Ta metoda pozwala na selektywne barwienie i kwantyfikację DNA w żelach poprzez nasączenie żelu w roztworze SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium, a następnie wystawienie go na działanie światła słonecznego lub źródła niebieskiego światła. Powoduje to powstanie widocznego osadu i nie wymaga prawie żadnego sprzętu, dzięki czemu idealnie nadaje się do użytku w terenie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda barwienia DNA oparta na wytrącaniu się formazanu wywołanym ekspozycją na światło niebieskie
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Metody barwienia DNA są bardzo ważne dla badań biomedycznych. Zaprojektowaliśmy prostą metodę, która pozwala na wizualizację DNA gołym okiem poprzez tworzenie się kolorowego osadu. Działa poprzez namoczenie akryloamidu lub żelu DNA z agarozy w roztworze 1x (co odpowiada 2,0 μM) SYBR Green I (SG I) i 0,20 mM nitro blue tetrazolium, który wytwarza fioletowy osad formazanu pod wpływem światła słonecznego lub specyficznie niebieskiego światła. Przeprowadzono również testy odzyskiwania DNA przy użyciu plazmidu opornego na ampicylinę w żelu agarozowym wybarwionym naszą metodą. Naszą metodą uzyskano większą liczbę kolonii niż przy tradycyjnym barwieniu za pomocą SG I z oświetleniem ultrafioletowym. Opisana metoda jest szybka, specyficzna i nietoksyczna w wykrywaniu DNA, umożliwiając wizualizację biomolekuł "gołym okiem" bez transiluminatora, a także jest niedroga i odpowiednia do użytku w terenie. Z tych powodów nasza nowa metoda barwienia DNA może przynieść korzyści zarówno badaniom, jak i przemysłowi.
Wprowadzenie
Wraz z postępem w biochemii i biologii molekularnej, badania z udziałem DNA wymagały lepszych technik analizy DNA. Pierwszą metodą barwienia DNA było barwienie srebrem, które jest bardzo czułe, ale brakuje mu selektywności i nie pozwala na odzyskanie próbki. Później rozwój fluorescencyjnego barwienia DNA pozwolił na selektywną kwantyfikację DNA z możliwością odzyskania próbki. Jednym z pierwszych barwników fluorescencyjnych używanych do ilościowego oznaczania DNA był bromek etydyny1, który jest mutagenny2. Jednak obecnie istnieją ulepszone barwniki fluorescencyjne, które są bezpieczniejsze i bardziej wrażliwe, takie jak GelRed i SYBR Green I (SG I)3; ale wszystkie te barwniki fluorescencyjne wymagają użycia transiluminatora ultrafioletowego (UV) lub fluorymetru.
Istnieją inne techniki widocznego barwienia DNA, takie jak błękit metylenowy4 i fiolet krystaliczny5,6,7,8,9, ale wszystkie one cierpią z powodu zmniejszonej czułości i selektywności. Sole tetrazolowe są związkami organicznymi podatnymi na redukcję, a kiedy to nastąpi, tworzą nierozpuszczalny i kolorowy osad formazanu10,11. Ostatnio wykazano, że niektóre dwuwartościowe sole tetrazolowe wiążą się z DNA ze względu na ich dodatnie pierścienie tetrazolowe12.
W niedawnej publikacji13, zaproponowano nową technikę barwienia i ilościowego oznaczania DNA w żelach poliakrylamidowych, wykorzystującą redukcję dwuwartościowej soli tetrazolowej zwanej nitro blue tetrazolium (NBT) i barwników fluorescencyjnych, takich jak bromek etydyny, GelRed, SYBR Green I i SYBR Gold. Reakcja ta działała w obecności światła niebieskiego lub światła słonecznego i pozwoliła na odzyskanie próbki z lepszą jakością w porównaniu z użyciem SG I z transiluminatorem UV. Celem pracy jest przedstawienie szczegółowego protokołu techniki barwienia z użyciem soli tetrazoliowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie i prowadzenie elektroforezy w żelu
- Przygotować niedenaturujące żele poliakrylamidowe 12% zgodnie z instrukcją elektroforezy żelowej SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) zawartą w publikacji Sambrook i Russell14, lecz z zastosowaniem wody zamiast SDS.
