Protokół decelularyzacji ślimaków myszy w inżynierii tkankowej ucha wewnętrznego

Summary

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie skutecznej metody decelularyzacji i odkamieniania ślimaków myszy w celu wykorzystania ich jako rusztowań do zastosowań inżynierii tkankowej.

Abstract

U ssaków, mechanosensoryczne komórki rzęsate, które ułatwiają słyszenie, nie mają zdolności do regeneracji, co utrudnia leczenie utraty słuchu. Obecne strategie medycyny regeneracyjnej koncentrują się na przeszczepianiu komórek macierzystych lub manipulacji genetycznej otaczających komórek podporowych w uchu wewnętrznym, aby zachęcić do wymiany uszkodzonych komórek macierzystych w celu skorygowania ubytku słuchu. Jednak macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) może odgrywać istotną rolę w indukowaniu i utrzymywaniu funkcji komórek rzęsatych i nie została dobrze zbadana. Wykorzystanie ECM ślimaka jako rusztowania do hodowli dorosłych komórek macierzystych może dostarczyć unikalnych informacji na temat tego, w jaki sposób skład i architektura środowiska zewnątrzkomórkowego pomaga komórkom w utrzymaniu funkcji słuchu. W tym miejscu przedstawiamy metodę izolacji i decelularyzacji ślimaków od myszy w celu wykorzystania ich jako rusztowań przyjmujących perfundowane dorosłe komórki macierzyste. W obecnym protokole ślimaki są izolowane od myszy poddanych eutanazji, decellularizowane i odkamieniane. Następnie ludzkie komórki galaretowate Whartona (hWJC), które zostały wyizolowane z pępowiny, zostały ostrożnie perfundowane do każdego ślimaka. Ślimaki wykorzystano jako bioreaktory, a komórki hodowano przez 30 dni przed poddaniem ich przetwarzaniu do analizy. Ślimaki pozbawione komórek zachowały możliwe do zidentyfikowania struktury zewnątrzkomórkowe, ale nie ujawniły obecności komórek ani zauważalnych fragmentów DNA. Komórki przenikające do ślimaka zaatakowały większość wnętrza i zewnątrz ślimaka i rosły bez incydentów przez okres 30 dni. W związku z tym obecna metoda może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób ECM ślimaka wpływa na rozwój i zachowanie komórek.

Introduction

Ślimak to skomplikowana spiralna struktura znajdująca się w kości skroniowej. Składa się z zewnętrznego błędnika kostnego i koncentrycznego, wewnętrznego błoniastego labiryntu¹. Błędnik błoniasty składa się z trzech płynnych przestrzeni: Scala vestibuli, Scala media i Scala tympani¹. W pożywce scala znajduje się nabłonek czuciowy, który składa się z wielu typów komórek, ale szczególnie interesujące są czuciowe komórki rzęsate (HC), które przekształcają energię mechaniczną w falach dźwiękowych na impulsy nerwowe². Narażenie na uraz akustyczny^3,4,5, medicine⁶, disease^7,8, and aging⁹ może prowadzić do upośledzenia funkcji słuchowych poprzez śmierć HC. Utrata komórek włosa u ssaków jest trwała, w przeciwieństwie do ptasich HC, które mogą się regenerować po urazie¹⁰.

Różnorodne współczesne wysiłki badawcze miały na celu przywrócenie utraconych HC, chociaż konkretne podejścia eksperymentalne różnią się między sobą. Manipulacja ekspresją genów w nabłonku czuciowym i implantacja komórek macierzystych różnicujących się poza organizmem są dominującymi podejściami w tej dziedzinie, chociaż próbowano metod indukcji, które mają na celu różnicowanie komórek macierzystych w organoidy ślimakowe^11,12,13. Każde z tych podejść jest albo bezpośrednio zależne od komórek macierzystych, albo od sygnałów rozwojowych wykorzystywanych przez komórki macierzyste; jednak drugim wspólnym i potencjalnie krytycznym elementem jest ECM samego ślimaka^14,15.

