Artykuł metodologiczny

Skuteczna i prosta metoda tworzenia linii komórkowych NK i T od pacjentów z przewlekłym aktywnym zakażeniem wirusem Epsteina-Barr

DOI:

10.3791/56515

⸱

30 marca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, 2MOE Key Laboratory of Major Diseases in Children, National Key Discipline of Pediatrics, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infection Diseases, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, 3State Key Laboratory of Molecular Developmental Biology, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prosta metoda pozyskiwania klonów komórek NK i T od pacjentów z CAEBV została opracowana z wysoką wydajnością, niewielką ilością krwi obwodowej i niską dawką IL-2.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano wiele metod tworzenia linii komórkowych NK/T od pacjentów z chłoniakiem lub zespołem limfoproliferacyjnym. Metody te wykorzystywały komórki karmicielskie, oczyszczone limfocyty NK lub T z aż 10 ml krwi lub wysoką dawką IL-2. Badanie to przedstawia nową metodę z potężną i prostą strategią tworzenia linii komórek NK i T poprzez hodowlę komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z dodatkiem rekombinowanej ludzkiej IL-2 (rhIL-2) i wykorzystuje zaledwie 2 ml krwi pełnej. Komórki mogą szybko się namnażać w ciągu dwóch tygodni i utrzymywać się przez ponad 3 miesiące. Dzięki tej metodzie ustalono 7 linii komórek NK lub T o wysokim wskaźniku sukcesu. Ta metoda jest prosta, niezawodna i ma zastosowanie do ustanawiania linii komórkowych z większej liczby przypadków chłoniaka z komórek CAEBV lub NK/T.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirus Epsteina-Barr (EBV) jest wszechobecny i infekuje nie tylko limfocyty B, ale także komórki T i NK (NK), co powoduje szereg chorób limfoproliferacyjnych NK/T związanych z EBV (LPD) i chłoniaków/białaczek, takich jak limfohistiocytoza hemofagocytarna związana z EBV, chłoniak podobny do hydroa vacciniforme, pozawęzłowy chłoniak z komórek NK/T, typ nosa i agresywna białaczka z komórek NK1,2,3. Wśród nich znajduje się ciężka przewlekła aktywna choroba EBV (SCAEBV), która występuje głównie w Azji Wschodniej, a która jest obecnie uważana za LPD spowodowaną klonalną ekspansją komórek T lub NK zakażonych EBV4,5,6,7, ale bez widocznego niedoboru odporności obecnego w objawach podobnych do mononukleozy zakaźnej (IM), takich jak gorączka, hepatosplenomegalia, powiększenie węzłów chłonnych i wątroba dysfunkcja utrzymująca się lub nawracająca, a także wysoki ładunek EBV-DNA we krwi obwodowej 8,9. Pacjenci z CAEBV mają złe rokowanie10,11, a jego patogeneza i rola EBV są niejasne. Dlatego linie komórkowe pochodzące z chorób limfoproliferacyjnych NK / T związanych z EBV i chłoniaków są bardzo pomocne jako modele komórkowe do wyjaśnienia mechanizmu indukowanej przez EBV proliferacji komórek NK lub T i jej związku z wysoką częstością występowania białaczki lub chłoniaka.

Do tej pory utworzono kilka linii komórkowych za pomocą różnych technik12,13,14,15,16. Ludzka linia komórkowa NK, NK-YS, została utworzona z chłoniaka/białaczki z komórek NK, poprzez współhodowlę z mysią linią komórek zrębowych jako karmicielem i w obecności rhIL-2 w stężeniu 20U na ml15. KAI3 był kolejną linią komórkową NK utworzoną od pacjentów z ciężką alergią na komary lub SCAEBV z autologiczną limfoblastoidalną linią komórkową (LCL), komórkami B przekształconymi przez EBV, jako komórki zasilające i addycją rhIL-2 w 100U/mL16. SNK6 i SNT8 uzyskano z tkanek nowotworowych pacjentów z chłoniakiem z komórek NK / T nosa przez dodanie wysokiej dawki rhIL-2 (700U / mL) 12. Przy podobnej technice komórka SNK-1 pochodziła od pacjentów z CAEBV, wyhodowanych z PBMC poprzez usunięcie limfocytów T i dodanie 700U / ml rhIL-213,17. SNT13 i SNT15 zostały ustanowione przez usunięcie komórek CD4+ i CD8+18. Do tej pory inne linie komórek T i NK od pacjentów z EBV-NK/T LPD zostały opracowane tą metodą19.

