprowadzić próbki z powrotem do temperatury pokojowej, dodać 0,5 ml absolutnego alkoholu etylowego i dobrze wymieszać przez pipetowanie.
8. Dodać 650 μl mieszaniny otrzymanej w kroku 3.7 do kolumny rozdzielającej i odwirować przy 6 000 x g przez 1 minutę.
9. Wyrzuć probówkę, przez którą przepływa przepływ, i umieść kolumnę na nowej czystej probówce zbiorczej. Powtórz kroki 3.8 i 3.9 jeszcze raz.
10. Dodać 500 μl buforu do przemywania 1, nie zwilżając brzegu kolumny i odwirować przy 6 000 x g przez 1 min.
11. Wyrzuć probówkę, przez którą przepływa przepływ, i zastąp ją nową czystą probówką zbiorczą.
12. Dodać 500 μl buforu płuczącego 2, nie zwilżając brzegu kolumny i odwirować z pełną prędkością (20 000 x g) przez 3 min.
13. Wyrzuć probówkę, przez którą przepływa przepływ, i zastąp ją nową czystą probówką zbiorczą.
14. Wirować z pełną prędkością (20 000 x g) przez 3 minuty, aby usunąć resztki buforu myjącego.
15. Umieść kolumnę w czystej probówce o pojemności 1.5 ml. Dodać 150 μl buforu elucyjnego i odczekać 7 minut, aby upewnić się, że bufor zwilżył kolumnę.
16. Wirować przy 8 000 x g przez 1 min.
17. Ponownie pipetować elucję z kroku 3.16 do tej samej kolumny i wirować z pełną prędkością (20 000 x g) przez 1 minutę, aby zapewnić maksymalny odzysk DNA.

4. Kwantyfikacja i rozcieńczenie DNA

1. Przeprowadzić kwantyfikację DNA za pomocą spektrofotometru. Użyć 2 μl próbki na spektrofotometrze laboratoryjnym zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Jeśli ilość DNA nie jest wystarczająca do przeprowadzenia PCR w czasie rzeczywistym (co najmniej 120 ng), wykonaj nowy proces izolacji DNA.
2. Rozcieńczyć DNA z surowicy lub osocza do 2,5 ng/μl w końcowej objętości wystarczającej do przeprowadzenia wszystkich testów PCR w czasie rzeczywistym (około 50 μl).

5. PCR w czasie rzeczywistym

1. Testy liczby kopii rozmrażających, referencyjne testy genetyczne, próbki rozcieńczone DNA i kalibratory zebrane w lodzie. W temperaturze pokojowej zrównoważyć mieszankę wzorcową, która jest przechowywana w temperaturze 4 °C.
2. Przygotować mieszaninę 1 μl testu docelowego, 1 μl referencyjnego testu genetycznego i 10 μl mieszanki wzorcowej dla 3 powtórzeń każdej próbki i połączonych kalibratorów. Przygotować mieszaninę wraz z kontrolą ujemną (woda) i 2 dodatkowymi próbkami.
3. W 96-dołkowej płytce podwielokrotnie 12 μl mieszanki do każdej studzienki. Nie pipetować ani nie wirować probówek.
4. Dodać 8 μl (stężenie 2,5 ng/μl) każdej próbki DNA i skalibrować je w każdym dołku. Nie pipetować ani nie wirować probówek. Zmień końcówkę dla każdej studzienki.
   UWAGA: 30 próbek DNA można przetworzyć dla każdego eksperymentu w czasie rzeczywistym przy użyciu płytki 96-dołkowej: 30 x 3 próbki + 1 x 3 kalibratory połączone + kontrola ujemna = 94.
5. Krótko odwiruj talerz przy 1 000 x g.
6. Uruchomić płytkę zgodnie z następującym protokołem: utrzymać stolik w temperaturze 95 °C przez 10 minut, 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 minutę.

