Artykuł metodologiczny

Monitorowanie wpływu stresu osmotycznego na pęcherzyki wydzielnicze i egzocytozę

DOI:

10.3791/56537

⸱

19 lutego 2018

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Chemical Engineering, Chalmers University of Technology, 2Department of Chemistry and Molecular Biology, University of Gothenburg

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stres osmotyczny wpływa na egzocytozę i ilość neuroprzekaźników uwalnianych podczas tego procesu. Pokazujemy, w jaki sposób połączenie metod elektrochemicznych z transmisyjną mikroskopią elektronową może być wykorzystane do badania wpływu zewnątrzkomórkowego ciśnienia osmotycznego na aktywność egzocytozy, wielkość ilościową pęcherzyków i ilość neuroprzekaźnika uwalnianego podczas egzocytozy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amperometria komórek poddanych szokowi osmotycznemu pokazuje, że komórki wydzielnicze reagują na ten stres fizyczny, zmniejszając aktywność egzocytozy i ilość neuroprzekaźnika uwalnianego z pęcherzyków w pojedynczych zdarzeniach egzocytozy. Zasugerowano, że zmniejszenie wydalanych neuroprzekaźników jest spowodowane zmianami we właściwościach biofizycznych błony, gdy komórki kurczą się w odpowiedzi na stres osmotyczny i przy założeniu, że pęcherzyki wydzielnicze w cytoplazmie komórki nie są dotknięte zewnątrzkomórkowym stresem osmotycznym. Zapis amperometryczny egzocytozy monitoruje, co jest uwalniane z komórek w momencie łączenia się pęcherzyka z błoną plazmatyczną, ale nie dostarcza informacji o zawartości pęcherzyka przed wyzwoleniem fuzji pęcherzyków. W związku z tym, połączenie zapisu amperometrycznego z innymi uzupełniającymi metodami analitycznymi, które są w stanie scharakteryzować pęcherzyki wydzielnicze przed wyzwoleniem egzocytozy w komórkach, daje szerszy przegląd do zbadania, w jaki sposób szok osmotyczny wpływa na pęcherzyki wydzielnicze i proces egzocytozy. Opisujemy tutaj, w jaki sposób uzupełnienie zapisu amperometrii z wewnątrzkomórkową cytometrią elektrochemiczną i obrazowaniem transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) może być wykorzystane do scharakteryzowania zmian wielkości pęcherzyków wydzielniczych i zawartości neuroprzekaźników w komórkach chromochłonnych w odniesieniu do aktywności egzocytozy przed i po ekspozycji na stres osmotyczny. Łącząc informacje ilościowe uzyskane z eksperymentów przy użyciu wszystkich trzech metod analitycznych, wcześniej wyciągnięto wnioski, że pęcherzyki wydzielnicze reagują na zewnątrzkomórkowy stres osmotyczny, zmniejszając rozmiar i zmniejszając rozmiar ilościowy pęcherzyka, aby utrzymać stałe stężenie neuroprzekaźników pęcherzyków. W związku z tym daje to pewne wyjaśnienie, dlaczego pęcherzyki, w odpowiedzi na stres osmotyczny, zmniejszają ilość neuroprzekaźników uwalnianych podczas uwalniania egzocytozy. Zapisy amperometryczne wskazują, że jest to proces odwracalny i że pęcherzyki po wstrząsie osmotycznym są ponownie wypełniane neuroprzekaźnikami, gdy umieszczone komórki są przywracane do środowiska izotonicznego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki chromochłonne w nadnerczach to komórki neuroendokrynne, które uwalniają cząsteczki neuroprzekaźników do krwiobiegu. Dzieje się tak w procesie komórkowym, który obejmuje dokowanie i fuzję pęcherzyków wypełnionych neuroprzekaźnikami, co powoduje uwalnianie treści z pęcherzyków do przestrzeni zewnątrzkomórkowej w procesie zwanym egzocytozą. Neuroprzekaźniki (adrenalina i noradrenalina) w komórkach chromochłonnych są aktywnie transportowane przez białka błonowe do dużych gęstych pęcherzyków rdzeniowych (LDCV) i przechowywane w wysokich stężeniach (~0,5-1 M)1,2. Akumulacja neuroprzekaźników wewnątrz LDCV odbywa się poprzez powinowactwo cząsteczek katecholamin do wewnątrzpęcherzykowej gęstej macierzy białkowej rdzenia składającej się z białek chromograniny (~169 mg / ml)3,4,5,6 oraz dopęcherzykowy roztwór koktajlowy zawierający kluczowe składniki do ładowania i przechowywania katecholamin w pęcherzyku, takie jak ATP (125-300 mM)7, Ca2+ (50-100 μM w roztworze i ~40 mM związane z matrycą białkową)8, Mg2+ (5 mM)9, askorbinian (10-30 mM)10, i pH ~5,511,12. LDCV utrzymują stan izoosmotyczny z cytoplazmą komórki (310 mOsm/kg)13, mimo że teoretyczne stężenie substancji rozpuszczonej wewnątrz pęcherzyków wynosi ponad 750 mM. Skład składników śródpęcherzykowych jest niezbędny nie tylko do ładowania i przechowywania katecholamin, ale także do agregacji substancji rozpuszczonych do gęstej macierzy białkowej rdzenia. To znacznie zmniejsza osmolarność pęcherzyków, jest znacznie zmniejszone i może wpływać na ilość katecholaminy, która jest uwalniana podczas egzocytozy5,6.