Wady istniejących metod wymienionych powyżej obejmują zastosowanie komórek zasilających, wymóg wysokiej dawki IL-2, wykorzystanie aż 10 ml krwi pełnej, lub oczyszczanie komórek NK/T, co jest bardzo trudne w klinice ze względu na konieczność sprawdzenia, które typy komórek, które EBV infekuje utajenie, przed rozpoczęciem hodowli. Ponieważ CAEBV występuje głównie u dzieci w Azji, 10 ml krwi nie jest łatwe do zdobycia we wszystkich regionach. W tym badaniu opracowaliśmy nową, prostą metodę o wysokim wskaźniku sukcesu do tworzenia linii komórek NK i / lub T poprzez hodowlę PBMC od pacjentów z CAEBV przy użyciu niskiej dawki rhIL2 i objętości 2 ml krwi pełnej bez komórek żywiących. Wyniki tej metody dowiodły jej wysokiej skuteczności i oszczędności czasu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Instytutu Genetyki i Biologii Rozwojowej Chińskiej Akademii Nauk, a protokół jest zgodny z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi dobra człowieka.

UWAGA: Zobacz Rysunek 1 dla schematu przepływu pracy.

1. Izolacja PBMC od pacjentów z CAEBV

  1. Oczyścić pierwotny PBMC z 2 ml krwi pełnej pacjentów z CAEBV przez wirowanie gradientowe (np. Ficoll-blaque) zgodnie z instrukcjami producenta. Alternatywnie rozmrozić kriokonserwowany PBMC z ciekłego azotu za pomocą pożywki RPMI 1640.
  2. Dodaj 2 μl błękitu trypanowego (0,4%) do 18 μl zawiesiny komórek, odczekaj 3 minuty, aby wybarwić komórki, przenieś zawiesinę na płytkę licznika komórek i zmierz stężenie i żywotność komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.
  3. Przygotować zawiesinę komórkową o gęstości 2-3×106 komórek/ml uzupełnioną kompletną pożywką hodowlaną RPMI 1640 zawierającą 20% surowicy ludzkiej (inaktywowanej termicznie w temperaturze 56 °C), 2 mM L-glutaminy i antybiotyki (100 μg/ml streptomycyny, 100 U/ml penicyliny). Nasiona 1 ml zawiesiny PBMC na dołek do 24-dołkowych płytek do hodowli komórkowych.
  4. Dodaj 150 U rhIL-2 na studzienkę.
  5. Umieścić płytki hodowlane w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  6. W drugim dniu obserwuj morfologię komórek pod mikroskopem (200-krotne powiększenie); komórki są w dobrym stanie, gdy są jasne i okrągłe.

2. Rozszerzanie komórek i numerowanie komórek zdolnych do życia

  1. Obserwuj morfologię komórek pod mikroskopem (powiększenie 200x) i monitoruj stan wzrostu komórek, numerując komórki przed zmianą pożywki: dodaj 2 μl błękitu trypanowego (0,4%) do 18 μl zawiesiny komórek i oblicz stężenie komórek (patrz 1.2, Rysunek 2).
  2. Wyrzucić 500 μl pożywki do 24-dołkowej płytki i dodać 500 μl świeżej, kompletnej pożywki hodowlanej. Dodaj 150U rhIL-2 na studzienkę.
  3. Zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu, jak w kroku 2.2.
  4. Narysuj krzywą wzrostu komórki (Rysunek 3).
  5. Gdy stężenie żywych komórek przekroczy 5×106 / ml, podziel komórki do nowych studzienek w stężeniu 1-2×106 komórek/ml w każdym dołku. Ten proces trwa 2-4 tygodnie.

