Analiza komórek odpornościowych w pojedynczych nerwach kulszowych i zwoju korzenia grzbietowego od pojedynczej myszy przy użyciu cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Analiza ilościowa zawartości komórek w mysim nerwie kulszowym jest trudna ze względu na niedostatek tkanki. Protokół ten opisuje metodę trawienia i przygotowania tkanek, która zapewnia wystarczającą ilość komórek do analizy cytometrii przepływowej populacji komórek odpornościowych z nerwów poszczególnych myszy.

Streszczenie

Komórki odpornościowe rezydujące w nerwach w obwodowym układzie nerwowym (PNS) są niezbędne do utrzymania integralności neuronów w zdrowym nerwowo. Urazy i choroby wpływają na komórki odpornościowe PNS, wpływając na funkcjonowanie nerwów i zdolność do regeneracji. Neuronalne komórki odpornościowe są powszechnie analizowane za pomocą immunofluorescencji (IF). Podczas gdy IF jest niezbędny do określenia lokalizacji komórek odpornościowych w nerwie, IF jest tylko częściowo ilościowy, a metoda ogranicza się do liczby markerów, które można analizować jednocześnie, oraz stopnia ekspresji powierzchniowej. W tym badaniu cytometrię przepływową wykorzystano do analizy ilościowej naciekania leukocytów do nerwów kulszowych lub zwojów korzenia grzbietowego (DRG) poszczególnych myszy. Analizę pojedynczych komórek przeprowadzono przy użyciu DAPI, a kilka białek analizowano jednocześnie pod kątem ekspresji powierzchniowej lub wewnątrzkomórkowej. Oba nerwy kulszowe jednej myszy, które były leczone zgodnie z tym protokołem, wygenerowały ≥ 30 000 pojedynczych zdarzeń jądrowych. Proporcja leukocytów w nerwach kulszowych, określona przez ekspresję CD45, wynosiła około 5% całkowitej zawartości komórek w nerwie kulszowym i około 5-10% w DRG. Chociaż protokół ten koncentruje się przede wszystkim na populacji komórek odpornościowych w PNS, elastyczność cytometrii przepływowej do jednoczesnego pomiaru wielu markerów oznacza, że inne populacje komórek obecne w nerwie, takie jak komórki Schwanna, perycyty, fibroblasty i komórki śródbłonka, mogą być również analizowane przy użyciu tej metody. Metoda ta zapewnia zatem nowy sposób badania wpływu ogólnoustrojowego na PNS, takiego jak neurotoksykologia i genetyczne modele neuropatii lub w chorobach przewlekłych, takich jak cukrzyca.

Wprowadzenie

Komórki odpornościowe, które dostają się do PNS z krążenia, zgodnie z definicją ekspresji CD45 i CD11b, pomagają utrzymać integralność nerwu i odgrywają rolę zarówno w regeneracji, jak i zwyrodnieniu¹. Makrofagi (zdefiniowane przez ich ekspresję CD68 u myszy) mogą być przekrzywione w kierunku fenotypu zapalnego, wyrażającego więcej MHC klasy II i CD86 na swojej powierzchni (M1), lub w kierunku fenotypu przeciwzapalnego, wyrażającego więcej wewnątrzkomórkowego CD206 (M2) ². Pochylenie fenotypu makrofagów jest procesem dynamicznym regulowanym przez Akt signaling³, odzwierciedlającym różne zadania makrofagów w obronie przed patogenami (M1) i rolę w regeneracji tkanek (M2). Regeneracja uszkodzonego nerwu wymaga najpierw fagocytozy resztek mieliny przez makrofagi w klasie nerve^4,5, a przeciwzapalne (CD68 ⁺ CD206 ⁺) makrofagi M2 wykazały, że sprzyjają wzrostowi aksonów w klasie PNS⁶. Zmniejszona rekrutacja makrofagów do PNS lub upośledzona zdolność do fagocytozy może skutkować upośledzoną regeneracją i utrzymaniem integralności nerwów. Zapalne makrofagi M1, wykazujące ekspresję MHC klasy II, są mniej zdolne do fagocytozy niż makrofagi M2, a zapalenie neuronów jest związane z patogenezą kilku chorób neurodegeneracyjnych⁷.

