Artykuł metodologiczny

Metoda barwienia DNA oparta na wytrącaniu się formazanu wywołanym ekspozycją na światło niebieskie

DOI:

10.3791/56528

⸱

28 stycznia 2018

 ,  , 
1Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda pozwala na selektywne barwienie i kwantyfikację DNA w żelach poprzez nasączenie żelu w roztworze SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium, a następnie wystawienie go na działanie światła słonecznego lub źródła niebieskiego światła. Powoduje to powstanie widocznego osadu i nie wymaga prawie żadnego sprzętu, dzięki czemu idealnie nadaje się do użytku w terenie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody barwienia DNA są bardzo ważne dla badań biomedycznych. Zaprojektowaliśmy prostą metodę, która pozwala na wizualizację DNA gołym okiem poprzez tworzenie się kolorowego osadu. Działa poprzez namoczenie akryloamidu lub żelu DNA z agarozy w roztworze 1x (co odpowiada 2,0 μM) SYBR Green I (SG I) i 0,20 mM nitro blue tetrazolium, który wytwarza fioletowy osad formazanu pod wpływem światła słonecznego lub specyficznie niebieskiego światła. Przeprowadzono również testy odzyskiwania DNA przy użyciu plazmidu opornego na ampicylinę w żelu agarozowym wybarwionym naszą metodą. Naszą metodą uzyskano większą liczbę kolonii niż przy tradycyjnym barwieniu za pomocą SG I z oświetleniem ultrafioletowym. Opisana metoda jest szybka, specyficzna i nietoksyczna w wykrywaniu DNA, umożliwiając wizualizację biomolekuł "gołym okiem" bez transiluminatora, a także jest niedroga i odpowiednia do użytku w terenie. Z tych powodów nasza nowa metoda barwienia DNA może przynieść korzyści zarówno badaniom, jak i przemysłowi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z postępem w biochemii i biologii molekularnej, badania z udziałem DNA wymagały lepszych technik analizy DNA. Pierwszą metodą barwienia DNA było barwienie srebrem, które jest bardzo czułe, ale brakuje mu selektywności i nie pozwala na odzyskanie próbki. Później rozwój fluorescencyjnego barwienia DNA pozwolił na selektywną kwantyfikację DNA z możliwością odzyskania próbki. Jednym z pierwszych barwników fluorescencyjnych używanych do ilościowego oznaczania DNA był bromek etydyny1, który jest mutagenny2. Jednak obecnie istnieją ulepszone barwniki fluorescencyjne, które są bezpieczniejsze i bardziej wrażliwe, takie jak GelRed i SYBR Green I (SG I)3; ale wszystkie te barwniki fluorescencyjne wymagają użycia transiluminatora ultrafioletowego (UV) lub fluorymetru.

Istnieją inne techniki widocznego barwienia DNA, takie jak błękit metylenowy4 i fiolet krystaliczny5,6,7,8,9, ale wszystkie one cierpią z powodu zmniejszonej czułości i selektywności. Sole tetrazolowe są związkami organicznymi podatnymi na redukcję, a kiedy to nastąpi, tworzą nierozpuszczalny i kolorowy osad formazanu10,11. Ostatnio wykazano, że niektóre dwuwartościowe sole tetrazolowe wiążą się z DNA ze względu na ich dodatnie pierścienie tetrazolowe12.

W niedawnej publikacji13, zaproponowano nową technikę barwienia i ilościowego oznaczania DNA w żelach poliakrylamidowych, wykorzystującą redukcję dwuwartościowej soli tetrazolowej zwanej nitro blue tetrazolium (NBT) i barwników fluorescencyjnych, takich jak bromek etydyny, GelRed, SYBR Green I i SYBR Gold. Reakcja ta działała w obecności światła niebieskiego lub światła słonecznego i pozwoliła na odzyskanie próbki z lepszą jakością w porównaniu z użyciem SG I z transiluminatorem UV. Celem pracy jest przedstawienie szczegółowego protokołu techniki barwienia z użyciem soli tetrazoliowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie i prowadzenie żelu