Badania nad wpływem zewnątrzkomórkowego ciśnienia osmotycznego na proces egzocytozy za pomocą zapisu amperometrycznego wykazały, że wysokie zewnątrzkomórkowe ciśnienie osmotyczne hamuje aktywność egzocytozy i zmniejsza liczbę neuroprzekaźników wydzielanych z pojedynczych przedziałów pęcherzykowych4,14,15,16,17,18,19. Wyjaśnienia tych obserwacji spekulowały na temat możliwego zwiększenia makromolekularnego stłoczenia w cytoplazmie komórki, hamującego fuzję pęcherzyków oraz zmiany właściwości biofizycznych błony wpływającej na liczbę neuroprzekaźników uwalnianych podczas egzocytozy. Rozważania te zakładały, że wysoki zewnątrzkomórkowy stres osmotyczny nie wpływa na wielkość ilościową pęcherzyka, która określa liczbę cząsteczek neuroprzekaźników przechowywanych w komorze pęcherzyka na wcześniejszym etapie wywołanej egzocytozy14,15,17,19,20,21. W amperometrycznych pomiarach uwalniania egzocytozy w pojedynczych komórkach, mikroelektroda z krążka z włókna węglowego jest umieszczana w bliskim kontakcie z powierzchnią komórki, tworząc eksperymentalny zestaw naśladujący konfigurację synaps, w którym elektroda amperometryczna służy jako detektor postsynaptyczny ( Rysunek 1) < sup class="xref">22,23. Stymulując komórkę do egzocytozy, można skłonić pęcherzyki wypełnione neuroprzekaźnikami do połączenia się z błoną plazmatyczną komórki i uwolnienia części lub całej zawartości pęcherzyków do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Te cząsteczki neuroprzekaźników uwalniane na powierzchni elektrody można wykryć elektrochemicznie, jeśli neuroprzekaźniki są elektroaktywne (np. katecholaminy), stosując potencjał redoks +700 mV w porównaniu z elektrodą referencyjną Ag/AgCl. W związku z tym seria bieżących skoków oznacza wykrywanie poszczególnych zdarzeń egzocytozy. Ze śladu prądu w funkcji czasu w zapisie amperometrycznym, obszar pod każdym pojedynczym impulsem amperometrycznym reprezentuje ładunek wykryty na zdarzenie egzocytozy i może być przeliczony na mol uwolnionych neuroprzekaźników przy użyciu równania Faradaya. W związku z tym zapisy amperometryczne dostarczają informacji ilościowych na temat ilości neuroprzekaźników wydalanych z pojedynczych zdarzeń egzocytozy i informują o częstości zdarzeń egzocytozy, ale nie zawierają informacji ilościowych na temat zawartości pęcherzyków wydzielniczych przed rozpoczęciem fuzji pęcherzyków i uwalniania neuroprzekaźników.

Dlatego, aby lepiej zrozumieć, jak pęcherzyki wydzielnicze w cytoplazmie komórki reagują na zewnątrzkomórkowy stres osmotyczny, zanim komórka zostanie pobudzona do egzocytozy, można zastosować inne uzupełniające metody analityczne w celu wzbogacenia tych informacji. Na przykład, aby zbadać, czy stres osmotyczny zmienia objętość pęcherzyków, można zastosować analizę obrazowania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) do pomiaru wielkości pęcherzyków komórek po utrwaleniu chemicznym. Aby zbadać, czy stres osmotyczny wpływa na wielkość ilościową pęcherzyków, niedawno opracowana technika amperometryczna zwana wewnątrzkomórkową cytometrią elektrochemiczną może być zastosowana do ilościowego oznaczania zawartości neuroprzekaźników pęcherzyków w pęcherzykach wydzielniczych w ich naturalnym stanie, gdy nadal znajdują się w cytoplazmie żywych komórek26. W technice wewnątrzkomórkowej cytometrii elektrochemicznej cylindryczną elektrodę z włókna węglowego nanokońcówkę delikatnie wprowadza się do cytoplazmy żywych komórek i poprzez przyłożenie potencjału +700 mV do tej elektrody (w porównaniu z elektrodą referencyjną Ag/AgCl), zawartość katecholamin w pęcherzykach można określić ilościowo poprzez wykrycie skoku prądu redoks z kolizji pojedynczych pęcherzyków, adsorpcja, a następnie stochastyczne rozerwanie na powierzchni elektrody i uwolnienie w ten sposób ich zawartości na powierzchni elektrody26. W związku z tym, w śladzie prądu amperometrycznego w funkcji czasu, każde pojedyncze pęknięcie pęcherzyka może skutkować stanem przejściowym prądu, a poprzez integrację obszaru każdego bieżącego skoku można obliczyć wielkość kwantową pęcherzyka za pomocą prawa Faradaya.