Zmiany, które zachodzą w układzie odpornościowym rezydującym w nerwach w wyniku uszkodzenia, mogą być ilościowe, objawiające się utratą leukocytów CD45⁺ (lub zwiększoną infiltracją leukocytów CD45⁺ w przypadku zapalenia), lub jakościowe, takie jak zmiana fenotypu makrofagów z fenotypu M2 na M1. Komórki odpornościowe PNS były tradycyjnie analizowane za pomocą IF, przy użyciu zamrożonych skrawków lub materiału zatopionego w parafinie⁸. IF jest wymagany do określenia lokalizacji komórek będących przedmiotem zainteresowania. Jednak kwantyfikacja za pomocą IF często opiera się na zliczaniu stosunkowo niewielkiej liczby komórek w wąskim wycinku tkanki, co sprawia, że kwantyfikacja jest niewiarygodna i podatna na błąd selekcji. W celu identyfikacji określonych podzbiorów komórek odpornościowych wymagane jest jednoczesne wykrycie markerów zewnątrzkomórkowych i/lub wewnątrzkomórkowych, podczas gdy określenie fenotypu makrofagów wymaga co najmniej dwóch markerów, w szczególności CD206 i MHC klasy II. Ponieważ większość powszechnie dostępnych mikroskopów jest ograniczona do co najmniej dwukolorowych kanałów, takich jak izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) i fikoerytryna (PE), charakterystyka określonych podzbiorów komórek odpornościowych za pomocą IF może być restrykcyjna i niekompletna, co wymaga posiadania wielu preparatów pochodzących z tego samego obszaru zainteresowania, które są barwione i analizowane równolegle. Ten czasochłonny aspekt nie musi zatem nadawać się do analizy dużych zestawów próbek. Ponadto, ponieważ większość interesujących markerów jest pozakomórkowa, wykrywanie w tkance, która została osadzona w parafinie lub kriokonserwowana, może być problematyczne ze względu na zakłócenie integralności błony i maskowanie epitopów, a także utratę interesujących antygenów w wyniku stosowania rozpuszczalników, takich jak aceton i metanol⁹.

Natomiast cytometria przepływowa, która mierzy charakterystyki optyczne i fluorescencyjne pojedynczych komórek w zawiesinie, gdy przechodzą przez wiązkę światła, dostarcza bardziej praktycznych i wszechstronnych metod analizy populacji komórek. Cytometria przepływowa, zamiast tworzyć cyfrowy obraz tkanki, zapewnia automatyczną kwantyfikację ustawionych parametrów, które obejmują względną wielkość komórki i wskaźnik odbicia, określany jako rozproszenie do przodu (FSC), ziarnistość/złożoność wewnętrzną lub rozproszenie boczne (SSC) oraz względną intensywność fluorescencji, pod warunkiem, że komórka została znakowana odpowiednim fluoroforem, takich jak przeciwciało sprzężone. Typowy cytometr przepływowy składa się z dwóch laserów chłodzonych powietrzem; Laser argonowy wytwarza światło niebieskie o długości fali 488 nm, a laser helowo-neonowy wytwarza światło o długości fali 633 nm. Ta kombinacja pozwala na jednoczesne wykrywanie i pomiar co najmniej pięciu celów na powierzchni lub w obrębie przedziału wewnątrzkomórkowego. Bardziej zaawansowane cytometry przepływowe mogą składać się z wielu laserów, które pozwalają na wykrycie do ośmiu różnych fluorochromów jednocześnie, pod warunkiem, że szczytowe długości fal emisji wybranych fluorochromów nie nakładają się znacząco.

Do analizy za pomocą cytometrii przepływowej, interesująca nas tkanka musi najpierw zostać trawiona enzymatycznie, zazwyczaj za pomocą kolagenazy, aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową. Analiza mysich nerwów kulszowych była wcześniej trudna ze względu na niewielką ilość tkanki uzyskanej od każdej myszy. Ponadto wysoka zawartość tłuszczu w mielinie wokół aksonów utrudnia regenerację komórek i wytwarza duże ilości zanieczyszczeń. Opisana w niniejszym dokumencie metoda przygotowania i trawienia nerwu kulszowego została zaadaptowana z protokołu izolacji komórek Schwanna Barrette'a i wsp.⁷, i ma na celu wyizolowanie wystarczającej ilości komórek z nerwów poszczególnych myszy do analizy cytometrii przepływowej, w celu zmniejszenia różnic między myszami. Wykorzystanie DAPI do identyfikacji pojedynczych komórek w trawieniu surowych tkanek pozwala obejść potrzebę usuwania szczątków aksonów, co często prowadzi do utraty komórek. Kilkukrotne mycie buforem bogatym w detergenty pomaga w uwalnianiu komórek uwięzionych w resztkach tłuszczu, zwiększając w ten sposób wydajność. Trawienie obu pełnowymiarowych nerwów kulszowych od jednej myszy zgodnie z tym protokołem generuje ≥30 000 pojedynczych zdarzeń jądrowych, a co najmniej 3 razy więcej zostało pobrane z DRG. Udział leukocytów CD45⁺ wynosił około 5% całkowitej zawartości komórek w trawieniu nerwu kulszowego i około 5-10% w trawieniu DRG. Większość komórek CD45 ⁺ w nerwie kulszowym wykazywała ekspresję markerów makrofagów, CD68 i CD206.