  1. Przygotuj niedenaturujące 12% żele żelowe z poliakrylamidu, używając przepisu na elektroforezę w żelu poliakryloamidowym dodecylu siarczanu sodu (SDS-PAGE), który można znaleźć w Sambrook and Russell14, ale używając wody zamiast SDS.
    1. Aby przygotować 5 ml żelu rozdzielczego, użyj 1,7 ml wody destylowanej, 2 ml akrylamidu/bisakrylamidu (30/0,8% w/v), 1,3 ml 1,5 M Tris pH 8,8, 0,05 ml 10% nadsiarczanu amonu i 0,002 ml TEMED.
    2. Aby przygotować 2 ml żelu do układania w stosy, użyj 1,5 ml wody, 0,33 ml akrylamidu/bisakryloamidu (30/0,8% w/v), 0,25 ml 1 M Tris pH 6,8, 0,02 ml 10% nadsiarczanu amonu i 0,002 ml TEMED. Wymiary żelu to 7,3 cm x 8,2 cm x 0,075 cm (dł. x szer. x gł.).
      nuta: Użyj 15-dołkowego grzebienia o grubości 0.75 mm, aby uzyskać najlepszą czułość.
  2. Dodać odpowiednie ilości 6-krotnego buforu ładującego i próbki DNA do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml (np. użyć 1 μl 6-krotnego buforu ładującego na 5 μl próbki DNA).
  3. Umieść żel w pionowej komorze do elektroforezy.
    1. Napełnij komorę 750 ml buforu 1x TAE, aby uruchomić 2 żele. Aby przygotować 1 l 50x TAE, użyj 442 g zasady Tris, 57,1 ml lodowatego kwasu octowego i 100 ml 0,5 M EDTA pH 8. Dodać wodę destylowaną do końcowej objętości 1 l.
    2. Załaduj próbki do żelu. Uruchom żel pod napięciem 100 V przez 2 godziny.
  4. Alternatywnie, przygotuj 1x żel agarozowy TAE, korzystając z przepisu znajdującego się w Sambrook14.
    1. Dodaj 300 ml 1x TAE do poziomej komory elektroforezy. Uruchom żel na 45 minut przy napięciu 100 V.

2. NBT-SG I Barwienie (Rysunek 1).

  1. Barwienie żelem akrylowym.
    1. Przygotuj roztwory: 0,1% w/v NBT i 1,2x SG I.
      nuta: Możliwe jest użycie bromku etydyny, GelRed i SYBR Gold zamiast SG I, ale SG I miał najlepszą wydajność.
    2. Wlać 16,75 ml 1,2x roztworu SYBR Green I do pojemnika o odpowiedniej wielkości.
      nuta: Użyliśmy pokrywy pudełka z końcówką do pipet jako pojemnika, a te objętości są obliczane tak, aby przykryć żel za pomocą tego pojemnika; Jego wymiary to 11,6 cm x 7,6 cm x 2,6 cm (dł. x szer. x gł.).
    3. Umieść żel w roztworze. Dodać 3,25 ml 0,1% w/v roztworu NBT, aby uzyskać 0,2 mM NBT i 1x (co odpowiada 2,0 μM) stężeniom końcowym SG I.
    4. Uszczelnij pojemnik folią z tworzywa sztucznego i całkowicie owiń pojemnik folią aluminiową, aby zablokować światło otoczenia.
      nuta: Folia z tworzywa sztucznego służy do zapobiegania rozpryskiwaniu i uniknięcia reakcji folii aluminiowej z roztworem barwiącym.
    5. Wstrząsaj przez 25 minut na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 60 obr./min.
    6. Zdejmij aluminiową i plastikową osłonę. Wystawić na działanie promieni słonecznych maksymalnie przez 90 minut. Sprawdzaj co 5 minut, aż pojawi się interesujące Cię pasmo.
    7. Aby użyć światła niebieskiego, przygotuj protoboard z 3 diodami elektroluminescencyjnymi (LED) i umieść diody LED około 5 mm od powierzchni żelu (sprawdzaj zabarwienie na bieżąco, ponieważ potrzebny czas będzie zależał od natężenia źródła światła LED).
  2. Barwienie żelem agarozowym.
    1. Po przygotowaniu i uruchomieniu 1% żelu agarozowego, jak opisano w punktach 1.4 (wymiary to 1 cm x 6,2 cm x 7 cm; dł. x szer. x gł.), należy postępować zgodnie z tymi samymi krokami, co w ppkt 2.1 z następującymi modyfikacjami:
    2. Wlać 41,9 ml 1,2 x roztworu SG I do pokrywy pudełka z końcówką do pipet; jego wymiary to 11,6 cm x 7,6 cm x 2,6 cm (dł. x szer. x gł.). Dodać 8,1 ml 0,1% roztworu NBT.
    3. Uszczelnij pojemnik folią z tworzywa sztucznego, a następnie całkowicie owiń pojemnik folią aluminiową, aby zablokować światło otoczenia.
    4. Wstrząsać przez 1 godzinę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 60 obr./min.