Dlatego, łącząc informacje ilościowe uzyskane z pomiarów wielkości pęcherzyków za pomocą obrazowania TEM z analizą ilościową wielkości pęcherzyków, zarejestrowaną za pomocą wewnątrzkomórkowej cytometrii elektrochemicznej, można również określić stężenie neuroprzekaźników pęcherzyków. Pozwala to na scharakteryzowanie pęcherzyków, gdy komórki są wystawione na różne warunki osmotyczne i zapewnia lepszy wgląd w to, jak pęcherzyki mogą reagować na zewnątrzkomórkowy stres osmotyczny na etapie przed egzocytozą. Wyniki połączenia tych metod wykazały, że w obecności zewnątrzkomórkowego wysokiego ciśnienia osmotycznego pęcherzyki kurczą się i dostosowują swój rozmiar kwantowy, a porównanie informacji ilościowych na temat względnych zmian z tych pomiarów pokazuje, że podczas kurczenia się pęcherzyki dostosowują swoją zawartość i rozmiar, aby utrzymać stałe stężenie neuroprzekaźników24. Tak więc ta wiedza jest cenna w łączeniu się z obserwacjami poczynionymi na temat uwalniania neuroprzekaźników w komórkach narażonych na stres osmotyczny. W tych protokołach opisujemy zastosowanie tych trzech uzupełniających się metodologii, które pozwalają scharakteryzować, w jaki sposób pęcherzyki wydzielnicze w ich naturalnym środowisku reagują na osmolalność zewnątrzkomórkową i wpływ tej odpowiedzi na proces egzocytozy. Oprócz naszych wcześniejszych obserwacji dotyczących wpływu wysokiego ciśnienia osmotycznego na egzocytozę24, przedstawiamy dodatkowe eksperymenty, które opisują regenerację komórek po szoku osmotycznym oraz efekt wielokrotnych stymulacji barem w komórkach chromochłonnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórek chromochłonnych bydlęcych wyizolowanych przez trawienie enzymatyczne z nadnerczy

  1. Aby wyizolować komórki chromochłonne pobrane z nadnerczy bydła, wysterylizuj komórki 70% roztworem etanolu. Odetnij tłuszcz i tkankę łączną za pomocą skalpela. Aby usunąć krew, przepłukać nadnercza roztworem Locke'a (NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, NaHCO3 3,6 mM, kwas hydroksyetylopiperazynoetanasulfonowy (HEPES) 5,6 mM przy pH 7,4), który termostatowano do 37 °C.
  2. Aby strawić tkankę, należy nadmuchać każdy gruczoł, wstrzykując około 2,5 ml ciepłego, sterylnie przefiltrowanego 0,2% roztworu kolagenazy P przez żyłę nadnerczy za pomocą strzykawki i inkubować tkankę przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Zbadaj gruczoły, aby upewnić się, że proces trawienia rdzenia został zakończony. Tkanka powinna być miękka i nie napięta.
  3. Zbierz strawiony rdzeń, odcinając gruczoły w kierunku wzdłużnym. Zmiel tkankę rdzenia za pomocą skalpela. Przefiltrować zawiesinę tkankową przez stalowe sito i rozcieńczyć roztworem Locke'a do objętości około 50 ml w celu zmniejszenia aktywności kolagenazy P.
  4. Granulować komórki w stężeniu 300 x g w wirówce przez 10 minut w temperaturze pokojowej i zebrać do sterylnych probówek o pojemności 50 ml. Otrzymany osad zawiesić ponownie w 20 ml roztworu Locke'a i przefiltrować roztwór przez sterylną siatkę nylonową o grubości 100 μm do probówek.
  5. Zmieszać zawiesinę komórek chromochłonnych ze sterylnym Percollem (1:1) i odwirować roztwór komórek o sile 18 600 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Zebrać górną warstwę gradientu gęstości i przefiltrować roztwór przez siatkę nylonową o grubości 100 μm do probówek.
  6. Aby wykluczyć Percolla, rozcieńczyć zawiesinę komórek roztworem Locke'a i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed ponownym zawiesieniem osadu w roztworze Locke'a. Szacowana gęstość komórek izolowanej zawiesiny komórkowej wynosi około 4 milionów komórek/ml.
  7. W celu amperometrycznego zapisu egzocytozy i pomiarów cytometrii wewnątrzkomórkowej, płytki komórek chromochłonnych w kolagenie IV pokryły plastikowe szalki o średnicy 60 mm o gęstości około 17,5 × 103 komórki/cm2 i inkubowały komórki w temperaturze 37 °C w środowisku o stężeniu 5% CO2 . Eksperymenty elektrochemiczne należy przeprowadzić w ciągu 1-3 dni od hodowli komórkowej.
  8. W eksperymentach obrazowania TEM umieścić komórki chromochłonne w kolbach do hodowli komórkowych o długości 75cm2 o gęstości 7-8 milionów komórek na kolbę i inkubować w temperaturze 37 °C w środowisku o stężeniu 5% CO2 przez 1 dzień.