Protokół

Myszy C57BL/6 typu dzikiego (samce; 10-12 tygodni) były trzymane w standardowym 12-godzinnym cyklu światła/ciemności i miały zapewniony swobodny dostęp do standardowej diety i wody. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi przez lokalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania oraz zatwierdzone przez lokalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania przy władzach regionalnych w Karlsruhe w Niemczech (G216/10).

1. Perfuzja myszy

1. Poświęć mysz (C57BL/6; Mężczyźni; 10-12 tygodni) przy użyciu CO₂ lub zgodnie z lokalnymi przepisami.
   UWAGA: Krwawienie zaoczodołowe można wykonać w celu uzyskania leukocytów kontrolnych przy użyciu probówek o pojemności 1,5 ml pokrytych EDTA. Ta metoda krwawienia jest skuteczna tylko bezpośrednio po złożeniu ofiary. Ponadto można przeprowadzić płukanie jamy otrzewnej (PCL) w celu uzyskania makrofagów kontrolnych, używając wstępnie podgrzanego PBS w temperaturze 37 °C, aby uniknąć aglutynacji krwi na zimno, co może utrudniać perfuzję.
2. Zdezynfekuj mysz, spryskując futro na brzuchu obficie etanolem 70% v/v i wielokrotnie przecierając chusteczką bawełnianą gazę. Za pomocą nożyczek rozetnij skórę brzucha przez podłużne nacięcie.
3. Odsłoń jamę opłucnej, wykonując najpierw nacięcie w przeponie za pomocą zakrzywionych, nożyczek, a następnie przedłużając nacięcie na całej długości klatki piersiowej. Wykonaj podobne cięcie po stronie przeciwległej, aż mostek będzie można ostrożnie podnieść.
4. Mając wyraźny widok na serce i główne naczynia, włóż igłę motylkową o rozmiarze 233/4, połączoną ze strzykawką o pojemności 50 ml wypełnioną lodowatym PBS, do lewej komory serca.
5. Wykonaj nacięcie prawego przedsionka serca za pomocą nożyczek do tęczówki, aby stworzyć jak największy ujść bez uszkadzania aorty zstępującej, a następnie delikatnie wciśnij strzykawkę, aby przepchnąć około 30 ml PBS. Wysięk powinien być czysty. Oczyszczenie wątroby i/lub nerek może być wykorzystane jako wskaźnik dobrej perfuzji.

2. Rozwarstwienie nerwu kulszowego i DRG

UWAGA: W celu rozbioru nerwów kulszowych, skóra powyżej pośladka wielkiego jest usuwana, a mysz jest ustawiana brzuszną stroną do dołu, jednocześnie rozciągając dolne kończyny.

