Artykuł metodologiczny

Synteza i ocena mitochondrialnego inhibitora wychwytu wapnia na bazie rutenu

DOI:

10.3791/56527

⸱

26 października 2017

 , 
1Department of Chemistry and Chemical Biology, Cornell University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół syntezy, oczyszczania i charakterystyki inhibitora mitochondrialnego wchłaniania wapnia na bazie rutenu. Przedstawiono procedurę oceny jego skuteczności w przepuszczalnych komórkach ssaków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegółowo opisujemy syntezę i oczyszczanie mitochondrialnego inhibitora wychwytu wapnia, [(OH2)(NH3)4Ru(μ-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. Zoptymalizowana synteza tego związku rozpoczyna się od [Ru(NH3)5Cl]Cl2 w 1 M NH4OH w zamkniętym pojemniku, dając zielony roztwór. Oczyszczanie odbywa się za pomocą chromatografii kationowymiennej. Związek ten został scharakteryzowany i zweryfikowany jako czysty za pomocą spektroskopii UV-vis i IR. Właściwości hamujące wychwyt wapnia przez mitochondria ocenia się w permeabilizowanych komórkach HeLa za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondrialny wapń jest kluczowym regulatorem wielu procesów, które są kluczowe dla prawidłowego funkcjonowania komórek, w tym produkcji energii i apoptozy. 1,2,3 Mitochondrialny uniporter wapnia (MCU), białko transportujące jony, które znajduje się na wewnętrznej błonie mitochondrialnej, reguluje napływ jonów wapnia do mitochondriów. 4,5,6 Chemiczne inhibitory MCU są cennymi narzędziami do kontynuowania wysiłków na rzecz badania funkcji i roli komórkowej tego białka transportowego i mitochondrialnego wapnia. Związek [(HCO2)(NH3)4Ru(μ-O)Ru(NH3)4(O2CH)]3+, Ru360, jest jednym z niewielu znanych selektywnych inhibitorów MCU o zgłoszonej wartości Kd wynoszącej 24 μM.7,8,9,10 Kompleks ten jest powszechnym zanieczyszczeniem występującym w komercyjnych preparatach czerwieni rutenowej (RuRed), trirutenu di-μ-oksozo mostkowanego hexacation o wzorze [(NH3)5Ru(μ-O)Ru(NH3)4(μ-O)Ru(NH3)5)]6+, który był również stosowany jako inhibitor wychwytu wapnia. Chociaż Ru360 jest dostępny na rynku, jest bardzo kosztowny. Co więcej, synteza i izolacja Ru360 jest wyzwaniem ze względu na trudne procedury oczyszczania i niejednoznaczne metody charakteryzacji.

Niedawno informowaliśmy o alternatywnych procedurach dostępu do analogu Ru360, [(OH2)(NH3)4Ru(μ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5. 11 Ten związek hamuje MCU z wysokim powinowactwem, podobnie jak Ru360. W tym protokole opiszemy naszą najskuteczniejszą syntezę tego związku, która rozpoczyna się od [Ru(NH3)5Cl]Cl2. Szczegółowo opisano oczyszczanie produktu za pomocą silnie kwaśnej żywicy kationowymiennej, a także typowe pułapki związane z tą procedurą. Przedstawiono również metody charakterystyki i oceny czystości związku oraz nakreślono proste podejście do badania jego skuteczności w blokowaniu mitochondrialnego wychwytu wapnia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: W tej syntezie stosuje się skoncentrowane kwasy i zasady. Podczas przeprowadzania reakcji należy stosować wszystkie odpowiednie praktyki bezpieczeństwa, w tym stosowanie kontroli technicznej (wyciąg) i środków ochrony indywidualnej (PPE), w tym okularów ochronnych, rękawic, fartucha laboratoryjnego, spodni o pełnej długości i butów z zakrytymi palcami.