ECM nie tylko zapewnia fizyczne wsparcie dla komórek i tkanek, które obejmuje powierzchnię do adhezji, proliferacji, przeżycia i migracji komórek, ale także odgrywa kluczową rolę w rozwoju HCs i spiralnego zwoju^15,16,17. Naturalnie występujący ECM dostarcza sygnałów indukcyjnych, które mogą kierować określaniem fenotypu komórki i/lub adhezją, proliferacją i przeżyciem komórki¹⁸. W związku z tym zastosowanie ślimaka bez komórek w połączeniu z hodowanymi hWJC stanowi wyjątkową okazję do zbadania roli ECM i regeneracji HC. HWJC to łatwo dostępny, niekontrowersyjny typ komórek wyizolowany z ludzkiej pępowiny, który zachowuje się jak mezenchymalne komórki macierzyste¹⁹. HWJC wykazały zdolność do różnicowania linii komórek neurosensorycznych^20,21. W związku z tym obecny protokół szczegółowo opisuje izolację, decelularyzację i perfuzję ślimaków z tusz myszy C57BL za pomocą hWJC do inżynierii tkankowej ucha wewnętrznego.

Protocol

Wszystkie procedury, w tym eutanazja zwierząt, zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (ACUP #2014-2234) w Centrum Medycznym Uniwersytetu Kansas (KUMC).

UWAGA: HWJC zostały wyizolowane z ludzkiej pępowiny, która została oddana przez pacjentów, którzy wyrazili świadomą zgodę, a próbki zostały użyte zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Badań Ludzkich Uniwersytetu Kansas (KU-IRB #15402).