1. Obustronnie rozetnij całe nerwy kulszowe, oddzielając tkankę mięśniową od górnej części uda grzbietowego i podążaj za nerwem w górę wzdłuż kręgosłupa. Przeciąć nerw w miejscu, w którym wychodzi z kręgosłupa i bezpośrednio nad kolanem na drugim końcu.
   UWAGA: Unikaj nadmiernego obchodzenia się z nerwem, takiego jak zgniatanie lub ciągnięcie kleszczami.
2. Za pomocą kleszczy przenieś wycięty nerw (nerwy), około 2 cm na nerw, do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml lodowatego PBS i przechowuj na lodzie.
   UWAGA: Nerw może być przechowywany przez noc na lodzie.
   UWAGA: W przypadku rozwarstwienia DRG, za pomocą kleszczy i skalpela, odłącz skórę od leżącej pod nią tkanki miękkiej, delikatnie odrywając pozostałą tylną skórę, aby odsłonić odcinek szyjny, piersiowy i lędźwiowy kręgosłupa. Usuń głowę, przecinając podstawę czaszki za pomocą nożyczek.
3. Przetnij żebra równolegle do kręgosłupa i blisko niego po obu stronach, przed odłączeniem wnętrzności połączonych z przednią stroną kręgosłupa. Przeciąć kości udowe i usunąć kręgosłup przez poprzeczne cięcie na poziomie kości udowych. Za pomocą nożyczek do tęczówki odetnij mięśnie, tłuszcz i inne tkanki miękkie z kręgosłupa.
4. Umieść kręgosłup stroną grzbietową skierowaną do góry i otwórz go, zaczynając od końca ogonowego, wsuwając jedną końcówkę nożyczek do kanału kręgowego w pozycji godziny trzeciej i przecinając kość. Powtórz procedurę na godzinie dziewiątej.
   UWAGA: Ważne jest, aby ciąć dokładnie pośrodku, aby uniknąć uszkodzenia DRG.
5. Powtarzaj cięcie z boku na bok, aż dojdziesz do końca rostralnego, a rdzeń kręgowy zostanie całkowicie odsłonięty. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego usuń rdzeń kręgowy, aby odsłonić nerwy rdzeniowe, które można wykorzystać do zlokalizowania DRG w kręgosłupie.
6. Usuń DRG odcinka lędźwiowego, delikatnie pociągając za korzeń grzbietowy, aby wciągnąć DRG do kanałów kręgowych, a następnie przycinając nerwy i tkankę łączną nożyczkami do tęczówki, aby usunąć DRGs.
   UWAGA: Możliwe jest ograniczenie kolekcji do L4-L6 DRG, które przyczyniają się do nerwu kulszowego.
7. Za pomocą kleszczy przenieś DRG do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej około 1 ml lodowatego PBS i przechowuj na lodzie.
   UWAGA: Nerw może być przechowywany przez noc na lodzie.

3. Trawienie nerwu kulszowego i DRG

1. Przygotować pożywkę wytrawiającą (DMEM, 10 mM HEPES, 5 mg/ml BSA, 1,6 mg/ml kolagenazy typu 4) uzupełnioną 100 μg/ml dezoksyrybonukleazy i przechowywać na lodzie.
   UWAGA: Ilość pożywki trawiącej wymagana na mysz (nerwy kulszowe + DRG) wynosi 1 ml. Po przygotowaniu, porcje pożywki wytrawiającej mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.
2. Przenieś nerwy kulszowe i DRG z jednej myszy do oddzielnych probówek o pojemności 1,5 ml zawierających 500 μl pożywki trawiącej. W przypadku nerwów kulszowych posiekaj materiał na 15-20 kawałków za pomocą nożyczek sprężynowych, a następnie inkubuj zawiesiny tkanek w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 20 minut z delikatnym mieszaniem (≤ 450 obr./min).
3. Kilkakrotnie rozcieraj zawiesinę komórek przez końcówkę pipety o pojemności 1 000 μl, aby mechanicznie zdysocjować niecałkowicie strawioną tkankę.
   UWAGA: Jeśli zawiesina jest trudna do miareczkowania, odetnij końcówkę pipety nożyczkami, aby uzyskać koniec. Inkubować zawiesinę tkankową w temperaturze 37 °C przez 20 minut, delikatnie mieszając (≤ 450 obr./min).
4. Powtórzyć rozcieranie przez końcówkę pipety o pojemności 1 000 μl i inkubować przez kolejne 10 minut w temperaturze 37 °C, delikatnie mieszając (≤ 450 obr./min).
5. Przygotować bufor FACS (PBS uzupełniony 10% FCS i 1 mM EDTA) i przechowywać na lodzie. Wypłukać i namoczyć sito ze stali nierdzewnej o rozmiarze oczek 140 μm z buforem FACS na szalce Petriego o wymiarach 60 x 15 mm na lodzie.
   UWAGA: Należy unikać nylonowych filtrów sitowych, ponieważ prowadzi to do znacznej utraty wydajności komórek jądrzastych.
6. Zawiesiny tkankowe należy kilkakrotnie przepuszczać przez filtr sitowy 140 μm, trzymany nad szalką Petriego, kleszczami, na lodzie. Pobrać zawiesinę komórek z szalki Petriego i przenieść ją do nowej probówki o pojemności 1,5 ml przechowywanej na lodzie.
7. Przepchnąć niecałkowicie strawioną tkankę, która pozostała na filtrze, przez wielokrotne mieszanie za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 μl. Przepłukać dwukrotnie filtr sitowy 500 μl buforu FACS i zebrać powstałą zawiesinę komórek na szalce Petriego, aby połączyć ją z zawiesiną komórek z kroku 3.6.
   UWAGA: Jeśli zastosowany cytometr przepływowy jest wrażliwy na zanieczyszczenia, zawiesinę komórek z kroku 3.7 można przepuścić przez filtr sitowy 70 μm; Może to jednak prowadzić do utraty wydajności komórek jądrzastych.
8. Odwirować zawiesiny komórek w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu FACS. Powtórz ten krok prania raz.
9. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 150-350 μl buforu FACS, w zależności od wymaganej liczby barwienia (150 μl buforu FACS na panel barwienia).