1. Przygotowanie [(OH2)(NH3)4Ru(μ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5

  1. Synteza [Ru(NH3)5Cl]Cl2 12
    1. Rozpuścić 1,00 g RuCl3·nH2O(40% wagowo Ru, 4,1 mmol) w 5 mlH2O. Schłodzić ciemnobrązowy roztwór do temperatury 0 °C w łaźni lodowej. Dodać 11 ml (0,23 mola) 80% roztworu hydratu hydrazyny w kroplach. Początkowa reakcja będzie energiczna z gazem wydzielającym, w wyniku czego powstanie brązowy roztwór. Pozostaw powstały roztwór mieszać w temperaturze pokojowej przez 16 godzin; Ostatecznym rozwiązaniem będzie ciemnoczerwony.
      Uwaga: Hydrazyna jest bardzo toksyczna i rakotwórcza. Dodatkowo bezwodne formy tego odczynnika są wybuchowe. Jak zawsze, podczas obsługi należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej i dygestoriów. Nie należy koncentrować tych roztworów do suchości.
    2. Do tego roztworu dodaj około 5-10 ml stężonego HCl, aby dostosować pH do 2. W tym momencie roztwór będzie miał kolor żółto-brązowy.
    3. Podgrzać ten roztwór w temperaturze 105 °C, mieszając przez 1-2 godziny. Żółte ciało stałe wytrąci się z roztworu. Gdy nie tworzy się już widoczny osad, zdejmij z ognia.
    4. Pozostawić mieszaninę reakcyjną do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie umieścić w łaźni lodowej o temperaturze 0 °C na 10 minut. Zebrać żółte ciało stałe przez filtrację próżniową i przemyć po 5 ml etanolu i eteru dietylowego.
    5. Całkowicie rozpuść surowy produkt w 15-25 ml gorącej wody. Schłodzić 10 ml stężonego roztworu HCl w kolbie filtracyjnej, umieszczając ją w łaźni lodowej. Przefiltrować żółty roztwór do schłodzonego roztworu HCl w celu wywołania wytrącania się bladożółtego, czystego ciała stałego. Przefiltrować ten osad i przemyć po 5 ml 0,5 M HCl, etanolu i eteru.
    6. Scharakteryzować związek za pomocą spektroskopii w podczerwieni. Sprawdź czystość, określając częstotliwości rozciągania na 3226 cm-1, 1604 cm-1, 1297 cm-1 i 801 cm-1. Powszechne drobne zanieczyszczenie na wysokości 2069 cm-1 przypisuje się [Ru(NH3)5N2]Cl3.
  2. Synteza [(OH2)(NH3)4Ru(μ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5
    1. Rozpuścić 100 mg (0,34 mmol) [Ru(NH3)5Cl]Cl2 w 50 ml 1 M NH4OH w okrągłodennym zbiorniku ciśnieniowym o grubych ściankach. Luźno zakryć kolbę korkiem i podgrzewać mieszaninę reakcyjną w temperaturze 75 °C przez 6 godzin. Zdejmij z ognia i mieszaj w temperaturze pokojowej przez 4 dni, aby uzyskać ciemnozielony roztwór.
      Ostrożność! Podgrzanie szczelnego naczynia powoduje wzrost ciśnienia. Upewnij się, że używasz odpowiednich naczyń szklanych odpornych na ciśnienie. W tej reakcji celem uszczelnienia naczynia jest zminimalizowanie strat gazowego NH3. W związku z tym należy umieścić korek luźno, aby umożliwić uwolnienie nadmiernego ciśnienia.
  3. Oczyszczanie metodą chromatografii kationowymiennej
    1. W zlewce o pojemności 25 ml zawiesić 5 g żywicy kationowymiennej (np. Dowex 50WX2 200-400 mesh (forma H+)) w 10 ml 0,1 M HCl.
    2. Załaduj tę zawiesinę do kolumny o pojemności 10 ml (średnica 10 mm, wysokość 15 cm) umieszczonej w zbiorniku rozpuszczalnika o pojemności 50 ml. Przemyć żywicę około 20-30 ml 0,1 M HCl, aż eluat stanie się bezbarwny.
    3. Powrócić do zielonego roztworu reakcyjnego wyizolowanego w kroku 1.2.1. Do tego roztworu dodaj skoncentrowany HCl, aby dostosować pH do 2, w którym to momencie kolor roztworu zmieni się na brązowy.
