Ilustrujemy prostą metodę pozyskiwania mysich pierwotnych makrofagów z komórek szpiku kostnego oraz prostą metodę przygotowania koniugatów BSA-kwasów tłuszczowych. Następnie wykazujemy, że nasycone kwasy tłuszczowe mogą indukować śmierć komórek makrofagów, a taka śmierć komórki jest pozytywnie związana z akumulacją komórek poziomu ceramidów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Nasycone kwasy tłuszczowe indukują śmierć komórek makrofagów związaną z ceramidami
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Makrofagi wykazują wysoką ekspresję białka wiążącego kwasy tłuszczowe naskórka i białka wiążącego kwasy tłuszczowe tłuszczu. Aktywnie pobierają nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe, które mogą odgrywać kluczową rolę w regulacji ich funkcji odpornościowych. Liczne badania wykazały, że różne kwasy tłuszczowe, nasycone lub nienasycone, mogą mieć różny wpływ na wzrost i funkcjonowanie komórek. Jednak podejścia stosowane do przygotowania kwasów tłuszczowych różnią się, co może prowadzić do wyników niefizjologicznych. Albumina surowicy, naturalny nośnik kwasów tłuszczowych we krwi obwodowej ssaków, jest zalecana do tworzenia sprzężonego kompleksu z solą sodową kwasów tłuszczowych w celu badania funkcji kwasów tłuszczowych w komórkach ssaków, minimalizując w ten sposób toksyczność mydła z kwasami tłuszczowymi. W ten sposób opracowano i przedstawiono prostą, stosunkowo szybką metodę podgrzewania i sonikacji do tworzenia koniugatu BSA-kwasów tłuszczowych. Opisujemy protokół wykorzystujący nasycone kwasy tłuszczowe, zwłaszcza kwasy stearynowe, w celu wywołania ciężkiej śmierci komórek w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Ponadto wykazujemy, że śmierć komórek wywołana nasyconymi kwasami tłuszczowymi jest pozytywnie związana ze skumulowanymi poziomami ceramidów w komórkach. Metoda ta może zostać rozszerzona o badania wpływu kwasów tłuszczowych na komórki innych ssaków.
Wprowadzenie
Kwasy tłuszczowe odgrywają kluczową rolę w metabolizmie energetycznym i w syntezie fosfolipidów błonowych w różnych rodzajach komórek. Kwasy tłuszczowe mają niską rozpuszczalność w wodzie. Odpowiednie przygotowanie kwasów tłuszczowych ma kluczowe znaczenie dla badania biologicznych funkcji kwasów tłuszczowych w komórkach ssaków. Kiedy kwasy tłuszczowe są przygotowywane z etanolem, wiele kwasów tłuszczowych może wykazywać swoje toksyczne działanie mydła (detergentu) na błonę komórkową, nawet przy stosunkowo niskich stężeniach1. Jako naturalny, główny transporter wolnych kwasów tłuszczowych w surowicy, albumina surowicy jest uważana za dobry nośnik do dostarczania kwasów tłuszczowych in vitro do testów funkcji kwasów tłuszczowych2,3,4. Jednak szczegóły dotyczące przygotowania koniugatu albuminy kwasu tłuszczowego i albuminy surowicy zwykle nie są dostępne, mimo że opublikowano wiele prac naukowych z użyciem kwasów tłuszczowych.
Makrofagi wykazują wysoką ekspresję białka wiążącego naskórkowe kwasy tłuszczowe i białka wiążącego kwasy tłuszczowe tłuszczu5,6,7,8. Aktywnie pobierają nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe, które mogą regulować ich funkcje odpornościowe. Do zbadania wpływu kwasów tłuszczowych na makrofagi i inne komórki zastosowano różne metody przygotowania kwasów tłuszczowych1,7,9. Wykorzystanie odpowiednio przygotowanych koniugatów kwasów tłuszczowych i albumin surowicy w celu zbadania wpływu kwasów tłuszczowych na funkcję makrofagów ma kluczowe znaczenie w uzyskaniu danych o znaczeniu biologicznym. Badania nad wpływem kwasów tłuszczowych na funkcję makrofagów mogą dostarczyć podstawowej wiedzy i potencjalnych celów terapeutycznych związanych z metabolizmem kwasów tłuszczowych w chorobach związanych z makrofagami.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu w Louisville.
1. Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego myszy (BMDM)
- Poddaj eutanazji 6- do 8-tygodniową, zdrową mysz typu dzikiego za pomocą CO2 . Przypnij go do płyty piankowej i spryskaj 70% etanolem, aż zostanie nasiąknięty. Usuń kości piszczelowe/udowe za pomocą kleszczy i nożyczek. Umieść je na szalce Petriego z 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wszystkie zabiegi wykonuj w sterylnych warunkach.
- Rozciąć oba końce kości piszczelowej/udowej nożyczkami w sterylnym kapturze do hodowli tkanek. Przepłukać kość igłą 25 G z PBS + 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS) do probówki o pojemności 15 ml.
- Odwirować komórki szpiku kostnego w temperaturze 500 x g, w temperaturze 4 °C przez 5 min.
- Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek w celu lizy czerwonych krwinek (RBC) przez mniej niż 1 minutę. Natychmiast rozcieńczyć 9 ml 1x PBS. Ponownie odwirować jak w kroku 1.3. Zdekantować supernatanty.
- Ponownie zawiesić osad komórek w 10 ml 1x PBS, przefiltrować zawiesinę komórek przez sterylną nylonową siatkę 40 μm do innej probówki o pojemności 15 ml w celu usunięcia resztek / grudek komórek. Ponownie odwirować jak w ppkt 1.3. Zdekantować supernatanty.
- Zawiesić osad komórkowy w 15 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 z 5% FBS i 10 μg/ml gentamycyny, umieścić komórki w 100-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej w inkubatorze o temperaturze 37 oC na 60 minut. Delikatnie zakręć naczyniem, wyjmij pływające komórki i policz je.
- Płytka 6x106 komórek w naczyniu o średnicy 100 mm z 12 ml pożywki różnicującej makrofagi (RPMI 1640 z 5% FBS i 10 μg/ml gentamycyny, zmieszane z 30% pożywką kondycjonowaną L92910) z 10 ng/ml rekombinowanego czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów myszy (M-CSF) przez 2 dni.
- Po 2 dniach hodowli w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 należy nakarmić każde danie 6 ml świeżej pożywki różnicującej makrofagi o stężeniu 10 ng/ml M-CSF.
- W 5 dniu wyjmij 8 ml starej pożywki bez naruszania komórek i dodaj 10 ml świeżej pożywki różnicującej makrofagi z 10 ng / mL M-CSF.
- W dniu 7 zbierz makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) za pomocą podnośnika komórkowego.
UWAGA: Przyłączone makrofagi można również zdysocjować za pomocą 5 ml 1 mM EDTA w 1x PBS przez 5 do 10 minut po usunięciu komórek pływakowych i dwukrotnym przemyciu płytki 5 ml 1x PBS. Odwirować komórki jak w kroku 1.3, zawiesić je ponownie w świeżych pożywkach różnicujących makrofagi i policzyć je za pomocą hemocytometru.- Potwierdź fenotyp BMDM za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie z opisem5. Przygotuj uzyskane makrofagi myszy w określonym stężeniu do kolejnych badań.
2. Preparat sprzężony z kwasem tłuszczowym BSA
- Przygotować 2 mM BSA w sterylnym PBS. Na przykład zważ 6,65 g BSA, dodaj 30 ml 1x PBS do rozpuszczenia, a następnie dodaj więcej PBS do 50 ml, skalując składniki, aby uzyskać 2 mM BSA w 1x PBS.
- Przygotować 5 mM pojedynczą sól sodową kwasów tłuszczowych w 2 mM BSA. Podgrzać do temperatury 37 °C lub wyższej, jeśli to konieczne, i poddać sonikacji mieszaniny 2 mM BSA i soli sodowej kwasów tłuszczowych aż do uzyskania klarownego roztworu.
UWAGA: W porównaniu z nienasyconymi kwasami tłuszczowymi, nasycone kwasy tłuszczowe potrzebują wyższej temperatury i dłuższego czasu sonikacji do rozpuszczenia. - Przefiltrować roztwór BSA kwasu tłuszczowego przez filtr 0,22 μm, podzielić go na sterylne probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego użytku lub w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania. Nie należy zaobserwować opadów po przechowywaniu w lodówce w temperaturze 4 °C.
3. Nasycone kwasy tłuszczowe indukują śmierć komórek makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy
- Umieść BMDM w 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej z 0,4 x 106/ml w pożywce różnicującej makrofagi.