4. Barwienie nerwu kulszowego i DRG fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami do cytometrii przepływowej

1. Przenieś 100 μl zawiesiny nerwu kulszowego lub komórek DRG do studzienki w kształcie litery V w 96-dołkowej płytce na lodzie.
   UWAGA: Pojedynczo barwione komórki są niezbędne dla wszystkich stosowanych przeciwciał, ponieważ zapewnią niezbędne kontrole do ustawienia cytometrii przepływowej w odniesieniu do wzmocnienia napięcia i kompensacji lampy fotopowielacza (PMT), a także pomogą odróżnić wiązanie swoiste od niespecyficznego. Ze względu na ograniczony materiał dostępny z nerwu kulszowego i DRG, leukocyty krwi i makrofagi z PCL (kroki 1.1-1.2) mogą być stosowane jako jednobarwne kontrole, których barwienie powinno być wykonywane równolegle z barwieniem nerwu kulszowego i DRG.
2. Zebrać pozostałe zawiesiny komórek (około 50 μl na próbkę) z nerwów kulszowych lub próbek DRG, aby służyły jako niebarwiona kontrola.
3. Odwirować płytkę przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić supernatant, odwracając płytkę nad pojemnikiem i wykonując gwałtowny ruch nadgarstka, a następnie delikatnie postukać do sucha w ręczniki papierowe.
4. W przypadku barwienia powierzchniowego ponownie zawiesić każdą z osadek komórkowych w 20 μl buforu FACS zawierającego interesujące przeciwciała (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5,5 i MHC klasy II-Biotyna) i inkubować, chroniąc przed światłem, na lodzie przez 30 min.
   UWAGA: (1) Przed użyciem należy określić optymalne rozcieńczenie przeciwciał, wykonując serię rozcieńczeń zgodnie z informacjami o produkcie podanymi przez producenta; (2) Niespecyficzne przebarwienia można zredukować przez inkubację z blokiem Fc na tym etapie, zgodnie z instrukcjami producenta; oraz (3) barwienie kontrolne izotypu na ogół nie jest wymagane w przypadku stosowania przeciwciał pierwszorzędowych bezpośrednio sprzężonych z fluoroforem i/lub gdy antygen (antygeny) będący przedmiotem zainteresowania wytwarza odrębne populacje.
5. Dodać 130 μl buforu FACS do każdej studzienki i odwirować płytkę przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant zgodnie z poprzednim opisem (krok 4.3) i przemyć dwukrotnie granulki komórek 150 μl buforu FACS.
   UWAGA: W przypadku stosowania niesprzężonego przeciwciała pierwszorzędowego lub przeciwciała pierwszorzędowego sprzężonego z biotyną, w tym momencie można dodać odpowiedni odczynnik drugorzędowy, sprzężony z fluoroforem i powtórzyć kroki 4.4-4.5. W przypadku tego protokołu streptawidyna-PE/Cy7 lub Streptawidyna-PerCP została użyta do wykrycia MHC klasy II w połączeniu z CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5 lub w połączeniu odpowiednio z CD68-APC i F4/80-PE/Cy7.
6. W celu utrwalenia, po ostatnim etapie mycia, ponownie zawiesić granulki komórek w 100 μl 4% paraformaldehydu w PBS (pH 7,4). Inkubować płytkę na lodzie przez 10 minut, a następnie odwirowywać przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant w sposób poprzednio opisany (krok 4.3) i przemyć osadki komórek raz 150 μl buforu FACS.
   Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny; Nosić odpowiednie środki ochrony, takie jak rękawice i okulary itp.
   UWAGA: Zawiesić granulki komórek w 150 μl bufora FACS i przechowywać w chronionym przed światłem w temperaturze 4°C przez okres do dwóch dni. Jeżeli barwienie wewnątrzkomórkowe nie jest wymagane, należy przejść do kroku 4.11 po odwirowaniu płytki w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
7. W przypadku barwienia wewnątrzkomórkowego ponownie zawiesić osady komórkowe w 150 μl buforu FACS + 0,5% detergentu i inkubować w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem przez 15 minut. Odwirować płytkę przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant zgodnie z poprzednim opisem (krok 4.3) i przemyć osad komórkowy raz 150 μl buforu FACS + 0,5 % detergentu. Zawiesić osad komórkowy w 20 μl buforu FACS + 0,5% detergentu zawierającego interesujące przeciwciała (CD68-APC, CD206-PE) i inkubować, chroniony przed światłem, w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
8. Dodać 130 μl buforu FACS + 0,5% detergentu do każdej studzienki i odwirować płytkę o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant zgodnie z poprzednim opisem (krok 4.3) i dwukrotnie przemyć osady komórek 150 μl buforu FACS + 0,5 % detergentu.
   UWAGA: W przypadku stosowania niesprzężonego przeciwciała pierwszorzędowego lub przeciwciała pierwszorzędowego sprzężonego z biotyną, w tym momencie można dodać odpowiedni odczynnik drugorzędowy, sprzężony z fluoroforem i powtórzyć kroki 4.9-4.10.
9. Zawiesić osady komórkowe w 150 μl buforu FACS + 0,5% detergentu i przechowywać w temperaturze 4 °C przed światłem przez okres do dwóch dni.
10. Zawiesić osady komórkowe za pomocą 150 μl buforu FACS + 0,5% detergentu uzupełnionego 5 μg/ml DAPI i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Odwirować płytkę o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant w sposób opisany wcześniej (krok 4.3).
11. Ponownie zawiesić granulki komórkowe w 150 μl PBS i przenieść do odpowiednio oznakowanej probówki FAC. Przechowywać w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem, do czasu przygotowania do analizy.
    UWAGA: Po ponownym zawieszeniu w PBS komórki powinny zostać przeanalizowane w ciągu kilku godzin, ponieważ DAPI będzie powoli oddzielać się od DNA, prowadząc do utraty sygnału.