1. Skroniowe pobieranie kości i izolacja ślimaka

1. Odetnij głowę odpowiednio uśpionej, 15-tygodniowej myszy, przecinając między czaszką a pierwszym kręgiem szyjnym ostrymi nożyczkami chirurgicznymi, a następnie spryskaj głowę 70% etanolem w celu dezynfekcji (Ryc. 1A).
2. Przeciąć czaszkę na pół w płaszczyźnie środkowej strzałkowej za pomocą tej samej ostrej pary nożyczek chirurgicznych (Rysunek 1B-C, linie przerywane).
3. Usuń tkankę mózgową z czaszki za pomocą kleszczy (Rysunek 1D, grot strzałki).
4. Zidentyfikuj kość skroniową poprzez obecność korzeni nerwu słuchowego i przedsionkowego (Ryc. 1E-F, groty strzałek) po wewnętrznej stronie czaszki i przewodu słuchowego od zewnątrz (Rysunek 1F, strzałka). Ostrożnie przeciąć czaszkę, aby odizolować kość skroniową od reszty czaszki (Rysunek 1G).
   UWAGA: W niektórych przypadkach możliwe jest delikatne podważenie otaczających kości czaszki od kości skroniowej bez konieczności cięcia.
5. Włóż cienkie kleszcze do otworu przewodu słuchowego na około 5 mm (Rysunek 1H), aby końcówki nie groziły przebiciem ślimaka. Delikatnie rozbij kość bulli (Rysunek 1H, górny zacieniony czerwony obszar), aby się złamała (Rysunek 1I, czerwona przerywana linia).
   UWAGA: W razie potrzeby mikroskop preparacyjny może pomóc w tym procesie, aby zapewnić dokładne umieszczenie i manipulację narzędziami.
6. Za pomocą cienkich kleszczy podważ pozostałą część pęcherza od kości skroniowej, odsłaniając kostny błędnik ślimaka (Rysunek 1J, czerwone nawiasy).
7. Umieść szalkę Petriego wystarczająco dużą, aby pomieścić kość skroniową (np. 30 mm lub więcej) pod polem widzenia lunety sekcyjnej i wypełnij ją wystarczającą ilością soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby pokryć kość skroniową (np. 0,5 do 1 ml).
8. Zanurz kość skroniową z usuniętym pęcherzem w PBS z owalnymi i okrągłymi oknami ślimaka skierowanymi do góry.
   UWAGA: Usunięcie układu przedsionkowego ze ślimaka nie jest konieczne, ponieważ układ przedsionkowy służy dobrze jako uchwyt do manipulowania i orientowania cech ślimaka (Rysunek 1I i Rysunek 2B).
9. Za pomocą bardzo cienkiej pary kleszczy usuń tętnicę strzemiączkową, która przechodzi przez strzemiączko.
10. Włóż jedną końcówkę ultracienkich kleszczyków przez łuk strzemiączka, przez który przechodzi tętnica, i delikatnie unieś strzemiączko do góry. Zdeformowane strzemiączko powinno unieść się z owalnego okna.
11. Za pomocą jednej końcówki ultracienkich kleszczyków przebij owalne i okrągłe okna.
12. Używając strzykawki 1x wypełnionej PBS o rozmiarze 28,5 z dołączoną rurką (średnica wewnętrzna 0,28 mm, średnica zewnętrzna 0,61 mm), umieść rurkę nad owalnym okienkiem (Rysunek 2A - B).
    UWAGA: Otworem rurki można manipulować za pomocą bardzo cienkich kleszczy, co pomaga zapewnić dokładne umieszczenie.
    1. Do każdego ślimaka należy użyć świeżej strzykawki i rurki.
13. Przez ślimak przez 5 minut należy wprowadzić 2 ml 10% antybiotyku przeciwgrzybiczego (anty-anty) i 10% penicyliny-streptomycyny (wstrzykiwacz-paciorkowca) w PBS w celu usunięcia perylimfy. Zbyt szybkie perfuzja ze zbyt dużym naciskiem spowoduje uszkodzenie drobnych struktur w ślimaku.
    UWAGA: Ręczne napędzanie strzykawki w celu przepuszczenia płynu przez ślimak jest skuteczne, chociaż alternatywą może być użycie pompy perfuzyjnej.
    1. W przypadku ręcznego perfuzji użyj pary cienkich, samozamykających się kleszczy, aby ustabilizować ślimak (Ryc. 2A) podczas perfuzji, chwytając przedsionkową część kości skroniowej.
       UWAGA: Chociaż nie jest to wymagane, pozostawia to obie ręce wolne do obsługi instrumentów; jedną ręką można kierować strzykawką (Rysunek 2A), podczas gdy drugą można odpowiednio ustawić rurkę (Rysunek 2B).
    2. Począwszy od tego etapu, należy uważać, aby nie wystawiać ślimaka niepotrzebnie na działanie powietrza. Wprowadzenie pęcherzyków powietrza do przestrzeni płynów zablokuje krążenie płynów, a dalsze wysychanie uszkodzi drobne struktury w ślimaku.
14. Usuń i wyrzuć pozostałą tkankę mięśniową i fragmenty kości za pomocą cienkich kleszczy.
15. W razie potrzeby izolowane ślimaki należy przechowywać w temperaturze 4 °C w 10% roztworze antyanty-anty-anty i 10% roztworze pen-strep w PBS przez okres do siedmiu dni, z regularną wymianą roztworu antybiotyku co 48 godzin.