- Aby przygotować 5 mL żelu rozdzielczego, użyć 1,7 mL wody destylowanej, 2 mL akrylamidu/bis-akrylamidu (30/0,8% w/v), 1,3 mL 1,5 M Tris pH 8,8, 0,05 mL 10% nadtlenku amonu oraz 0,002 mL TEMED.
- Aby przygotować 2 mL żelu zagęszczającego, użyć 1,5 mL wody, 0,33 mL akrylamidu/bis-akrylamidu (30/0,8% w/v), 0,25 mL 1 M Tris pH 6,8, 0,02 mL 10% nadtlenku amonu oraz 0,002 mL TEMED. Wymiary żelu wynoszą 7,3 cm x 8,2 cm x 0,075 cm (dł. x szer. x gr.).
Uwaga: Dla uzyskania najlepszej czułości należy użyć grzebienia 15-dołkowego o grubości 0,75 mm.
- Do probówki mikrocentryfużowej 1,5 mL dodać odpowiednie ilości 6x buforu do nakładania i próbki DNA (np. 1 µL 6x buforu do nakładania na 5 µL próbki DNA).
- Umieścić żel w pionowej komorze elektroforetycznej.
- Wypełnić komorę 750 mL buforu 1x TAE, aby przeprowadzić elektroforezę dla 2 żeli. Aby przygotować 1 L 50x TAE, użyć 442 g zasady Trisu, 57,1 mL octu lodowatego oraz 100 mL 0,5 M EDTA pH 8. Dodać wodę destylowaną do uzyskania końcowej objętości 1 L.
- Nanieść próbki na żel. Prowadzić elektroforezę przy napięciu 100 V przez 2 h.
- Alternatywnie przygotować żel agarozy 1x TAE według instrukcji zawartej w publikacji Sambrook14.
- Do poziomej komory elektroforetycznej wlać 300 mL 1x TAE. Prowadzić elektroforezę przez 45 min przy napięciu 100 V.
2. Barwienie NBT-SG I (Rysunek 1).
- Barwienie żelu akrylamidowego.
- Przygotować roztwory: 0,1% w/v NBT oraz 1,2x SG I.
Uwaga: Zamiast SG I można zastosować bromek etydyny, GelRed lub SYBR Gold, jednak SG I wykazał najlepszą skuteczność. - Wlać 16,75 mL roztworu 1,2x SYBR Green I do pojemnika o odpowiedniej wielkości.
Uwaga: Jako pojemnika użyto pokrywki pudełka na końcówki do pipet; objętości zostały obliczone tak, aby pokryć żel w tym pojemniku o wymiarach 11,6 cm x 7,6 cm x 2,6 cm (dł. x szer. x gł.). - Umieścić żel w roztworze. Dodać 3,25 mL roztworu 0,1% w/v NBT, aby uzyskać końcowe stężenia 0,2 mM NBT oraz 1x (równoważne 2,0 µM) SG I.
- Uszczelnić pojemnik folią plastikową, a następnie całkowicie owinąć go folią aluminiową, aby zablokować światło otoczenia.
Uwaga: Folia plastikowa służy do zapobiegania rozlaniu roztworu oraz reakcji folii aluminiowej z roztworem barwiącym. - Mieszać przez 25 min na wytrząsarce orbitalnej przy 60 rpm.
- Zdjąć osłonę aluminiową i plastikową. Naświetlać światłem słonecznym maksymalnie przez 90 min. Kontrolować co 5 min, aż pojawi się interesujący nas prążek.
- W celu zastosowania światła niebieskiego, przygotować płytkę stykową z 3 diodami emitującymi światło (LED) i umieścić diody LED w odległości około 5 mm od powierzchni żelu (ciągle kontrolować barwienie, ponieważ wymagany czas zależy od intensywności źródła światła LED).
- Przygotować roztwory: 0,1% w/v NBT oraz 1,2x SG I.
- Barwienie żelu agarozowego.
- Po przygotowaniu i przeprowadzeniu elektroforezy w 1% żelu agarozowym zgodnie z opisem w sekcji 1.4 (wymiary: 1 cm x 6,2 cm x 7 cm; dł. x szer. x gł.), postępować zgodnie z krokami z sekcji 2.1 z następującymi modyfikacjami:
- Wlać 41,9 mL roztworu 1,2x SG I do pokrywki pudełka na końcówki do pipet o wymiarach 11,6 cm x 7,6 cm x 2,6 cm (dł. x szer. x gł.). Dodać 8,1 mL roztworu 0,1% NBT.
