Ilustrujemy prostą metodę pozyskiwania mysich pierwotnych makrofagów z komórek szpiku kostnego oraz prostą metodę przygotowania koniugatów BSA-kwasów tłuszczowych. Następnie wykazujemy, że nasycone kwasy tłuszczowe mogą indukować śmierć komórek makrofagów, a taka śmierć komórki jest pozytywnie związana z akumulacją komórek poziomu ceramidów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Nasycone kwasy tłuszczowe indukują śmierć komórek makrofagów związaną z ceramidami
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Makrofagi wykazują wysoką ekspresję białka wiążącego kwasy tłuszczowe naskórka i białka wiążącego kwasy tłuszczowe tłuszczu. Aktywnie pobierają nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe, które mogą odgrywać kluczową rolę w regulacji ich funkcji odpornościowych. Liczne badania wykazały, że różne kwasy tłuszczowe, nasycone lub nienasycone, mogą mieć różny wpływ na wzrost i funkcjonowanie komórek. Jednak podejścia stosowane do przygotowania kwasów tłuszczowych różnią się, co może prowadzić do wyników niefizjologicznych. Albumina surowicy, naturalny nośnik kwasów tłuszczowych we krwi obwodowej ssaków, jest zalecana do tworzenia sprzężonego kompleksu z solą sodową kwasów tłuszczowych w celu badania funkcji kwasów tłuszczowych w komórkach ssaków, minimalizując w ten sposób toksyczność mydła z kwasami tłuszczowymi. W ten sposób opracowano i przedstawiono prostą, stosunkowo szybką metodę podgrzewania i sonikacji do tworzenia koniugatu BSA-kwasów tłuszczowych. Opisujemy protokół wykorzystujący nasycone kwasy tłuszczowe, zwłaszcza kwasy stearynowe, w celu wywołania ciężkiej śmierci komórek w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Ponadto wykazujemy, że śmierć komórek wywołana nasyconymi kwasami tłuszczowymi jest pozytywnie związana ze skumulowanymi poziomami ceramidów w komórkach. Metoda ta może zostać rozszerzona o badania wpływu kwasów tłuszczowych na komórki innych ssaków.
Wprowadzenie
Kwasy tłuszczowe odgrywają kluczową rolę w metabolizmie energetycznym i w syntezie fosfolipidów błonowych w różnych rodzajach komórek. Kwasy tłuszczowe mają niską rozpuszczalność w wodzie. Odpowiednie przygotowanie kwasów tłuszczowych ma kluczowe znaczenie dla badania biologicznych funkcji kwasów tłuszczowych w komórkach ssaków. Kiedy kwasy tłuszczowe są przygotowywane z etanolem, wiele kwasów tłuszczowych może wykazywać swoje toksyczne działanie mydła (detergentu) na błonę komórkową, nawet przy stosunkowo niskich stężeniach1. Jako naturalny, główny transporter wolnych kwasów tłuszczowych w surowicy, albumina surowicy jest uważana za dobry nośn....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu w Louisville.
1. Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego myszy (BMDM)
- Poddaj eutanazji 6- do 8-tygodniową, zdrową mysz typu dzikiego za pomocą CO2 . Przypnij go do płyty piankowej i spryskaj 70% etanolem, aż zostanie nasiąknięty. Usuń kości piszczelowe/udowe za pomocą kleszczy i nożyczek. Umieść je na szalce Petriego z 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wszystkie zabiegi wykonuj w sterylnych warunkach.
- Rozciąć oba końce kości piszczelowej/udowej nożyczkami w sterylnym kapt....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Otyłość zwiększa stężenie wolnych kwasów tłuszczowych w surowicy. Jako profesjonalne fagocyty, makrofagi aktywnie pobierają kwasy tłuszczowe w celu utrzymania homeostazy organizmu. W przebiegu tych procesów nadmiar lipidów może indukować śmierć komórkową makrofagów. W tym celu hodowano BMDM in vitro z dietetycznymi stężeniami kwasów tłuszczowych charakterystycznymi dla otyłości, a śmierć komórkową makrofagów mierzono za pomocą barwienia cytometrycznego. W porównaniu z kontrolą BS.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Właściwe przygotowanie roztworu kwasów tłuszczowych ma kluczowe znaczenie dla badania biologicznej funkcji kwasów tłuszczowych. Neutralizacja kwasu tłuszczowego zwiększa jego rozpuszczalność w roztworze wodnym. Jednak sole sodowe kwasów tłuszczowych, zwłaszcza nasyconych kwasów tłuszczowych, mają nadal niską rozpuszczalność w wodzie lub PBS, jak zaobserwowaliśmy. Jedną z metod jest użycie 95 - 100% etanolu, aby pomóc rozpuścić kwasy tłuszczowe1. Stosując tę metodę, można zaobserwować wyższą toksyc.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak finansowego konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była częściowo wspierana przez fundusze start-upowe Uniwersytetu w Louisville oraz granty National Cancer Institute (Bethesda, MD) R01CA177679, R01CA180986.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kąpiel ultradźwiękowa CPX | Bransonic | Model 2800 | |
| Palmitynian sodu (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | MWW 278 |
| Stearynian sodu (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA), bez kwasów tłuszczowych | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów myszy (mM-CSF) | Technologia sygnalizacji komórkowej, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Aneksyna V, koniugat Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoklonalne przeciwciało antyceramidowe (mysie IgM) | Sigma | C8104-50TST | Klon: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mysz IgM Przeciwciało i mikrołańcuch, FITC koniugat | Sigma | AP128F | |
| Bufor utrwalający | Biolegend | 420801 | |
| Bufor permeabilizacji | Ebioscience | 4307693 | |
| Bufor do lizy czerwonych krwinek | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Bufor wiążący | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 komórki | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Podnośnik komórek | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Uwaga: MW dotyczy masy cząsteczkowej. |
Bibliografia
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