3. Fenotypowanie komórek za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Gdy komórki się rozwiną, zbierz 1×106 komórek, aby określić fenotypy linii komórkowych. Odwirować komórki przy 240 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (komórki NK/T wytrącą się na dnie probówki).
  2. Odrzucić sklarowany osad, przepłukać osad, dodając 7 ml PBS. Wirować przez 5 minut przy 240 x g w temperaturze pokojowej. Powtórz raz.
  3. Dodać 200 μl ludzkiej surowicy do każdej probówki, dobrze wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Odwirować komórki przy 240 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w temperaturze 1×106/ml z zimnym PBSA (PBS + 0,2% BSA). Podziel komórki na 5 probówek, z których każda zawiera 2×105 komórek.
  5. Odwirować komórki przy 240 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą buforu PBSA lub PBSA zawierającego 10 μl PE (lub PE-Cy7) i 10 μl przeciwciał znakowanych FITC przeciwko receptorom komórek barwiących komórek T lub NK na lodzie, jak wskazuje Rysunek 4. Komórki zawieszone za pomocą buforu PBSA stosuje się jako kontrolę ujemną.
  6. Inkubuj komórki z przeciwciałami przez 20-30 minut na lodzie w ciemności.
  7. Umyj ogniwa dwukrotnie zimnym PBSA, ponownie zawieś ogniwa za pomocą 300 μl zimnego PBSA.
  8. Przeanalizuj fenotyp komórki za pomocą cytometru przepływowego.
    1. Ustaw cytometr przepływowy w stanie "Utwórz arkusz roboczy". Skonfiguruj szablon eksperymentalny z wykresem kropkowym, który wyświetla rozproszenie do przodu (FSC) i punktowe do przodu (SSC).
    2. Załaduj rurkę kontrolną izotypu, aby zoptymalizować napięcia FSC i SSC oraz zoptymalizować wartość progową FSC, aby wyeliminować zanieczyszczenia bez zakłócania populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania. Usuń wszystkie parametry z wyjątkiem FSC, SSC, FITC, PE i PE-Cy7.
    3. Przeprowadzić kompensację przy użyciu kontroli izotypu i pojedynczej kontroli pozytywnej w każdej grupie analizy 2-kolorowej.
    4. Załaduj próbki i utwórz wykresy punktowe HLA-DR VS CD19, CD4 VS CD8, CD56 VS CD16 i CD3 VS CD16 przedstawiające różne populacje komórek.
      UWAGA: PBMC użyto do przeprowadzenia kompensacji przy użyciu kontroli ujemnej/izotypu i pojedynczej kontroli dodatniej. 2-kolorowa immunofluorescencja z cytometrem przepływowym była rutynowo stosowana do analizy ekspresji markerów powierzchniowych. Uwzględniono następujące przeciwciała: anty-HLA-DR, anty-CD4, anty-CD16 sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC), anty-CD8, anty-CD56, CD3 sprzężone z fikoerytryną (PE) i anty-CD19 sprzężone z PE-Cy7.