    4. Zakwaszony roztwór należy załadować do kolumny z żywicą kationowymienną przygotowaną w kroku 1.3.2, delikatnie pipetując go na wierzch żywicy. Pozwól eluatowi całkowicie spłynąć i kontynuuj ładowanie roztworu. Powtarzaj ten proces, aż zostanie dodany cały roztwór. Wierzch żywicy będzie ciemnobrązowy/. Żywica nieznacznie zmniejszy swoją objętość.
    5. Użyj szklanych koralików, aby przykryć górną część żywicy. Zapobiegnie to naruszeniu żywicy podczas dodawania nowych roztworów.
    6. Eluować kolumnę za pomocą 20 ml 1 M HCl.
    7. Eluować kolumnę o zwiększonym stężeniu HCl wynoszącym 1,5 M (≈ 50 ml). Żółty roztwór zacznie schodzić z kolumny. Zwiększyć stężenie HCl do 2 M i kontynuować elucję, aż eluat stanie się bezbarwny lub bardzo bladozielono-żółty. Do tego procesu wymagana będzie całkowita objętość 150-200 ml.
    8. Zwiększ stężenie HCl do 2,5 M (20-50 ml). Zebrać eluat w postaci frakcji w probówkach. Zwiększenie do 3 M HCl. Produkt będzie wymywał się z kolumny w postaci zielono-brązowego roztworu. Czerwono-brązowa frakcja może również zacząć schodzić z kolumny. Ponieważ frakcje te są utlenionymi czerwonymi zanieczyszczeniami rutenu, nie łączą się z frakcjami zielono-brązowymi.
  4. Charakterystyka i weryfikacja czystości [(OH2)(NH3)4Ru(μ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5
    1. Zbadać wszystkie frakcje z kroku 1.3.8 za pomocą spektroskopii UV-vis. Aby wykonać to zadanie, należy dodać 100 μL danej frakcji do 2 ml 3 M NH3 i przeanalizować za pomocą spektroskopii UV-vis. Frakcje zawierające czysty produkt będą miały duży zakres absorbancji przy 360 nm i mniej intensywną absorbancję przy 600 nm. Absorpcja przy 480 lub 533 nm wskazuje odpowiednio na utlenione zanieczyszczenia czerwieni rutenowej i czerwieni rutenowej.
    2. Frakcje basenowe zawierające czysty produkt i odparować roztwór do sucha przez odparowanie obrotowe. Produkt zostanie wyizolowany w postaci zielono-brązowego ciała stałego. Plony są zwykle rzędu 5-15 mg (10-20% wydajności). Monokryształy, nadające się do dyfrakcji rentgenowskiej, można otrzymać przez dyfuzję par etanolu do wodnych roztworów związku.
    3. Aby zweryfikować czystość, należy przeanalizować związek za pomocą spektroskopii UV-vis w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem o pH 7,4 (PBS). Czystość można ocenić, biorąc pod uwagę stosunek intensywności pików 360 nm i 600 nm. Stosunek ten wynosi 31 dla czystego związku. W przypadku zanieczyszczonych związków stosunek ten będzie mniejszy.
    4. Analizować próbkę w stanie stałym za pomocą spektroskopii w podczerwieni. Pasma diagnostyczne znajdują się na 3234 cm-1, 3151 cm-1, 1618 cm-1, 1313 cm-1 i 815 cm-1. Typowe pasma zanieczyszczeń są widoczne na 1762 cm-1 i 1400 cm-1, charakterystyczne dla NH4Cl. Czerwień rutenu można zidentyfikować po pasmach na 1404 cm-1, 1300 cm-1, 1037 cm-1 i 800 cm-1.
  5. Ocena hamowania mitochondrialnego wychwytu wapnia metodą spektroskopii fluorescencyjnej
    Ostrożność! W poniższych procedurach wykorzystuje się komórki ssaków. Prace należy wykonywać w odpowiednich okapach z przepływem laminarnym, które są certyfikowane do badań na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2).
    UWAGA: [(OH2)(NH3)4Ru(μ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5 będzie określany jako [Ru] w tej sekcji
