Artykuł metodologiczny

Ulepszony protokół immunoprecypitacji chromatyny z mięśni szkieletowych myszy

DOI:

10.3791/56504

⸱

6 listopada 2017

 ,  ,  , 
1Department of Functional Genomics and Cancer, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono nowy protokół przygotowania chromatyny z mięśni szkieletowych dorosłej myszy, przystosowany do badania regulacji genów we włóknach mięśniowych przez immunoprecypitację chromatyny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy skuteczny i powtarzalny protokół przygotowania chromatyny z mięśni szkieletowych dorosłych myszy, fizycznie odpornej tkanki o wysokiej zawartości białek strukturalnych. Wypreparowane mięśnie kończyn dorosłych myszy są fizycznie zakłócane przez mechaniczną homogenizację lub kombinację mielenia i dozdzierania w hipotonicznym buforze przed utrwaleniem formaldehydu w lizacie komórkowym. Utrwalone jądra są oczyszczane przez dalsze cykle mechanicznej homogenizacji lub douncji i sekwencyjnej filtracji w celu usunięcia resztek komórkowych. Oczyszczone jądra mogą być sonikowane natychmiast lub na późniejszym etapie po zamrożeniu. Chromatyna może być skutecznie sonikowana i nadaje się do eksperymentów immunoprecypitacji chromatyny, co ilustrują profile uzyskane dla czynników transkrypcyjnych, polimerazy RNA II i kowalencyjnych modyfikacji histonów. Zdarzenia wiązania wykrywane przy użyciu chromatyny przygotowanej za pomocą tego protokołu to głównie te, które zachodzą w jądrach włókien mięśniowych pomimo obecności chromatyny z innych komórek satelitarnych i śródbłonka związanych z włóknami. Protokół ten jest zatem dostosowany do badania regulacji genów w mięśniach szkieletowych dorosłej myszy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w połączeniu z ilościową reakcją łańcuchową polimerazy (qPCR) i sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości (ChIP-seq) stały się metodami wyboru do badania transkrypcji i epigenetycznej regulacji ekspresji genów w różnych tkankach i typach komórek1. Technika ta umożliwia profilowanie całego genomu kowalencyjnych modyfikacji chromatyny, zajętości wariantu histonu i wiązania czynnika transkrypcyjnego2,3.

Podczas gdy wykonywanie ChIP z hodowanych komórek jest dobrze znane, ChIP z tkanek ssaków pozostaje bardziej trudne. Przygotowanie chromatyny do ChIP obejmuje kilka krytycznych etapów, które należy zoptymalizować dla każdej tkanki i typu komórki. Chromatyna może być wytwarzana z lizatów komórkowych hodowanych komórek lub po oczyszczeniu ich jąder. W przypadku tkanek ssaków skuteczna liza, wiązanie formaldehydu i oczyszczanie jąder mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia optymalnego odzysku chromatyny. Co więcej, wybór, czy utrwalić jądra przed, czy po ich oczyszczeniu, musi być określony doświadczalnie. Pomimo tych przeszkód, ChIP został z powodzeniem przeprowadzony z tkanek takich jak wątroba, jądra lub mózg4,5,6. W przypadku mięśni szkieletowych szczególnie trudne jest rozerwanie tak odpornej fizycznie tkanki, która wykazuje wysoką zawartość białek strukturalnych, oraz izolacja jej jąder. Biorąc pod uwagę tę specyfikę, protokoły zoptymalizowane pod kątem innych tkanek nie dają zadowalających wyników dla mięśni szkieletowych.

Tutaj opisujemy protokół izolacji chromatyny klasy ChIP z tkanki mięśni szkieletowych myszy, który obejmuje fizyczne uszkodzenie tkanki, utrwalenie formaldehydu, a następnie izolację jąder i sonikację. Skuteczność tej metody w przygotowaniu chromatyny odpowiedniej dla ChIP z tej tkanki wykazano poprzez wykonanie ChIP-qPCR i ChIP-seq dla różnych czynników transkrypcyjnych, polimerazy RNA II i kowalencyjnych modyfikacji histonów7.