2. Przetwarzanie ślimakowe

1. Decelularyzacja
   1. Dla każdego ślimaka napełnij szklaną fiolkę scyntylacyjną o pojemności 20 ml 1% roztworem dodecylosiarczanu sodu (SDS) w wodzie dejonizowanej (DI), która służy do decelularyzacji ślimaka.
   2. Odetnij końcówkę plastikowej pipety transferowej o pojemności 7 ml za pomocą żyletki, tak aby otwór był wystarczająco duży, aby mógł przejść przez niego ślimak.
   3. Za pomocą pipety transferowej delikatnie wciągnij ślimak do pipety tak, aby przechodził przez krawędź odcięcia na kilka milimetrów.
   4. Wydalić ślimak do fiolki scyntylacyjnej wypełnionej 1% roztworem SDS.
   5. Wprowadzić 2 ml 1% SDS w wodzie dejonizowanej (DI) przez ślimak w fiolce scyntylacyjnej za pomocą pipety transferowej.
   6. Umieścić fiolkę scyntylacyjną w rotatorze i pozwolić fiolce scyntylacyjnej obracać się z prędkością 10 obr./min przez 72 godziny w temperaturze pokojowej.
      1. Zmieniaj 1% roztwór SDS co 24 godziny przez okres 72 godzin. Podczas wymiany karty charakterystyki należy zachować ostrożność, aby nigdy nie wystawiać ślimaka na działanie powietrza.
   7. Umyj ślimak trzy razy po 30 minut wodą DI. Wykonaj płukanie w tej samej fiolce scyntylacyjnej, która jest używana do ładunków SDS; Na tym etapie ślimak jest pozbawiony komórek komórkowych.
2. Odwapnienie
   1. Usuń pozostałą wodę demineralizowaną z fiolki scyntylacyjnej, pozostawiając tylko tyle, aby ślimak był zanurzony.
   2. Aby rozpocząć odwapnianie, dodaj 5 ml 10% kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,02 M) w wodzie demineralizowanej do fiolki scyntylacyjnej zawierającej ślimak.
   3. Wprowadzić 2 ml 10% EDTA w wodzie demineralizowanej przez ślimak w fiolce scyntylacyjnej za pomocą pipety transferowej.
   4. Umieścić fiolkę scyntylacyjną z powrotem w rotatorze i pozwolić fiolce scyntylacyjnej obracać się z prędkością 10 obr./min przez 72 godziny w temperaturze pokojowej. Zmieniaj 10% roztwór EDTA co 24 godziny przez okres 72 godzin. Podczas wymiany roztworów należy zachować ostrożność, aby ślimak nie był narażony na działanie powietrza.
   5. Przepłukać ślimak 3 razy po 2 godziny za pomocą 1x PBS; na tym etapie ślimak jest odwapniony.
3. składowanie
   1. Ślimaki należy przechowywać do 72 godzin w 10% roztworze anty-anti-anti, 10% pen-strep w PBS w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Dłuższe okresy przechowywania mogą być możliwe przy regularnych zmianach roztworu antybiotyku; Przedłużone przechowywanie przetworzonych ślimaków nie zostało jednak zatwierdzone w niniejszym protokole.

3. Zaopatrzenie i rozbudowa hWJC

1. Izoluj hWJC zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami²². Krótko mówiąc, podziel pępowinę na 3-centymetrowe odcinki.
2. Ostrożnie wykonaj płytkie nacięcie skalpelem wzdłuż każdego segmentu pępowiny, aby rozwinąć i odsłonić galaretkę Whartona pępowiny. Użyj kleszczy, aby usunąć naczynia krwionośne.
3. Przemyć segmenty pępowiny dwukrotnie wystarczającą ilością PBS (np. 40 ml na szalce Petriego o średnicy 60 mm), aby zanurzyć tkankę. Drobno zmielić segmenty tkanki skalpelem. Trawić tkankę na 100 mm szalce Petriego z 50 ml pożywki trawiącej (0,2% kolagenazy typu 2, 1% penicyliny-streptomycyny, w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Eagle's Medium (DMEM) o niskiej zawartości glukozy).
4. Umieścić tkankę w pożywce trawiącej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 50 obr./min przez noc w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ i temperaturze 37 °C. Następnego dnia rozcieńczyć pożywkę wytrawiającą w stosunku 1:16 w 2% antybiotyko-przeciwgrzybiczym w PBS, a komórki osadu przez odwirowanie w 500 x g w temperaturze pokojowej (~ 27 °C) przez 10 minut. Wyrzucić supernatant.
5. Zawiesić osady w mezenchymalnym podłożu do wzrostu komórek macierzystych (MSCGM) i ponownie połączyć komórki. Komórki płytki o gęstości 7 x 10³ komórki/^cm2 w kolbach T-75 poddanych hodowli tkankowej. Kultura HWJC w MSCGM i rozwinięcie do przejścia 5 dla eksperymentów.
   UWAGA: HWJC mogą być hodowane do większych kolb T (np. T-150, T-300) podczas pasażowania w celu zwiększenia wydajności hWJC do eksperymentów.