    1. Przygotować buforowany roztwór soli fizjologicznej zawierający glukozę (BGSS) jako pożywkę do oznaczania. BGSS jest roztworem zawierającym 110 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 5 mM bursztynianu sodu, 30 μM eteru bis(β-aminoetylowego) glikolu etylenowego (EGTA). Połącz wszystko oprócz EGTA, dostosuj pH do 7,4. Dodaj EGTA i dostosuj pH do 7,4. Na 50 ml pożywki do oznaczania dodać 0,5 ml 1 mg/ml glukozy.
    2. Hodowla komórek HeLa na 500 cm2 szalkach Petriego w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Amplifikować komórki HeLa rosnące na szalce Petriego o średnicy 100 mm, umieszczając je na pożywce Petriego o średnicy 500 cm2. Całkowita objętość podłoża w dużym naczyniu wynosi 115 ml. Z każdej dużej czaszy uzyska około 18 milionów komórek, co wystarczy do przeprowadzenia dwóch eksperymentów ze spektroskopią fluorescencyjną.
      1. Hoduj komórki, aż osiągną 90-95% konfluencji. Usuń pożywkę i przepłucz komórki 15 ml pH 7,4 PBS. Dodać 15 ml 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do PBS i inkubować przez 10 minut w celu odłączenia komórek. Przenieść komórki do probówek sokoła z okrągłym dnem o pojemności 14 ml
    3. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru z odwróconym mikroskopem i oblicz całkowitą liczbę komórek oraz objętość pożywki potrzebną do osiągnięcia 7,5 miliona komórek na 1,8 ml objętości pożywki. Odwirować komórki przez 10 minut w temperaturze 5310 × g. Zdekantować supernatant i dodać obliczoną objętość BGSS. Delikatnie zawieś komórki.
      1. Do tego testu należy przygotować roztwory podstawowe 40 mM digitoniny w dimetylosulfotlenku (DMSO), 1 mM zieleni wapniowej-5N w H2O i 10 mM CaCl2 w H2O. [Ru] roztwory podstawowe, przygotowane w czystej wodzie, mogą mieć od 1 do 3 mM.
        UWAGA: Calcium Green-5N jest wrażliwy na światło. Przechowywać w ciemności i zminimalizować ekspozycję na światło.
    4. Ustawić fluorymetr tak, aby wzbudzał przy długości fali 506 nm i odczytywać emisję przy długości fali 532 nm z uchwytem kuwety sterowanym w temperaturze 37 °C. Przygotować kuwetę akrylową z mieszadłem lub kołkiem, zawiesinę komórek o zawartości 1,8 ml z ppkt 1.5.2 powyżej, 1,8 μl roztworu digitoniny, 3,6 μl zieleni wapniowej-5N (roztwór) i 9 μl [Ru] (dla 1 mM roztworu podstawowego, 5 μM stężenie końcowe). Inkubować komórki przez 15 minut we fluorymetrze.
      1. Odczytuj dane jako stosunek wzbudzenia/emisji, a nie absorpcję surową. Praktyka ta minimalizuje błędy związane z wahaniami natężenia źródła światła.
      2. Przeprowadzić analizę pierwszej próbki pod nieobecność [Ru] w celu zmierzenia wpływu dodania CaCl2 na odpowiedź komórek.
      3. Rozpocząć analizę na fluorymetrze z ustawieniami opisanymi w ppkt 1.5.4. Odczekać około 2 minuty, aby ustalić stabilny poziom emisji, a następnie dodać 1,8 μl CaCl2 (10 μM stężenie końcowe). Intensywność emisji wzrośnie natychmiast po dodaniu CaCl2, a następnie zaniknie w ciągu kilku minut, gdy jony wapnia dostaną się do mitochondriów. Poczekaj, aż rozpad się zakończy (≈5 min). Dodaj dodatkowe bolusy wapniowe, aby określić mitochondrialną odpowiedź wychwytu wapnia przez komórki, które nie są leczone [Ru].