Ta nowa technika jest znacznie szybsza niż poprzednio opisany protokół8 obejmujący długie etapy trawienia kolagenazy, podczas których mogą zachodzić zmiany w genomowej lokalizacji czynników transkrypcyjnych i zmiany w ekspresji genów. Szybkość, z jaką jądra są izolowane i utrwalane, sprawia, że opisana tutaj metoda jest szczególnie atrakcyjna do przygotowania chromatyny, która wierniej oddaje natywny stan zajętości genomu. Ponadto, mimo że opisano inne metody izolacji chromatyny lub ekstrakcji białek z tkanki mięśniowej8,9,10 i używane do eksperymentów ChIP-qPCR na wybranych genach, nie zgłoszono żadnych danych ChIP-seq z ich użyciem. Opisana tutaj metoda jest odpowiednia dla modyfikacji czynnika transkrypcyjnego i histonów ChIP-seq, a zatem powinna być również odpowiednia do zastosowań związanych z wychwytywaniem konformacji chromatyny 3/4C lub HiC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy były trzymane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz zgodnie z Krajowymi Wytycznymi Opieki nad Zwierzętami (dyrektywa Komisji Europejskiej 86/609/CEE; Dekret francuski nr 87-848). Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez francuską krajową komisję etyczną.

1. Izolacja tkanki mięśniowej

  1. Poświęć jedną dorosłą mysz w wieku od 6 do 8 tygodni przez zwichnięcie szyjki macicy. Wysterylizuj kończynę, płucząc ją 70% etanolem i wypreparuj mięśnie kończyn tylnych (brzuchaty łydki, piszczelowy przedni, mięsień czworogłowy) za pomocą cienkich nożyczek i kleszczy.
    UWAGA: Jedna mysz powinna dać około 500 mg tkanki.
  2. Zmielić mięśnie w probówce o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml lodowatego buforu hipotonicznego na jednorodny preparat z małych (<2 - 3 mm3) kawałków za pomocą drobnych nożyczek i pozostawić probówkę drżącą na mieszadle stołowym w temperaturze 4 °C przez 5 - 10 minut.

2. Liza tkanek

UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą 1 dla wszystkich kompozycji.

  1. Przenieść homogenat do probówki okrągłodennej o pojemności 14 ml i ponownie zamieszać w 5 ml zimnego buforu hipotonicznego (koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA i PMSF).
    1. Homogenizować rozdrobnioną tkankę mięśniową za pomocą luźnego odrzutu (20 - 30 uderzeń w ciągu 3 minut) lub mechanicznego homogenizatora tkanek przez 15 - 30 s w okrągłodennych probówkach o pojemności 14 ml.
      UWAGA: Skuteczność lizy można ocenić na tym etapie za pomocą mikroskopii świetlnej, a w razie potrzeby można wykonać dodatkowe zakłócenie.
  2. Przenieść homogenat do probówek o pojemności 15 ml i napełnić objętość do 10 ml za pomocą zimnego buforu hipotonicznego. Napraw homogenat zgodnie z poniższym opisem przed przystąpieniem do następnej myszy.

3. Fiksacja

  1. Dodaj formaldehyd do 1% końcowego stężenia i wstrząsaj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Dodaj glicynę do końcowego stężenia 0,125 M w każdej probówce, aby zatrzymać utrwalanie i wstrząsaj przez 5 - 10 minut w temperaturze pokojowej.

4. Przygotowanie jąder

UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą 1 dla wszystkich kompozycji.

  1. Utrwalony lizat homogenizować za pomocą luźnego dounce (5 - 10 uderzeń).
    1. Przenieść do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania jąder i resztek komórkowych.
  2. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w świeżym 5 ml buforze hipotonicznym. Przefiltrować lizat przez sitko o wielkości 70 μm do probówki o pojemności 50 ml. Ponownie przefiltrować filtrat przez sitko o wielkości 40 μm.
  3. Przenieść filtrat do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania osadu jądrowego.
    UWAGA: Na tym etapie jądra mogą być natychmiast poddane sonikacji lub zamrożone w postaci suchego granulatu w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C.

5. Sonikacja

  1. Ocenić objętość osadu jądrowego (około 50 μl zarówno dla homogenizacji mechanicznej, jak i z odskoku) i ponownie zawiesić go w buforze sonikacyjnym do 3 do 4 razy większej objętości upakowanego jądra i poddać sonikacji przez 10 - 15 minut w temperaturze 4 °C za pomocą sonikatora.
    UWAGA: Chromatyna może być natychmiast poddana analizie w sposób opisany poniżej (6) lub zamrożona i przechowywana w temperaturze -80 °C.

6. Ocena wielkości fragmentu chromatyny po sonikacji

UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą 1 dla wszystkich kompozycji.