- Traktować komórki 0,4 mM kwasem palmitynowym i kwasem stearynowym przez 16 do 24 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Stosować BSA jako kontrolę negatywną.
- Po poddaniu działaniu substancji należy zebrać komórki za pomocą podnośnika do komórek i odwirować je w temperaturze 500 x g, 4 °C przez 5 minut.
- Wybarwić komórki aneksyną V-Alexa 488 i 7-aminoaktynomycyną D (7-AAD) w 100 μl buforu wiążącego anektynę V przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Rozcieńczyć próbkę 200 μl buforu wiążącego aneksynę, delikatnie wymieszać, a następnie po okresie inkubacji przechowywać próbki na lodzie.
- Przeanalizuj wybarwione komórki tak szybko, jak to możliwe, za pomocą cytometrii przepływowej5. Aneksyna V-Alexa 488 jest wykrywana w kanale FITC, a 7-AAD jest wykrywana w kanale PerCP/PerCP-Cy5.5.
4. Wewnątrzkomórkowe barwienie ceramidami
- Po poddaniu działaniu kwasów tłuszczowych należy pobrać komórki, jak w kroku 3.3. Następnie utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut.
- Przemyć próbkę 1 ml 1x PBS, odwirować w dół jak krok w 3.3 i zdekantować supernatant.
- Wybarwić komórki pierwszorzędowym przeciwciałem anty-ceramidowym (rozcieńczenie 1:200) w 100 μl 1x bufor permeabilizacyjny przez 30 min.
- Umyj i ponownie odwiruj ogniwa, jak w kroku 4.2.
- Wybarwić komórki przeciwciałem wtórnym anty-mysim IgM (rozcieńczenie 1:500) w 100 μl 1x bufor permeabilizacji przez 30 min.
- Umyj i ponownie odwiruj ogniwa, jak w kroku 4.2. Dodać 250 μL 1x PBS i przeanalizować wybarwione komórki metodą cytometrii przepływowej5.
UWAGA: Zapoznaj się ze szczegółową listą odczynników w Tabeli wyposażenia i odczynników.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Otyłość zwiększa stężenie wolnych kwasów tłuszczowych w surowicy. Jako profesjonalne fagocyty, makrofagi aktywnie pobierają kwasy tłuszczowe w celu utrzymania homeostazy organizmu. W przebiegu tych procesów nadmiar lipidów może indukować śmierć komórkową makrofagów. W tym celu hodowano BMDM in vitro z dietetycznymi stężeniami kwasów tłuszczowych charakterystycznymi dla otyłości, a śmierć komórkową makrofagów mierzono za pomocą barwienia cytometrycznego. W porównaniu z kontrolą BS...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Właściwe przygotowanie roztworu kwasów tłuszczowych ma kluczowe znaczenie dla badania biologicznej funkcji kwasów tłuszczowych. Neutralizacja kwasu tłuszczowego zwiększa jego rozpuszczalność w roztworze wodnym. Jednak sole sodowe kwasów tłuszczowych, zwłaszcza nasyconych kwasów tłuszczowych, mają nadal niską rozpuszczalność w wodzie lub PBS, jak zaobserwowaliśmy. Jedną z metod jest użycie 95 - 100% etanolu, aby pomóc rozpuścić kwasy tłuszczowe1. Stosując tę metodę, można zaobserwować wyższą toksyc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak finansowego konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była częściowo wspierana przez fundusze start-upowe Uniwersytetu w Louisville oraz granty National Cancer Institute (Bethesda, MD) R01CA177679, R01CA180986.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kąpiel ultradźwiękowa CPX | Bransonic | Model 2800 | |
| Palmitynian sodu (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | MWW 278 |
| Stearynian sodu (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA), bez kwasów tłuszczowych | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów myszy (mM-CSF) | Technologia sygnalizacji komórkowej, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Aneksyna V, koniugat Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoklonalne przeciwciało antyceramidowe (mysie IgM) | Sigma | C8104-50TST | Klon: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mysz IgM Przeciwciało i mikrołańcuch, FITC koniugat | Sigma | AP128F | |
| Bufor utrwalający | Biolegend | 420801 | |
| Bufor permeabilizacji | Ebioscience | 4307693 | |
| Bufor do lizy czerwonych krwinek | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Bufor wiążący | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 komórki | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Podnośnik komórek | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Uwaga: MW dotyczy masy cząsteczkowej. |
Bibliografia
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
- Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
- Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
- Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
- Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
- Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
- Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
- Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
- Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
- Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