    5. W innej kuwecie zawierającej 5 μM [Ru] powtórzyć doświadczenie zgodnie z powyższym opisem w 1.5.4.3. W obecności inhibitora intensywność emisji wzrośnie, ale nie zaniknie. Ta obserwacja oznacza zablokowany mitochondrialny wychwyt wapnia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda opisuje syntezę mitochondrialnego inhibitora wychwytu wapnia [(OH2)(NH3)4Ru(μ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5 zaczynając od [Ru(NH3)5Cl]Cl2, dobrze znanego materiału wyjściowego rutenu(III). [Ru(NH3)5Cl]Cl2 charakteryzuje się spektroskopią w podczerwieni, z modami drgań na 3200 cm-1, 1608 cm-1, 1298 cm-1 i 798 cm...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondrialny inhibitor wychwytu wapnia [(OH2)(NH3)4Ru(μ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5 można zsyntetyzować z [Ru(NH3)5Cl]Cl2, dobrze znanego materiału wyjściowego rutenu(III), jak opisano w tej procedurze. Synteza [Ru(NH3)5Cl]Cl2 jest łatwa do osiągnięcia z niewielkimi trudnościami. Po mieszaniu RuCl3 przez 16 godzin w hydrazynie hydrazyny, pH roztworu należy dostosować do wart...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Cornell University. W pracy wykorzystano Cornell Center for Materials Research Shared Facilities, które są wspierane przez program NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. dziękuje za wsparcie ze strony stypendium NSF Graduate Research Fellowship (Grant DGE-1650441) oraz dr Dave'a Holowki za pomoc w eksperymentach z wapniem. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autora (autorów) i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hydrat trichlorku rutenuCiśnienie chemiczne3750
Stężony kwas solnyJ.T. Baker9535
Skoncentrowany wodorotlenek amonuMallinckrodt Chemical WorksA669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 MeshAlfa Aesar13945
Zieleń wapniowa 5NInvitrogenC3737
DigitoninaAldrich260746
DMSOAldrich471267
EGTAAldrichE3889
KClUSB20598
KH2PO4AldrichP3786
MgCl2Fisher ScientificM33-500
HEPESFluka54466
Bursztynian soduAlfa Aesar33386
EDTAJ.T. Baker8993-01
GlukozaAldrichG5000
200 Kolba okrągłodennaChemGlassCG-1506-14
Szklany korekChemGlassCG-3000-05
Szklana kolumna 10 mm x 15 cm ze zbiornikamiNiestandardowe - podobne do kolumn ChemglassPodobne do CG-1203-20
DMEMCorning10-017-CV
FBSGibco10437028
PBSCorning21-040-CV
Rury Falcon z okrągłym dnemFisher Scientific14-959-11B 
500 cm2 szalki PetriegoCorning431110
Trypan niebieskiHemacytometr ThermoFisher Scientific
VWR 58017-875
Spektrometr UV-VisAgilent Model Cary 8454 
SpektrofluorymetrSLM Model 8100C
Spektrometr IRBruker Hyprion FTIR z przystawką
WirówkaALC Model PM140R
Mikroskop światła odwróconegoVWR 89404-462
15250061 Kuwety akrylowe Aldrich Z359629 ATR

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
  2. Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
  3. Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
  4. De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
  5. Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
  6. Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
  7. Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).
  8. Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
  9. Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
  10. Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
  11. Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
  12. Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
  13. Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
  14. Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analog rutenu 360chromatografia wymiany kationowejspektroskopia UV Visspektroskopia IRspektroskopia fluorescencyjnapermeabilizowane kom rki HeLazanieczyszczenia rutenu br zowegofrakcje zielono br zowesynteza z wodorotlenkiem amonu

Powiązane artykuły