  1. Aby usunąć sieciowanie, weź 30 μl chromatyny do probówki o pojemności 1,5 ml i dodaj 20 μl 5 M NaCl. Uzupełnić objętość do 500 μl i inkubować w temperaturze 65 °C przez noc.
    1. Następnego dnia należy przeprowadzić zabieg z użyciem 1 μl proteinazy K (20 mg/ml bulionu), 10 μl 2 M Tris pH 6,8 i 10 μl 0,5 M EDTA przez 1 godzinę w temperaturze 42 °C. Przeprowadzić ekstrakcję fenolowo-chloroformową/chloroformową i wytrącić DNA za pomocą 1 objętości octanu sodu (3 M) i 2 objętości 100% etanolu przez jedną godzinę w temperaturze -80 °C lub przez noc w temperaturze -20 °C.
  2. Osadzać DNA przez odwirowanie przy 13 500 x g przez 15 minut. Zdekantować supernatant i dokładnie umyć osad zimnym 70% etanolem i ponownie odwirować przez 5 minut. Zdekantować supernatant i wysuszyć osad na powietrzu.
  3. Zawiesić osad w pierwotnej objętości (30 μl) buforu TE. Zmierzyć stężenie DNA w spektrofotometrze przez absorbancję przy 260 nm/280 nm. Pobrać pipetę 500 - 1,000 ng DNA wraz z drabinką wielkości DNA na oddzielnych torach 1,5% żelu agarozowego i wykonać elektroforezę w celu oceny wielkości fragmentu chromatyny.
    UWAGA: Rozmiar fragmentu powinien wynosić od 200 do 500 par zasad i nie powinno być wykrywalnych fragmentów o dużej masie cząsteczkowej odpowiadających nie- lub słabo pofragmentowanemu DNA. W razie potrzeby, roztwór chromatyny (krok 5) może być ponownie poddany sonikacji przez dłuższy czas, a następnie ponownie analizowany zgodnie z powyższym opisem, aż do uzyskania optymalnej wielkości.

7. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP)

UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą 1 dla wszystkich kompozycji.