2. Eksperymenty z amperometrią egzocytozy pojedynczej komórki24

  1. Aby wytworzyć mikroelektrody z włókna węglowego do tych eksperymentów, weź szklaną kapilarnę o średnicy zewnętrznej odpowiedniej dla uchwytu elektrody na stopniu głowy, który będzie używany w tych eksperymentach. Użyj kapilary ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1,2 mm i średnicy wewnętrznej 0,69 mm.
    1. Podłącz jeden z końców kapilary do rurki do zasysania wody. Umieść włókna węglowe o średnicy 5 μm na czymś, na przykład na kawałku białego papieru, aby poprawić wizualizację.
    2. Zidentyfikuj pojedyncze włókno węglowe i przytrzymaj włókno na jednym końcu palcem, aby utrzymać włókno węglowe na miejscu, jednocześnie umieszczając otwarty koniec kapilary w pobliżu wolnego końca włókna węglowego. Delikatnie zassaj włókno węglowe do szklanej kapilary, tak aby włókno węglowe wystawało przez oba końce kapilary. Odsuń siłę aspiracji.
  2. Umieść kapilarnę z włóknem węglowym w ściągaczu do mikropipet i przeciągnij szklaną kapilarnę do dwóch oddzielnych szklanych końcówek do pipet. Aby odłączyć włókno węglowe, które jest połączone między dwiema szklanymi końcówkami, użyj nożyczek, aby przeciąć włókno węglowe i uzyskać dwie mikroelektrody z włókna węglowego.
  3. Pod mikroskopem umieść włókno węglowe na grubszym szkiełku mikroskopowym, które umożliwia ręczne cięcie włókna węglowego na krawędzi miejsca, w którym włókno wystaje ze szklanej powłoki kapilarnej za pomocą skalpela.
  4. Po przecięciu włókna węglowego, pozostawiając końcówkę z włókna węglowego pokrytą włóknem szklanym, włóż kilka mm końcówki elektrody do roztworu epoksydowego na 10 minut, aby wyciągnąć żywicę epoksydową i uszczelnić ewentualną otwartą przestrzeń między włóknem węglowym a otaczającym szkłem. Powoli wyjmij elektrody z roztworu epoksydowego, aby zapobiec tworzeniu się dużych kropel kleju na końcówce elektrody.
  5. Umieść elektrody na uchwycie (np. drewnianym płaskim patyczku) z dwustronną taśmą samoprzylepną żaroodporną, do której można przymocować elektrody. Piecz elektrody poddane obróbce epoksydowej przez noc w piekarniku w temperaturze 100 °C. Końcówki elektrod łatwo pękają, jeśli zetkną się z powierzchnią, dlatego upewnij się, że elektrody są zawsze bezpiecznie przechowywane za pomocą uchwytu, w którym elektrody są zamocowane na miejscu, a końcówki nie są narażone na dotknięcie.
  6. Aby uzyskać płaską powierzchnię elektrody tarczowej, umieść elektrodę w uchwycie mikroszlifierki i ukosuj każdą elektrodę z włókna węglowego pod kątem 45°. Po ukosowaniu zaznacz kapilarnę na jej górnej stronie za pomocą trwałego markera, aby później dowiedzieć się, jak zlokalizować powierzchnię elektrody krążkowej pod kątem 45° podczas umieszczania elektrody w pobliżu komórek w celu pomiaru egzocytozy.
    UWAGA: Ten krok jest ważny, ponieważ w tych eksperymentach owalna elektroda dyskowa musi być umieszczona płasko na ogniwach, a jej powierzchnia jest równoległa do powierzchni szalki Petriego. Ponadto elektrody do fazowania są wykonywane tego samego dnia, co eksperymenty, aby zapewnić świeżą i czystą powierzchnię elektrody.
  7. Przed użyciem należy umieścić każdą mikroelektrodę z włókna węglowego w roztworze testowym (np. 0,1 mM dopaminy w buforze PBS (pH 7,4)) w celu monitorowania prądu w stanie ustalonym za pomocą cyklicznej woltamperometrii. W przypadku cyklicznego skanowania woltamperometrycznego należy zastosować trójkątny przebieg potencjału od -0,2 V do +0,8 V w porównaniu z elektrodą referencyjną Ag/AgCl przy 100 mV/s, aby zapewnić uzyskanie dobrych danych dotyczących kinetyki reakcji, które są zgodne z teoretycznie obliczonymi wartościami dla mikroelektrody z włókna węglowego o średnicy 5 μm25.