4. Ekspansja i kriokonserwacja komórek NK/T

  1. Zmień pożywkę po zakończeniu analizy fenotypu komórki. Ostrożnie usunąć połowę supernatantu i unikać dotykania komórek znajdujących się na dnie płytki. Dodać taką samą objętość świeżej pożywki hodowlanej zawierającej 300 j./ml rhIL-2 do płytek komórkowych.
  2. Zmieniaj połowę pożywki co 3 dni (jak w 2.2), aż skupiska komórek będą wyraźnie widoczne pod mikroskopem (Rysunek 2). Zazwyczaj proces ten trwa 2-3 tygodnie.
  3. Przenieść komórki z płytek 24-dołkowych do kolb hodowlanych T25 po zmieszaniu różnych studzienek z tej samej linii. Podwój objętość pożywki hodowlanej, gdy zmieni kolor na żółty, aż objętość pożywki rozszerzy się do 10-15 ml. Dodać rhIL-2 o stężeniu 150 U/ml.
  4. Zmień pożywkę 24 godziny przed zamrożeniem po 2-3 tygodniach wzrostu, kiedy masę komórkową można zaobserwować gołym okiem. Zmierz stężenie komórek za pomocą licznika komórek.
  5. Odwirować zawiesinę komórkową przez 5 minut przy 240 x g i ponownie zawiesić osad komórkowy o gęstości 5-10 x 106 komórek/ml z zamrożonym roztworem podstawowym, który zawiera 90% płodowej surowicy bydlęcej i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO). Zamrażać w tempie od 1 °C na minutę do -80 °C, a następnie przenieść bezpośrednio do ciekłego azotu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po 3 dniach hodowli podczas tworzenia linii komórkowych, zaczynają pojawiać się komórki polimorficzne (Rysunek 2). Po 7 dniach komórki rosną szybko, ponieważ zarówno liczba, jak i żywotność komórek wzrastają w szybkim tempie (Rysunek 3). Małe skupiska komórek są wyraźnie widoczne po 10-14 dniach wzrostu, kiedy stężenie komórek może przekraczać 3-6 × 106. W tym okresie komórki należy rozmnożyć przez podział na dwie lub trzy studzienki płyt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ramach tego protokołu opracowano nowatorską technikę tworzenia linii komórkowych NK/T z krwi pełnej pacjentów z CAEBV. W porównaniu z istniejącymi metodami, główną zaletą tej metody jest jej prostota i wymaganie jedynie niewielkiej objętości krwi, przy jednoczesnym wykazywaniu wysokiego wskaźnika powodzenia i dobrych warunków żywotności komórek. Co więcej, linie komórkowe NK / T można ustalić poprzez hodowlę PBMC bez wcześniejszego określania typów komórek, które EBV zainfekował utajony, ponieważ oznaczanie zużywałoby ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.Z., X.Z. i X.C. są współwynalazcami oczekujących wniosków patentowych obejmujących potencjalne zastosowania tej metody do ustanawiania linii komórkowych NK / T oraz linii komórkowych ustalonych w tym badaniu. D.Z., X.Z. i X.C. deklarują, że nie mają sprzecznych interesów finansowych w tej pracy. Pozostali autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Kluczowe Projekty Chińskiej Akademii Nauk (KFZD-SW-205), System Wsparcia Technologii Strategicznych Zasobów Biologicznych Chińskiej Akademii Nauk (CZBZX-1 i ZSSB-004) oraz przez Granty z Narodowej Fundacji Nauki Chin (81401640) i Szanghajskiego Funduszu Nauk Przyrodniczych (14ZR1434800).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało Hu HLA-DR FITCBDdla FACS
Hu CD4 Przeciwciało FITCBD555346dla FACS
Przeciwciało Hu/NHP CD8 PEBD557086dla FACS
Hu CD3 PEBD555340dla FACS
Hu CD16 FITC 3G8BD555406przeciwciało dla FACS
Hu/NHP CD56 PE MY31BDPrzeciwciało 556647do FACS
hu/CD19 PE-Cy7Przeciwciało 560728 BDdla
FACS ludzkiej IL-2Roche11147528001
ludzkiej surowicyMRCCCC118-125
Inkubator CO2SANYO
TechcompCT6TMikroskop wirówkowy
OLYMPUS CKX53CKX53
Automatyczny licznik komórekCountstarIC 1000Do liczenia komórek
24-dołkowy klaster kultur komórkowychCorning Incorporated3524Płytki polistyrenowe
25cm2 kolba do hodowli komórkowychNest707001Polistyren
FBSGibco10270Składnik pożywki komórkowej
RPMI Medium 1640żywotność22400089Do podłoża komórkowego
L-GlutaminaAmresco374Składnik pożywki komórkowej
100 x streptomycyna roztwór penicyliny BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309Składnik pożywki komórkowej
Ficoll paque plusGE Healthcare17-1440-03Do izolacji in vitro limfocytów
DMSOSigmaD2650Do zamrażania komórek
cytometr przepływowyBDBD FACSAria II
oprogramowanieBDBD FACSDiva oprogramowanieFACS analiza
560944 oprogramowanie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
  2. Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
  3. Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
  4. Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
  5. Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency? Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
  6. Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
  7. Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
  8. Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
  9. Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
  10. Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
  11. Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
  12. Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
  13. Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
  14. Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
  15. Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
  16. Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
  17. Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
  18. Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
  19. Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326(2011).
  20. Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
  21. Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
  22. Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
  23. Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Linie kom rek NK Tprzewlek a aktywna infekcja EBVmononuklearne kom rki krwi obwodowejrekombinowana ludzka IL 2analiza cytometrycznawirowanie gradientowehodowla kom rkowaokre lanie fenotypumonitorowanie proliferacji kom rektechnika kriokonserwacji

Powiązane artykuły