5. Konfiguracja cytometrii przepływowej i przebieg próbek

1. Upewnij się, że cytometr przepływowy jest wyposażony w odpowiednie lasery i/lub zestawy filtrów do pomiaru fluoroforów używanych do barwienia komórek. Można to określić w domyślnej konfiguracji cytometru w systemie. W przypadku tego protokołu komórki analizowano za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w trzy lasery (405 nm, 488 nm i 633 nm) pozwalające na wykrycie ≤ 5 fluoroforów.
2. Wybierz odpowiednie kanały do wykrywania interesujących Cię fluoroforów. Wszystkie sygnały fluorescencyjne są najlepiej wykrywane za pomocą wzmocnienia logarytmicznego.
3. Należy wybrać odpowiednie natężenie przepływu dla próbek. Parametr ten może się różnić w zależności od zastosowanego systemu i powinien być określony empirycznie. W przypadku tego protokołu zastosowano natężenie przepływu MED-to-HI (35-60 μL/min), aby zapobiec zatykaniu się igły.
4. Wybierz łączną liczbę zdarzeń/komórek, które mają zostać zebrane w próbce. Minimalna liczba zdarzeń powinna wynosić 1 000 000.
5. Utwórz wykresy punktowe w globalnym arkuszu roboczym SSC-A i FSC-A, a także dla każdego fluoroforu będącego przedmiotem zainteresowania w porównaniu z FCS-A. Utwórz widok statystyczny, który będzie wyświetlał liczbę zdarzeń i średnią intensywność fluorescencji (MFI) dla wybranych fluoroforów.
6. Ustaw napięcie kanałów FSC-A i SSC-A w taki sposób, aby najmniejsze komórki mieściły się w lewym dolnym rogu wykresu punktowego. Określ fluorescencję tła i minimalną fluorescencję próbki z niebarwionych kontroli z nerwów kulszowych lub DRG. Wyznacz bramkę nadrzędną (P1) na podstawie wykresu punktowego z kontroli barwienia tylko DAPI.
   UWAGA: Nie jest to brama zbiorcza, częściowo ze względu na niejednorodny charakter populacji DAPI+ w PNS.
7. Korzystając z wykresów punktowych FSC dla każdego z interesujących fluoroforów, dostosuj napięcia tak, aby komórki niebarwionej kontroli mieściły się w dolnej ćwiartce odpowiednich wykresów punktowych. Bramki są następnie tworzone nad tym obszarem, aby zdefiniować te komórki, które są dodatnie dla każdego z odpowiednich markerów/fluoroforów. Umieszczenie bramy potwierdza się poprzez uruchomienie jednobarwnego elementu sterującego (krok 4.1).
   UWAGA: Kompensacja nakładających się widm emisji może być przeprowadzona w tym momencie lub zastosowana retrospektywnie za pomocą odpowiedniego oprogramowania analitycznego.
8. Po ustawieniu cytometru przepływowego, zgodnie z opisem, próbki można uruchomić.
9. Po zakończeniu pracy pozostały materiał próbki można wyrzucić, a pliki FCS można wyeksportować do dalszej analizy.