  8. W celu amperometrycznego zapisu egzocytozy należy umieścić szalkę Petriego z hodowanymi komórkami chromochłonnymi pod mikroskopem odwróconym. Ważne jest, aby osłonić mikroskop wyposażony w klatkę Faradaya, aby wyeliminować szum elektroniczny podczas rejestracji amperometrii, ze względu na bardzo małe prądy, które są mierzone. Użyj stopnia grzewczego mikroskopu, aby utrzymać temperaturę 37 °C podczas eksperymentów z komórkami.
  9. Użyj niskoszumowego przyrządu do zaciskania krosowego, aby przyłożyć stały potencjał +700 mV do elektrody roboczej w porównaniu z elektrodą referencyjną Ag/AgCl, która jest również umieszczona na szalce Petriego z dala od elektrody roboczej. Do nagrywania egzocytozy komórek chromochłonnych należy zdigitalizować sygnał przy 10 kHz i zastosować wewnętrzny dolnoprzepustowy filtr Bessela przy 2 kHz, aby przefiltrować nagrany sygnał.
  10. Aby wykonać zapis amperometryczny na pojedynczych ogniwach, zamontuj świeżo ściętą i przetestowaną mikroelektrodę z krążkiem z włókna węglowego w uchwycie elektrody stopnia głowicy, który jest używany z potencjostatem.
    1. Delikatnie umieść elektrodę tak, aby płaska owalna powierzchnia elektrody w kształcie dysku była skierowana w dół w kierunku wierzchołkowej powierzchni ogniwa i umieść elektrodę w kontakcie z błoną komórkową za pomocą mikromanipulatora.
    2. Dostosuj odległość od elektrody do ogniwa, monitorując deformację ogniwa spowodowaną przez elektrodę po umieszczeniu na błonie ogniwa, a następnie ostrożnie cofnij elektrodę na odległość, na którą ogniwo odzyska kształt zbliżony do pierwotnego kształtu ogniwa. Idealnym rozwiązaniem do zapisu kinetycznego i ilościowego jest stworzenie cienkiej warstwy cieczy o grubości stu nanometrów w celu oddzielenia powierzchni elektrody i komórki, które są podobnymi warunkami do postsynaptycznego wykrywania uwalniania substancji chemicznych w synapsie.
  11. Aby pobudzić komórki do egzocytozy, umieść szklaną mikropipetę o średnicy końcówki 2-3 μm, wypełnioną 5 mM roztworem BaCl2 w odległości co najmniej 20 μm od komórki, aby zapobiec wyciekowi roztworu z końcówki pipety w celu wpłynięcia na eksperyment i zastosuj 5-sekundowy impuls iniekcyjny 5 mM roztworu BaCl2 na powierzchni komórki, aby pobudzić komórkę do egzocytozy.
  12. W celu zbadania odwracalnego wpływu ciśnienia osmotycznego na proces egzocytozy należy przygotować izotoniczny roztwór buforowy (150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 5 mM glukozy, 10 mM HEPES, pH 7,4) o ciśnieniu izoosmotycznym 310 mOsm/kg i buforze hipertonicznym otrzymanym przez dostosowanie stężenia NaCl izotonicznego roztworu buforowego o osmolalność odpowiadającą 730 mOsm/kg.
  13. Umieść komórki w buforze izotonicznym i stymuluj komórkę do egzocytozy poprzez zastosowanie impulsu wstrzyknięcia baru, jednocześnie rejestrując amperometryczne stany przejściowe prądu podczas zainicjowanej aktywności egzocytozy przez około 3 minuty.
    1. Aby porównać odpowiedzi egzocytozy w warunkach izotonicznych z warunkami hipertonicznymi, inkubuj komórki przez 10 minut w hipertonicznym roztworze buforowym, a następnie zastosuj impuls wstrzyknięcia baru w celu stymulacji egzocytozy i wykonaj 3-minutowy zapis amperometryczny.
    2. Aby uzyskać odwracalną odpowiedź komórek, ponownie inkubuj komórki przez 10 minut w izotonicznym roztworze buforowym i stymuluj komórki, stosując impuls wstrzyknięcia baru 5s i wykonaj 3 minuty rejestrowania odpowiedzi egzocytozy z komórki.
  14. Jako eksperymenty kontrolne mające na celu określenie wpływu wielokrotnych stymulacji baru na aktywność egzocytozy, należy wykonać amperometryczny zapis uwalniania egzocytozy z trzech kolejnych stymulacji BaCl2 na tej samej komórce umieszczonej w buforze izotonicznym i przy użyciu tego samego protokołu czasowego dla kolejnych eksperymentów inkubacji komórek o różnej osmolarności.