3. Analiza danych.

  1. Krzywe kalibracyjne NBT-SG I.
    1. Uzyskuj obrazy żelu, skanując w rozdzielczości 1200 dpi.
    2. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu. Wyprostuj obrazy za pomocą edytora obrazów. Uruchom densytometrię obrazu.
    3. Oblicz obszar pod krzywą. Przygotuj wykres Signal/Signal Max w funkcji stężenia DNA.

4. Odzyskiwanie DNA.

  1. Przygotuj 1% żel agarozowy w 1x TAE, korzystając z przepisu znalezionego w Sambrook14.
  2. Dodaj 300 ml 1x TAE do poziomej komory elektroforezy. Załaduj 4 μL 100 ng/μL pDJ10015 plazmid i drabinę DNA zgodnie ze schematem podanym w Rysunek 2. Uruchom żel na 1 godzinę przy napięciu 100 V.
  3. Zaznacz i zważ dwie probówki do mikrowirówek o pojemności 2 ml.
  4. Przetnij żel na środku, aby uzyskać dwie identyczne połówki. Każdy z nich powinien zawierać drabinę i plazmid próbki w celu porównania różnych technik barwienia. Schematyczne przedstawienie znajduje się w Rysunek 2.
  5. Zabarwić jedną połowę środkiem NBT-SG I, jak w kroku 2.
    1. Wytnij pasmo plazmidu za pomocą czystego skalpela. Zachowaj kawałek żelu w jednej tubie i zważ.
  6. Drugą część żelu zabarwić SG I 50 ml roztworu 1x SG I i powoli wstrząsać (60 obr./min) żelem przez 1 godzinę w ciemności.
    1. Umieść żel na transiluminatorze i naświetlaj przez 2 minuty. Wytnij pasmo plazmidu za pomocą czystego skalpela.
    2. Zachowaj kawałek żelu w drugiej tubie i zważ.
      nuta: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, utrzymując probówki w temperaturze -20 °C.
  7. Przeprowadź ekstrakcję plazmidu za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu.

5. Normalizacja plazmidu.

  1. Do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml dodać 10 μl wyekstrahowanego plazmidu i 60 μl wody typu I. Wymieszaj i przenieś do kuwety kwarcowej o pojemności 60 μl lub użyj 2 μl bezpośrednio w kropli Nanodrop.
  2. Zmierz widma absorpcyjne w zakresie od 230 do 320 nm. Obliczyć stężenie plazmidu w próbce, korzystając z następującego wzoru:
    figure-protocol-1
    gdzie D jest zastosowanym współczynnikiem rozcieńczenia (w tym przypadku jest to 70/10), Ax oznacza absorpcję przy x nm, a 50 jest współczynnikiem konwersji na μg/ml dla dsDNA.
  3. Rozcieńczyć próbki do 9,1 ng/μl.
  4. Przekształć komórki kompetentne dla Escherichia coli (E. coli) (np. XL10 Gold) zgodnie z procedurą transformacji Inoue16 przy użyciu 5 μl rozcieńczonej próbki.
  5. Policz liczbę kolonii na szalkach Petriego i zwróć uwagę na rozcieńczenie. Oblicz jednostki tworzące kolonie (CFU) za pomocą następującego wzoru17:
    figure-protocol-2
    gdzie D jest współczynnikiem rozcieńczenia zastosowanym z hodowli początkowej.
  6. Wykonaj niesparowany test t.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W miejscu, gdzie znajduje się DNA, pojawia się fioletowy osad formazanu (zweryfikowany przez spektrometrię mas13). W eksperymencie załadowano drabinę DNA, aby utworzyć krzywą kalibracyjną (Rysunek 3). Protokół działa zarówno w przypadku żeli akrylamidowych, jak i agarozowych, ale ma mniejszą intensywność i zajmuje więcej czasu w agarozie. Jednak zastosowanie żeli agarozowych pozwala na odzyskanie próbki za pomocą dostępnego na rynku zestawu i ni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono czułą i nowatorską metodę barwienia DNA opartą na redukcji NBT i zastosowaniu SG I. Krytycznym krokiem w tym protokole jest czas inkubacji żelu w roztworze NBT-SG I i stężenie NBT. Czas barwienia żeli agarozowych jest dłuższy niż żeli akrylamidowych ze względu na większą grubość żeli agarozowych. Ta metoda nie działa dobrze w obecności SDS, ponieważ NBT wytrąca się w kontakcie z nim. Jeśli żel uzyska fioletowe tło, zalecamy przygotowanie innego żelu i skrócenie czasu ekspozycji na światło. Jeśli ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt), Chile, Project 11130263 (do CW), Project CONICYT + NERC + Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (do CW) oraz U-inicia od Vicerrectoría de Investigación Universidad de Chile (do CW).