4. Wlew hWJC do ślimaków decellularyzowanych

1. Przygotuj ślimaki bez komórek
   1. Stosując technikę aseptyczną, umyj przechowywane ślimaki w 1x PBS trzy razy przez 30 minut każdy.
   2. Przenieść ślimaki do oddzielnych studzienek na 24-dołkowej płytce i dodać 1 ml wstępnie ogrzanego MSCGM o temperaturze 37 °C.
   3. Ślimaki należy inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych o stężeniu 5%_CO2 w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przed infuzją komórek.
2. Odłączanie hWJC i ponowne zawieszanie
   1. Umyj hWJC w 37 °C wstępnie podgrzanym 1x PBS dwukrotnie.
   2. Dodaj tyle wstępnie podgrzanej trypsyny o temperaturze 37 °C z 0,5% EDTA, aby pokryć powierzchnię naczynia komórkowego.
   3. Inkubować hWJC przez maksymalnie 5 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych o stężeniu 5% CO₂ i temperaturze 37 °C.
      1. Sprawdź, czy 90% komórek oderwało się od powierzchni hodowli komórkowej, oglądając komórki pod odwróconym mikroskopem.
         UWAGA: Komórki, które poruszają się, gdy naczynie hodowlane jest delikatnie stukane, odłączyły się. Ogniwa, które pozostają nieruchome, nie odłączyły się.
      2. Delikatnie postukać w boki kolby, aby jeszcze bardziej usunąć przyczepione komórki.
   4. Stosując technikę aseptyczną, przenieś hWJC z naczynia hodowlanego do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej objętość równoważną objętości MSCGM objętości trypsyny używanej do dysocjacji komórek.
   5. Osadzać hWJC przez odwirowanie przy 500 x g w temperaturze pokojowej (~ 27 °C) przez 5 minut.
   6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić hWJC w MSCGM w stężeniu 500 000 komórek/ml.
3. Perfuzja ślimaków
   1. Przenieść ślimak na nową 24-dołkową płytkę za pomocą pipety transferowej.
   2. Dodaj kroplę MSCGM do każdego ślimaka, aby zapobiec wysychaniu ślimaka.
   3. Delikatnie ustaw ślimak za pomocą bardzo cienkich kleszczyków tak, aby owalne i okrągłe okienka były skierowane do góry.
      UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność podczas bezpośredniego kontaktu z każdym ślimakiem, ponieważ ślimak łatwo ulega uszkodzeniu.
   4. Za pomocą sterylnej strzykawki insulinowej o rozmiarze 28,5 z podłączonym wężem pobrać 0,2 ml ponownie zawieszonych hWJC (100 000 komórek).
   5. Za pomocą wysterylizowanych cienkich kleszczy umieść rurkę nad owalnym okienkiem.
   6. Delikatnie i powoli perfundować ślimak 0,2 ml ponownie zawieszonych hWJC za pomocą strzykawki insulinowej o rozmiarze 28,5 podłączonej do rurki polietylenowej (średnica zewnętrzna: 0,61 mm, średnica wewnętrzna: 0,28 mm) przez około 5 minut.
   7. Po perfuzji dodać 0,8 ml wstępnie podgrzanego MSCGM o temperaturze 37 °C do studzienki zawierającej ślimak, aby zwiększyć całkowitą objętość w studzience do 1 ml.
   8. Powtórzyć kroki 4.3.3-4.3.7 dla każdego ślimaka, za każdym razem używając nowej strzykawki i rurki.
   9. Umieść perfundowane ślimaki w inkubatorze do hodowli komórkowych o stężeniu 5% CO₂ w temperaturze 37 °C i zmieniaj pożywkę trzy razy w tygodniu.

5. Zbiór i konserwacja ślimaka

UWAGA: Ślimaki mogą być hodowane i zbierane w dowolnym momencie do 30 dni po perfuzji.