3. Wewnątrzkomórkowa cytometria elektrochemiczna24,26

  1. Aby wytworzyć elektrody do ilościowych pomiarów wielkości pęcherzyków, użyj tych samych materiałów i zacznij przygotowywać elektrodę z włókna węglowego o średnicy 5 μm zgodnie z opisami w sekcjach 2.1 i 2.2 wytwarzania mikroelektrod do amperometrycznych pomiarów egzocytozy.
  2. Pod mikroskopem za pomocą skalpela odciąć włókno węglowe wystające ze szklanej końcówki tak, aby włókno węglowe o długości od 30 do 100 μm pozostało wystające ze szklanej końcówki.
  3. Aby przygotować wytrawioną płomieniem końcówkę elektrody z włókna węglowego, użyj płomienia butanu. Aby uzyskać równomiernie wytrawioną, cylindryczną końcówkę elektrody, przytrzymaj cylindryczną elektrodę z włókna węglowego podczas obracania jej i umieść włókno węglowe wystające ze szkła do niebieskiej krawędzi płomienia butanu, aż końcówka węgla zmieni kolor na czerwony. Często zajmuje to mniej niż 2 sekundy. Jeśli się powiedzie, otrzyma to wytrawioną końcówkę elektrody o średnicy 50-100 nm (obraz SEM takiej końcówki jest pokazany w Rysunek 5B). Po wytrawieniu płomieniowym umieść elektrodę pod mikroskopem, aby ocenić końcówkę elektrody.
  4. Włóż cylindryczną mikroelektrodę nanokońcówki do roztworu epoksydowego na 3 minuty, a następnie zanurz końcówkę elektrody w roztworze acetonu na 15 sekund. Dzięki temu żywica epoksydowa uszczelnia potencjalną szczelinę między włóknem węglowym a ścianą kapilary ze szkła izolacyjnego, podczas gdy aceton usuwa żywicę epoksydową z wytrawionej powierzchni elektrody z włókna węglowego. Aby utwardzić żywicę epoksydową, piecz elektrody w piekarniku przez noc w temperaturze 100 °C.
  5. Przed użyciem należy sprawdzić prąd w stanie ustalonym każdej mikroelektrody z włókna węglowego, jak wyjaśniono w sekcji 2.7 za pomocą woltamperometrii cyklicznej. Do eksperymentów używaj tylko elektrod, które wyświetlają prąd plateau około 1,5-2,5 nA27.
  6. Do pomiarów amperometrii międzykomórkowej umieścić komórki pod mikroskopem, jak opisano w ppkt 2.8 i użyć tych samych ustawień doświadczalnych potencjostatu, jak opisano w ppkt 2.9.
  7. Aby wykonać wewnątrzkomórkowy pomiar amperometryczny i zapobiec znacznemu fizycznemu uszkodzeniu komórki, włóż cylindryczną mikroelektrodę nanokońcówki do komórki, dodając delikatną siłę mechaniczną, tylko tyle, aby przepchnąć elektrodę przez błonę plazmatyczną komórki i do cytoplazmy komórki za pomocą mikromanipulatora.
  8. Po wprowadzeniu i z błoną komórkową uszczelnioną wokół cylindrycznej elektrody, rozpocznij zapis amperometryczny in situ na żywej komórce. Przy potencjale utleniania, który jest przyłożony do elektrody, pęcherzyki adsorbują się na powierzchni elektrody i stochastycznie pękają. W związku z tym nie ma potrzeby stosowania żadnego bodźca, aby zainicjować ten proces.
  9. W celu określenia wpływu osmotycznego na wielkość ilościową pęcherzyka, należy pobrać pomiary cytometrii wewnątrzkomórkowej z grupy komórek, które inkubowano w buforze izotonicznym i hipertonicznym, stosując warunki doświadczalne opisane w sekcji 2.13.