Podziękowania dla Tatiany Naranjo-Palmy za pomoc w początkowym etapie tego Projektu, Dr. Jorge Babul i Diego Quiroga-Roger za pomocną dyskusję, Roberta Lescha za korektę manuskryptu oraz Dirección de extensión de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas z Universidad de Chile. Podziękowania należą się również Marcelo Pérezowi za montaż filmu i Neilowi Stevensowi za korektę tekstu oraz Errolowi Watsonowi za użyczenie głosu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik Nitro blue tetrazoliumGold Biotechnology298-83-9stosowany w barwieniu
SYBR Green I 10000XThermo-FisherS7563odczynnik stosowany w barwieniu
Zestaw do ekstrakcji żeluQIAGEN28704stosowany do ekstrakcji plazmidu z żelu w teście integralności
Drabinka DNAThermo-FisherSM 1331używany do sporządzania krzywych kalibracyjnych i jako odniesienie do cięcia pasma w teście integralności
Agar Agar Merckużywany do produkcji płytek do hodowli LB-ampicyliny 
Chlorek soduMerck1064045000używany do produkcji płytek do hodowli LB-ampicyliny 
ekstrakt drożdżowyBecton, Dickinson and Company212750używany do produkcji płytek hodowlanych LB-ampicyliny 
peptonMerck72161000używany do produkcji płytek hodowlanych LB-ampicyliny 
TEMEDAMRESCO761używany do produkcji żeli poliakrylamidowych
nadsiarczan amonuCalbiochem2310używany do produkcji żeli poliakrylamidowych
AkrylamidInvitrogen15512-023używany do produkcji żeli poliakrylamidowych
bisakryloamidSIGMA146072używany do produkcji żeli poliakrylamidowych
Tris-baseMerck1083821000używany do produkcji buforu TAE i niedenaturującego żelu poliakrylamidowego bufor tris-HCl
EDTAJ.T. Baker8993-01używany do wytwarzania buforu TAE
Kwas octowyMerck1 000 632 500używany do produkcji agarozy buforowej TAE
Merck16802używany do produkcji
spektrofotometruTecaninfinite 200 proużywany do ilościowego oznaczania plazmidu DNA
jednostka oczyszczania wodyMerckElix 100służy do wytwarzania wody typu 1 (ASTM) stosowanej w spektrofotometrii i rozcieńczaniu DNA \
destylowanej- używanej w żelach, pożywce hodowlanej, barwieniach i roztworach ogólnych
HClJ.T. Baker9535-03służy do wytwarzania niedenaturującego żelu poliakrylamidowego bufor tris-HCl
6X barwnik ładujący DNAThermo-FisherR0610
5 mm Niebieska dioda LEDJinyuan electronicsSP-021źródło światła stosowane w protokole testu integralności
WspornikKANDHKH102 
Bateria 9 VDuracell-służy do zasilania poziomej
komory elektroforetycznejBiorad1704486EDUsłuży do wytwarzania i uruchamiania żelu agarozowego w teście integralności
zestaw do elektroforezy pionowejBiorad1658002EDUsłuży do uruchamiania żeli poliakrylamidowych w krzywych kalibracyjnych
Biorad1645050 służy do zasilania elektroforezy
buforowego TAE wodzie i obwód źródła światła diody LED zasilanie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
  2. Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
  3. Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
  4. Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
  5. Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
  6. Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
  7. Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40(1993).
  8. Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
  9. Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
  10. Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
  11. Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
  12. Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
  13. Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
  14. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
  15. Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
  16. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
  17. Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. Brock biology of microorganisms. , 10th, Prentice Hall/Pearson Education. Upper Saddle River (NJ). (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

SYBR Green Initro b kit tetrazoliowyel agarozowyel poliakrylamidowyodzyskiwanie DNAekstrakcja plazmid wliczenie kolonii

Powiązane artykuły