6. Analiza i interpretacja danych

1. W sekcji "opcja", poniżej wyników wykresu amplifikacji, ustaw próg Ct na 0,2 dla pierwszego analizowanego genu docelowego. Powtórz zestaw dla każdego genu docelowego lub referencyjnego. Aby wyeksportować plik PCR w czasie rzeczywistym w .txt rozszerzeniu, naciśnij "Eksportuj" na pasku narzędzi. Oznacz tylko "wyniki" w wybierz dane do eksportu → wybierz jako typ pliku rozszerzenie .txt → naciśnij "rozpocznij eksport"→ zamknąć narzędzie eksportu.
2. Otwórz oprogramowanie analityczne i zaimportuj plik .txt (pasek narzędzi → importu).
3. Wybierz nazwę pliku do analizy i wybierz ustawienie analizy według paska narzędzi (symbol odtwarzania).
4. Określ próbkę kalibratora i znaną liczbę kopii celu (np. 1 kopia dla genu AR). Naciśnij "zastosuj".
5. Dla każdej próbki należy pominąć jedną studzienkę o innej delcie Ct (ΔCt) w porównaniu z innymi studzienkami.
6. Ponownie przeanalizuj eksperyment (naciśnij symbol odtwarzania).
7. Oceń wyniki za pomocą wykresu słupkowego kopiowania numeru lub tabeli.
   UWAGA: Tabela wyników zawiera wiele parametrów, takich jak ufność, wskaźnik Z i analizowane repliki, które mogą być przydatne do interpretacji wyników.

Wyniki

Całkowite stężenie cfDNA było mierzalne za pomocą spektrofotometrii dla wszystkich analizowanych próbek, wykazując medianę 6,12 ng/μL (zakres: 2,00 - 23,71 ng/μL) dla próbek surowicy i medianę 3,21 ng/μL (zakres: 2,31 - 8,49 ng/μL) dla próbek osocza. Przeanalizowaliśmy łącznie 115 próbek za pomocą eksperymentów PCR w czasie rzeczywistym.

Czułość testu została oceniona przy użyciu mieszanego DNA surowicy od pacjentów z wysokim lu...

Dyskusja

AR Analiza CN w próbce surowicy i osocza stanowi nowe, nieinwazyjne podejście do stratyfikacji pacjentów z rakiem gruczołu krokowego opornym na kastrację (CRPC). Niedawno wykazano, że AR CN jest w stanie przewidzieć wyniki u pacjentów z CRPC leczonych abirateronem i enzalutamidem, przed i po chemioterapii 7,8,9,10.

Główną zaletą naszego podejścia je...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BD Vacutainer Probówki do surowicy	Becton Dickinson	367814	probówka z krwią pełną do surowicy
BD Vacutainer EDTA Probówki	Becton Dickinson	366643	pełna probówka z krwią do osocza
Absolutny etanol	VWR		użytkownik może korzystać również z innych firm
TaqMan Test liczby kopii	Thermo Fisher Scientific	4400291	Wstępnie zaprojektowane i zwalidowane testy z barwnikiem FAM. Użyliśmy następującego testu: AR_assay1: hs04107225 i AR_assay2: hs04511283
Test liczby kopii TaqMan (zmodyfikowany)	Thermo Fisher Scientific	4467084	Wstępnie zaprojektowany test zmodyfikowany barwnikiem VIC: AGO1: Hs02320401_cn
referencyjny numeru kopii TaqMan, człowiek, RNase P	Thermo Fisher Scientific	4403326
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4326708	Mieszanka główna do PCR w czasie rzeczywistym
QIAamp DNA Mini Kit (50)	Zestaw do ekstrakcji DNA	Qiagen	51304
MicroAmp 96-dołkowe płytki	Thermo Fisher Scientific	N8010560	płytki do
spektrofotometru NanoDrop 1000	Thermo Fisher Scientific	-	użytkownik może użyć również innych metod spektrofotometrycznych do ilościowego określenia systemu
szybkiego PCR	w czasie rzeczywistym DNA 7500Applied Biosystem	-	użytkownik może korzystać również z innego instrumentu czasu rzeczywistego
CopyCaller Software	Applied Biosystem	-	oprogramowanie do analizy liczby kopii