4. Analiza danych z zapisów amperometrycznych

  1. Aby przeanalizować zarejestrowane dane amperometryczne z egzocytozy i analizy ilościowej wielkości pęcherzyków wewnątrzkomórkowych, należy użyć oprogramowania, które umożliwia analizę bieżących stanów nieustalonych w zarejestrowanym śladzie prądu w funkcji czasu, dzięki czemu można określić parametry pików kinetycznych i zintegrowany ładunek całkowity dla poszczególnych pików prądu. Do analizy danych użyliśmy oprogramowania opracowanego w laboratorium firmy Sulzer, które zostało napisane dla programu do analizy danych Igor28.
  2. Analizując skoki amperometryczne, należy wybrać limit progowy dla szczytów wynoszący trzykrotność odchylenia standardowego średniej kwadratowej (RMS) szumu dla każdego nagrania.
  3. Zbierz ręcznie amperometryczne szczyty z każdej komórki, aby zapobiec fałszywym kolcom, które nie są zgodne z kształtem Gaussa, podwójnym kolcom, które mogą być wynikiem połączonych zdarzeń egzocytozy, i akceptuj tylko kolce w kształcie Gaussa o progu trzykrotnie wyższym niż szum RMS.
  4. Zbierz dane dotyczące całkowitego ładunku na pojedynczy pik amperometryczny i użyj prawa Faradaya (N = QnF) do obliczenia molowej ilości neuroprzekaźnika katecholaminy wykrytej na egzocytozę lub wewnątrzkomórkowe pęknięcie pojedynczego pęcherzyka, gdzie N to mole neuroprzekaźników przechodzących reakcję redoks na powierzchni elektrody, Q = całkowity ładunek wykryty pod każdym kolcem, n = liczba elektronów przenoszonych w reakcji redoks (n=2 dla katecholamin), a stała Faradaya F=96485 C/mol.
  5. Przeprowadź analizę statystyczną zebranych danych, obliczając najpierw średni ładunek wykryty na zdarzenie dla każdej komórki. Następnie, aby uzyskać wariancję między komórkami, oblicz średni ładunek między komórkami i użyj testu t studenta między komórkami przy założeniu nierównej wariancji. W badaniu wykorzystano program MATLAB do analizy statystycznej.

5. Obrazowanie TEM do analizy wielkości pęcherzyków

  1. Aby przeprowadzić obrazowanie TEM komórek w różnych warunkach osmotycznych, należy najpierw inkubować komórki w buforze izotonicznym lub hipertonicznym przez 10 minut w temperaturze 37 °C w środowisku 5% CO2 przed chemicznym utrwaleniem komórek.
  2. Wykonaj utrwalanie komórek za pomocą metody utrwalającej Karnovsky'ego29. Stosując tę metodę, inkubować komórki z roztworem zawierającym 0,01% azydku sodu, 1% formaldehydu i 1,25% aldehydu glutarowego, w którym próbka może być przechowywana w temperaturze 4 °C.
  3. Po utrwaleniu przemyć komórki 0,15 M buforem kakodylanu sodu.
  4. Aby wybarwić próbki komórek po utrwaleniu i w ramach przygotowań do obrazowania TEM, należy inkubować komórki z 1% roztworem tetratlenku osmu przez 2 godziny w temperaturze 4 °C, a następnie przez 1 godzinę inkubować w 0,5% roztworze octanu uranylu w temperaturze pokojowej w ciemności.
  5. W ostatnim etapie utrwalania najpierw odwodnić komórki, przepłukując je w 100% etanolu, a następnie przepłukać komórki acetonem.
  6. Zanurzyć próbki komórek w żywicy epoksydowej, a następnie przeprowadzić wirowanie przy 4 000 x g przez 30-40 minut i pozostawić próbkę komórkową do polimeryzacji w temperaturze 40 °C przez 15 godzin, a następnie 48 godzin inkubacji w temperaturze 60 °C.
  7. Przygotowując się do obrazowania, należy podzielić próbkę komórek zatopioną w żywicy Agar 100 na plastry o grubości 60 nm za pomocą ultramikrotomu.
  8. Poddaj komórki działaniu 4% roztworu octanu uranylu/25% etanolu przez 4 minuty, a następnie 20 s płukania wodą. Myj komórki cytrynianem ołowiu Reynoldsa przez 3 minuty, a następnie spłukuj wodą przez 20 sekund.
  9. Wykonaj obrazowanie za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej próbek komórek. W naszych eksperymentach wykorzystaliśmy transmisyjny mikroskop elektronowy, który pracował pod napięciem 120 kV.
  10. Z każdego zarejestrowanego obrazu sekcji komórki ilustrującej ultrastrukturę komórki, która wyświetla populację pęcherzyków w cytoplazmie komórki, najpierw skalibruj rozmiar piksela obrazu, odnosząc piksele do zarejestrowanego paska skali na każdym obrazie TEM. Użyj oprogramowania do obrazowania, aby określić rozmiary pęcherzyków na każdym obrazie komórek wystawionych na warunki izotoniczne lub hipertoniczne. W naszych eksperymentach wykorzystaliśmy oprogramowanie ImageJ do analizy obrazu. Warto zauważyć, że w przypadku analizy obrazowej ultrastruktury komórkowej na podstawie obrazów TEM komórek, należy wziąć pod uwagę dostosowanie wielkości tych pomiarów na podstawie grubości odcinków komórek, które zostały wcześniej opisane przez lab30 Almersa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj protokół, w jaki sposób połączenie obrazowania TEM z dwoma metodologiami elektrochemicznymi, amperometrią włókna węglowego i wewnątrzkomórkową cytometrią elektrochemiczną, może dostarczyć informacji, które zyskują szerszy widok, nawiązując do wpływu zewnątrzkomórkowego ciśnienia osmotycznego na pęcherzyki wydzielnicze i proces egzocytozy. Porównując reprezentatywne amperometryczne zapisy uwalniania egzocytozy w pojedynczych komórkach chromochłonnych przy użyciu zestawu eksperymentalnego (pokazanego na