Wyniki

Zawiesiny komórek z obu pełnej długości nerwów kulszowych i wszystkich głównych DRG zostały przygotowane, zgodnie z protokołem, z sześciu zdrowych myszy C57BL/6 i podzielone na trzy równe porcje do barwienia. Barwienie przeciwprądowe za pomocą DAPI, które barwi DNA, pozwala na wykrycie pojedynczej populacji komórek (Rysunek 1A-B, górny panel). Wypłukanie DAPI, przed analizą za pomocą cytometrii przepływowej, zmniejszyło do pewnego stop...

Dyskusja

Nerwy kulszowe zawierają dużą ilość lipidów, takich jak cholesterol, ze względu na zawartość mieliny wokół aksonów. Ponieważ właściwości lipidów zmieniają się wraz z temperaturą, w różnych temperaturach można uzyskać różne wyniki. Aby zapewnić zachowanie komórek, wszystkie etapy tego protokołu po trawieniu zostały przeprowadzone na lodzie. Podczas gdy ze względu na powtarzalność wyników zaleca się spójność, możliwe jest zwiększenie plonu poprzez wykonanie kroków 3.6 i 3.7 w temperaturze pokojowej. Jeśli nerwy w kroku 3.8...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
C57BL/6 Mysz	Charles River	C57BL/6NCrl
DMEM (+1g/L glukozy, glutamina, pirogronian)	Thermo	31885023	Źródło tego materiału nie jest ważne
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Kolagenaza typu 4	Worthington Biochemical Corp., Stany Zjednoczone
Deoksyrybonukleaza (DNaza) I z trzustki bydła I	Sigma-Aldrich	DN25-1g
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758
Surowica cielęca płodu (FCS), inaktywowana termicznie	Sigma-Aldrich	F4135
Przeciwciało przeciwko CD11b-PerCP/Cy5.5	Biolegend	101228	Klon M1/70
Przeciwciało przeciwko MHC klasy II, biotynylowane	Biolegend	107603	Clone M5/114.15.2
Przeciwciało przeciwko CD45-A647	Biolegend	107603	Klon 30-F11
Przeciwciało przeciwko CD68-APC	Biolegend	137007	Klon FA/11
Przeciwciało przeciwko CD206-PE	Biolegend	141706	Klon C068C2
Przeciwciało przeciwko F4/80-PE/Cy7	Biolegend	123113	Klon BM8
Streptawidyna-PE/Cy7	Biolegend	405206	Służy do wykrywania MHCII-biotyny za pomocą CD45-A647 i CDllb-PerCP/Cy5.5
Streptawidyna-PerCP	Biolegend	405213	Służy do wykrywania MHCII-biotyny za pomocą CD68-APC i F4/80-PE/Cy7
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Rozcieńczyć w PBS do 50x i przechowywać w temperaturze 4 & deg; C w ciemności
Sito dysocjacji komórek - zestaw do rozdrabniania tkanek	Sigma-Aldrich	CD1
V-kształtne, 96-dołkowe płytki	Greiner/Sigma	M8185
5ml probówka okrągłodenna z polityrenu, 12x75mm	BD Biosciences	352008
szalka Petriego 60x15mm	Greiner/Sigma	Z643084
BD LSR II BD	Biosciences