  1. Zablokuj kulki sefarozy białka G, podając 1 ml 50% zawiesiny w etanolu. Granulki osadzać przez odwirowanie przy 400 x g przez 1 minutę w wirówce stołowej i przemyć 1 ml wirówki buforowej TE przy 400 x g i powtórzyć mycie.
    1. Po drugim odwirowaniu zawiesić ponownie w 1 ml buforu rozcieńczającego ChIP z 25 μl BSA (zapas 20 mg/ml) i 20 μl tRNA drożdży (zapas 10 mg/ml). Zablokuj koraliki na co najmniej 2 godziny przed użyciem poprzez obrót (40 - 60 obr./min) w temperaturze 4 °C.
    2. Rozcieńczyć 50 μg chromatyny (krok 5) 8 do 10 razy za pomocą buforu rozcieńczającego ChIP. Dodać 50 μl zawiesiny z zablokowanych kulek i inkubować przez 2 godziny, obracając (40-60 obr./min) w temperaturze 4°C. Odwirować przy 400 x g w temperaturze 4 °C, aby uzyskać wstępnie oczyszczoną chromatynę i przenieść ją do świeżej probówki.
  2. W celu immunoprecypitacji dodać odpowiednią ilość przeciwciała pierwszorzędowego (np. 1-2 μg na 10 μg chromatyny) i inkubować przez noc z rotacją w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Optymalna ilość przeciwciał może być zalecana przez dostawcę lub może być określona empirycznie, wykonując ChIP-qPCR z różnymi ilościami przeciwciał, aż do zaobserwowania optymalnego wzbogacenia. Również sefaloza białka G może być zastąpiona sefalozą białka A w zależności od podtypu zastosowanego przeciwciała.
  3. Dodać zablokowane kulki następnego dnia i inkubować przez 1 godzinę z rotacją (40 - 60 obr./min) w temperaturze 4 °C. Odwirować przy 400 x g przez 20 - 30 s w celu osadzenia kulek, usunięcia supernatantu i rozpoczęcia płukania ChIP.
  4. Mycie ChIP: Wykonaj następujące płukanie: raz z buforem o niskiej zawartości soli, a następnie dwa razy z buforem o wysokiej zawartości soli, dwa razy z buforem LiCl i na koniec dwa razy z buforem TE.
    1. Każde płukanie należy wykonywać przez 10 minut z obrotem (40 - 60 obr./min) w temperaturze 4 °C i granulować kulki między każdym myciem przez odwirowanie przy 400 x g przez 20 - 30 s w wirówce stołowej.
  5. W celu elucji usunąć ostatnie płukanie i ponownie zawiesić kulki w 250 μl buforze elucyjnym (świeżo przygotowanym) na 15 minut w temperaturze pokojowej, wstrząsając.
  6. Odwirować przy 400 x g i zebrać eluat do świeżej probówki. Wykonaj ten krok dwukrotnie, a następnie rozsieciuj eluat przez noc za pomocą 20 μl NaCl 5 M i 1 μl RNazy A (10 mg / ml), potraktuj proteinazą K i ekstraktem fenolowo-chloroformowym/chloroformowym, jak w kroku 6.
  7. Ponownie zawieś w 50 μl buforu TE i użyj podwielokrotności dla ChIP-qPCR zgodnie ze standardowymi protokołami15, aby sprawdzić jakość ChIP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby wyizolować jądra, przeprowadziliśmy mechaniczną homogenizację wypreparowanej i rozdrobnionej tkanki mięśniowej przez 15 lub 45 s, przy 18 000 i 22 000 obrotów na minutę (zobacz Tabelę Materiałów). W każdych warunkach jądra można było oddzielić od szczątków tkanki, ale wydajność była optymalna przy użyciu niższej prędkości (Rysunek 1A-B). Jądra można również przygotować przez doskok przez 3 - 5 minut (Rysunek 1A,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy nowy protokół przygotowania chromatyny z mięśni szkieletowych dorosłych myszy i pokazujemy, że ta chromatyna jest odpowiednia do eksperymentów ChIP, które wykrywają wiązanie czynników transkrypcyjnych i kowalencyjne modyfikacje histonów w jądrach włókien mięśniowych. Protokół ten obejmuje kilka krytycznych kroków. Pierwszym z nich jest rozerwanie tkanki, które można wykonać albo przez odbicie, albo przez mechaniczne ścinanie. Ścinanie mechaniczne jest szybsze i bardziej powtarzalne, dlatego jest metodą z ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy całemu personelowi zakładu sekwencjonowania IGBMC o wysokiej przepustowości, członkowi konsorcjum "France Génomique" (ANR10-INBS-09-08) oraz wszystkim ogólnym służbom IGBMC, w szczególności personelowi zakładu dla zwierząt IGBMC. Prace te były wspierane przez dotacje z CNRS, INSERM, AFM, Ligue Nationale contre le Cancer, francuskiego funduszu państwowego za pośrednictwem ANR w ramach programu Investissements d'Avenir oznaczonego jako ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 oraz ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu. S.J był wspierany przez Ligue Nationale contre le Cancer i ANR-AR2GR-16-CE11-009-01, a V.U przez Ministère de l'Enseignement et de la Recherche. ID jest "équipe labellisée" Ligue Nationale contre le Cancer.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
T 25 cyfrowy ULTRA-TURRAXT 18 ULTRA-TURRAX0009022800
PMSFSIGMA-ALDRICH CHIMIE SARLP7626-25G
Koktajl inhibitorów proteazy-wolne od EDTADiagnostyka Roche11873580001
Białko G Koraliki sefarozySIGMA-ALDRICH CHIMIEP-3296
Proteinaza KSIGMA-ALDRICH CHIMIEP-2308
Sitka komórkowe 70umCorning BV431751
Sitka komórkowe 40umCorning BV352340
Formaldehyd EM klasyEuromedex15710-S
Rnaza AFischer Scientific12091039
Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy 25:24:1SIGMA-ALDRICH CHIMIEP3803
BSASIGMA-ALDRICH CHIMIEB4287-25G
drożdże tRNASIGMA-ALDRICH CHIMIER5636
Błękit glikogenowyAMIBIONAM9516
Przeciwciało Pol II ChIPSanta CruzSC-9001
H3K27ac ChIPAktywny motyw39133
Tead4 Przeciwciało ChIPAviva Systems Biology(ARP38276_P050)
IGEPALSIGMA-ALDRICH CHIMIEI-3021
E220 Focused UltrasonicCovaris E220
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dodatkowe przedmioty
Nożyczki
Loose Dounce
15 ml i 50 ml Probówki
14 ml Probówki
1,5 ml i 2 ml Probówki
70 μ m oraz 40 μ m sitka komórkowe (Corning)
Sokółz okrągłym dnemEppendorf

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  2. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
  3. Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
  4. Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613(2014).
  5. Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530(2010).
  6. Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
  7. Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600(2017).
  8. Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Myogenesis: Methods and protocols. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).
  9. Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513(2012).
  10. Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
  11. Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
  12. Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  13. Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
  14. Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
  15. Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przygotowanie chromatynyhomogenizacja mechanicznafiksacja formaldehydemoczyszczanie j der kom rkowychprotok sonikacjiekstrakcja DNAsekwencjonowanie ChIPwi zanie czynnik w transkrypcyjnych

Powiązane artykuły