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tutaj protokół i zalety połączenia trzech uzupełniających się metod analitycznych do analizy pęcherzyków wydzielniczych i procesu egzocytozy, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób siła fizyczna, taka jak ciśnienie osmotyczne, może wpływać na pęcherzyki wydzielnicze i proces egzocytozy w komórkach wydzielniczych. Metody te obejmują amperometrię mikroelektrod z włókna węglowego, która jest uznaną metodą rejestrowania aktywności egzocytozy, wewnątrzkomórkową cytometrię elektrochemiczną, która służy do określania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Szwedzkiej Radzie ds. Badań Naukowych (349-2007-8680) za finansowanie oraz Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, Szwecja) za darowiznę nadnerczy bydlęcych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NaClSigma AldrichS7653
KClSigma AldrichP9333
NaHCO3Sigma AldrichS5761
HEPESSigma AldrichH3375
MgCl2Sigma AldrichM-2670
GlukozaSigma AldrichG8270
Collagenase P Roche, Szwecja11 213 857 001
100-&mikro; M Siatka nylonowaFisher Sientific08-771-19
PercollSigma AldrichP1677
Plastikowa naczynie 60 mm powlekane kolagenem IV WirówkaVWR354416
Avanti J-20XP
Kapilara ze szkła borokrzemianowegoSutter instrument Co., Novato, CA
Ściągacz do mikropipetNarishing Inc., JaponiaPE-21
Roztwory epoksydowe (A i B)Technologia epoksydowa, Billerica, MA
BevellerNarishing Inc.Mikroskop odwrócony EG-400
OlympusIX81
Instrument do zaciskania krosowegoUrządzenia molekularne, Sunnyvale, CAAxopatch 200B
MikromanipulatorBurleigh Instrument Inc., USAPCS-5000
Butan FlameMultiflame AB, Hä sselholm, Szwecja
Transmisyjna mikroskopia elektronowaOmegaLeo 912 AB

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  2. Dunevall, J., et al. Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode. J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).
  3. Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle. Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).
  4. Morris, S., Schultens, H., Schober, R. An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules. Biophys J. 20 (1), 33(1977).
  5. Winkler, H., Smith, A. D. The chromaffin granule and the storage of catecholamines. Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).
  6. Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla. Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).
  7. Estévez-Herrera, J., et al. ATP: The crucial component of secretory vesicles. Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).
  8. Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles. Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).
  9. Toll, L., Howard, B. D. Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles. Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).
  10. Terland, O., Flatmark, T. Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla. FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).
  11. Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells. J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).
  12. Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells. J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).
  13. Daniels, A., Williams, R., Wright, P. The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study. Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).
  14. Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells. J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).
  15. Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions. Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).
  16. Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse. J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).
  17. Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells. Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).
  18. Hampton, R. Y., Holz, R. W. Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis. J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).
  19. Troyer, K. P., Wightman, R. M. Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis. J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).
  20. Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells. Biophys J. 71 (3), 1633(1996).
  21. Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells. J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).
  22. Leszczyszyn, D. J., et al. Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis. J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).
  23. Wightman, R., et al. Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells. P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).
  24. Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -S. Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration. ACS Chemical Neuroscience. , (2017).
  25. Bath, B. D., et al. Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes. Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).
  26. Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes. Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).
  27. Zoski, C. G., Mirkin, M. V. Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes. Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).
  28. Mosharov, E. V., Sulzer, D. Analysis of exocytotic events recorded by amperometry. Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).
  29. Morris, J. K. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).
  30. Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells. Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rejestracja amperometrycznawewn trzkom rkowa cytometria elektrochemicznatransmisyjna mikroskopia elektronowakom rki chromafinnekwantowa wielko p cherzykowastymulacja chlorkiem barubufor izotoniczny

Powiązane artykuły