1. Aby zachować ślimaki, utrwal 4% paraformaldehydu w 1x PBS przez noc w temperaturze 4 °C na bujanej platformie.
2. Po utrwaleniu umyj ślimaki 1x PBS trzy razy po 5 minut każdy.
3. Stopniowo odwadniać ślimak etanolem i klarować rozpuszczalnikiem alifatycznych węglowodorów przed zatopieniem w parafinie.
4. Próbki należy przeciąć do grubości 10 μm za pomocą mikrotomu i zamontować na szklanych szkiełkach mikroskopowych.
   UWAGA: Próbki są teraz gotowe do przetwarzania histologicznego lub immunohistochemicznego przy użyciu standardowych protokołów.

Results

Korzystając z przedstawionych tutaj metod, oceniono udaną decelularyzację ślimaka, badając obecność lub brak DNA poprzez barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI). Ślimaki uważano za w pełni pozbawione komórek, jeśli DNA nie zostało zidentyfikowane w ślimaku pozbawionym komórek. Ślimak natywny z poprzedniego eksperymentu, który nie został poddany decelularyzacji ani odwapnieniu, został użyty jako kontrola pozytywna w celu zilustrowania struktur i komórek tradycyjnie występujących w ...

Discussion

Udało nam się wykazać, że natywne komórki ślimaka mogą być usuwane ze ślimaka w procesie decelularyzacji, co pozwala na wykorzystanie ślimaka jako skomplikowanego, trójwymiarowego rusztowania tkankowego. Santi i wsp. ¹⁵ opracowało wstępną metodę decelularyzacji ślimaków i dokładnie oszacowało objętość wielu struktur ślimaka za pomocą mikroskopii świetlnej²³. Tak wczesne prace posłużyły jako solidna podstawa dla prezentowanych tu technik inżynierii tkankowej i hodow...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wirówka Allegra X-14R	Beckman-Coulter	B08861
Rurki półsztywne Intramedic	Becton Dickinson	427401
New Brunswick Innova 2000 Oscylal Shaler	Eppendorf	M1190-0002
Nożyczki chirurgiczne	Fine Science Tools	14060-10
Cienkie kleszcze	Fine Science Tools	11370-40
Ultracienkie kleszcze	Fine Science Tools	18155-13
50-mililitrowe rurki stożkowe	Fisher Scientific	12565271
szalka Petriego	Fisher Scientific	FB087579B
U-100 Strzykawka insulinowa	Fisher Scientific	14-829-1B
Fiolka scyntylacyjna	Fisher Scientific	03-341-73
Rotator	Fisher Scientific	88-861-049
Pipeta transferowa	Fisher Scientific	22-170-404
Żyletka	Fisher Scientific	12-640
Antybiotykowo-przeciwgrzybicza	Fisher Scientific	15-240-062
Penicylina-Streptomycyna	Fisher Scientific	15-140-122
Płytka 24-dołkowa	Fisher Scientific	07-200-84
Szkiełka mikroskopowe SuperFrost PLUS	Fisher Scientific	12-550-15
Pipeta transferowa	Fisher Scientific	22-170-404
ProLong Gold Antifade Mountant z DAPI	Fisher Scientific	P36935
Clear-Rite 3	Fisher Scientific	22-046341
Thermo Scientific Forma Series II 3110 Inkubator CO2	Thermo Scientific	13-998-078
Mezenchymalne podłoże do wzrostu komórek macierzystych	Lonza	PT-3001
Trypsyna-EDTA	Lonza	CC-3232
TPP T-75 Kolba	hodowlana MidSci	TP90076
Kolba hodowlana TPP T-150	MidSci	TP90151
Kolba hodowlana TPP T-300	MidSci	TP90301
Mikroskop preparacyjny	Instrumenty Nikon	SMZ800
Mikroskop odwrócony Nikon Eclipse Ts2R-FL	Instrumenty Nikon	MFA51010
Szafa bezpieczeństwa biologicznego NuAire Class II, typ A2	NuAire	NU-425-600
1X PBS	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK
1% roztwór SDS	Sigma-Aldrich	436143-100G
10% EDTA	Sigma-Aldrich	E9884-100G