- Uszczelnić pojemnik folią plastikową, a następnie całkowicie owinąć go folią aluminiową, aby zablokować światło otoczenia.
- Mieszać przez 1 h na wytrząsarce orbitalnej przy 60 rpm.
3. Analiza danych.
- Krzywe kalibracyjne NBT-SG I.
- Uzyskać obrazy żeli poprzez skanowanie z rozdzielczością 1200 dpi.
- Uruchomić oprogramowanie do analizy obrazu. Wyprostować obrazy za pomocą edytora graficznego. Przeprowadzić densytometrię obrazu.
- Obliczyć pole pod krzywą. Przygotować wykres zależności Sygnału/SygnałuMax od stężenia DNA.
4. Odzyskiwanie DNA.
- Przygotować 1% żel agarozowy w 1x TAE zgodnie z recepturą opisaną przez Sambrooka14.
- Do poziomej komory elektroforetycznej wlać 300 mL 1x TAE. Nanieść 4 µL plazmidu pDJ10015 o stężeniu 100 ng/µL oraz drabinę DNA zgodnie ze schematem przedstawionym na Rysunku 2. Prowadzić elektroforezę przez 1 h przy napięciu 100 V.
- Oznaczyć i zważyć dwie probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL.
- Przeciąć żel wzdłuż środka na dwie identyczne połowy. Każda z nich powinna zawierać drabinę oraz próbkę plazmidu, aby umożliwić porównanie różnych technik barwienia. Przedstawienie schematyczne znajduje się na Rysunku 2.
- Zabarwić jedną połowę NBT-SG I zgodnie z krokiem 2.
- Wyciąć prążek plazmidu za pomocą czystego skalpela. Umieścić fragment żelu w jednej z probówek i zważyć.
- Zabarwić drugą część żelu za pomocą SG I, stosując 50 mL roztworu 1x SG I, a następnie powoli mieszać żel (60 rpm) przez 1 h w ciemności.
- Umieścić żel na transiluminatorze i naświetlać przez 2 min. Wyciąć prążek plazmidu za pomocą czystego skalpela.
- Umieścić fragment żelu w drugiej probówce i zważyć.
Uwaga: Na tym etapie można przerwać protokół, przechowując probówki w temperaturze -20 °C.
- Przeprowadzić ekstrakcję plazmidu przy użyciu komercyjnego zestawu do izolacji z żelu.
5. Normalizacja plazmidu.
- Do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL dodać 10 µL wyekstrahowanego plazmidu i 60 µL wody typu I. Wymieszać i przenieść do kwarcowej kuwety o pojemności 60 µL lub użyć 2 µL bezpośrednio w Nanodrop.
- Zmierzyć widma absorbancji w zakresie od 230 do 320 nm. Obliczyć stężenie plazmidu w próbce, korzystając z następującego wzoru:
gdzie D to zastosowany czynnik rozcieńczenia (w tym przypadku 70/10), Ax to absorbancja przy x nm, a 50 to współczynnik przeliczeniowy na µg/mL dla dsDNA. - Rozcieńczyć próbki do stężenia 9.1 ng/µL.
- Przeprowadzić transformację kompetentnych komórek Escherichia coli (E. coli) (np. XL10 Gold>) zgodnie z procedurą transformacji Inoue16, używając 5 µL rozcieńczonej próbki.
- Policzyć liczbę kolonii na szalkach Petriego i odnotować rozcieńczenie. Obliczyć jednostki tworzące kolonie (CFU) za pomocą następującego wzoru17:
gdzie D to czynnik rozcieńczenia zastosowany względem kultury wyjściowej. - Wykonać nieparzysty test t.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W miejscu występowania DNA pojawia się fioletowy osad formazanu (potwierdzone metodą spektrometrii mas13). W doświadczeniu naniesiono drabinę DNA w celu sporządzenia krzywej kalibracyjnej (Rysunek 3). Protokół ten sprawdza się zarówno w przypadku żeli akrylamidowych, jak i agarozowych, jednak w żelu agarozowym intensywność jest niższa, a czas trwania procesu dłuższy. Niemniej jednak zastosowanie żeli agarozowych umożliwia odzyskanie pr...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W artykule przedstawiono czułą i nowatorską metodę barwienia DNA opartą na redukcji NBT i zastosowaniu SG I. Krytycznym krokiem w tym protokole jest czas inkubacji żelu w roztworze NBT-SG I i stężenie NBT. Czas barwienia żeli agarozowych jest dłuższy niż żeli akrylamidowych ze względu na większą grubość żeli agarozowych. Ta metoda nie działa dobrze w obecności SDS, ponieważ NBT wytrąca się w kontakcie z nim. Jeśli żel uzyska fioletowe tło, zalecamy przygotowanie innego żelu i skrócenie czasu ekspozycji na światło. Jeśli ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt), Chile, Project 11130263 (do CW), Project CONICYT + NERC + Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (do CW) oraz U-inicia od Vicerrectoría de Investigación Universidad de Chile (do CW).
Podziękowania dla Tatiany Naranjo-Palmy za pomoc w początkowym etapie tego Projektu, Dr. Jorge Babul i Diego Quiroga-Roger za pomocną dyskusję, Roberta Lescha za korektę manuskryptu oraz Dirección de extensión de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas z Universidad de Chile. Podziękowania należą się również Marcelo Pérezowi za montaż filmu i Neilowi Stevensowi za korektę tekstu oraz Errolowi Watsonowi za użyczenie głosu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Odczynnik Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | stosowany w barwieniu |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | odczynnik stosowany w barwieniu |
| Zestaw do ekstrakcji żelu | QIAGEN | 28704 | stosowany do ekstrakcji plazmidu z żelu w teście integralności |
| Drabinka DNA | Thermo-Fisher | SM 1331 | używany do sporządzania krzywych kalibracyjnych i jako odniesienie do cięcia pasma w teście integralności |
| Agar Agar Merck | używany do produkcji płytek do hodowli LB-ampicyliny | ||
| Chlorek sodu | Merck | 1064045000 | używany do produkcji płytek do hodowli LB-ampicyliny |
| ekstrakt drożdżowy | Becton, Dickinson and Company | 212750 | używany do produkcji płytek hodowlanych LB-ampicyliny |
| pepton | Merck | 72161000 | używany do produkcji płytek hodowlanych LB-ampicyliny |
| TEMED | AMRESCO | 761 | używany do produkcji żeli poliakrylamidowych |
| nadsiarczan amonu | Calbiochem | 2310 | używany do produkcji żeli poliakrylamidowych |
| Akrylamid | Invitrogen | 15512-023 | używany do produkcji żeli poliakrylamidowych |
| bisakryloamid | SIGMA | 146072 | używany do produkcji żeli poliakrylamidowych |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | używany do produkcji buforu TAE i niedenaturującego żelu poliakrylamidowego bufor tris-HCl |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | używany do wytwarzania buforu TAE |
| Kwas octowy | Merck | 1 000 632 500 | używany do produkcji agarozy buforowej TAE |
| Merck | 16802 | używany do produkcji | |
| spektrofotometru | Tecan | infinite 200 pro | używany do ilościowego oznaczania plazmidu DNA |
| jednostka oczyszczania wody | Merck | Elix 100 | służy do wytwarzania wody typu 1 (ASTM) stosowanej w spektrofotometrii i rozcieńczaniu DNA \ |
| destylowanej | - używanej w żelach, pożywce hodowlanej, barwieniach i roztworach ogólnych | ||
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | służy do wytwarzania niedenaturującego żelu poliakrylamidowego bufor tris-HCl |
| 6X barwnik ładujący DNA | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Niebieska dioda LED | Jinyuan electronics | SP-021 | źródło światła stosowane w protokole testu integralności |
| Wspornik | KANDH | KH102 | |
| Bateria 9 V | Duracell | - | służy do zasilania poziomej |
| komory elektroforetycznej | Biorad | 1704486EDU | służy do wytwarzania i uruchamiania żelu agarozowego w teście integralności |
| zestaw do elektroforezy pionowej | Biorad | 1658002EDU | służy do uruchamiania żeli poliakrylamidowych w krzywych kalibracyjnych |
| Biorad | 1645050 | służy do zasilania elektroforezy |
Bibliografia
- LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
- Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
- Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
- Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
- Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
- Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
- Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40(1993).
- Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
- Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
- Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
- Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
- Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
- Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
- Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. Brock biology of microorganisms. , 10th, Prentice Hall/Pearson Education. Upper Saddle River (NJ). (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
