Artykuł metodologiczny

Wizualizacja rozgałęzień aksonów wzgórzowo-korowych i tworzenia synaps w kokulturach organotypowych

DOI:

10.3791/56553

⸱

28 marca 2018

 , 
1Department of Medical Neuroscience, Graduate School of Medical Sciences, Kanazawa University, 2Neuroscience Laboratories, Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę jednoczesnego obrazowania rozgałęzień aksonów wzgórza i tworzenia synaps w organotypowych kokulturach wzgórza i kory mózgowej. Poszczególne aksony wzgórzowo-korowe i ich zakończenia presynaptyczne są wizualizowane za pomocą techniki elektroporacji pojedynczej komórki z synaptofizyną znakowaną DsRed i GFP.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozgałęzianie aksonów i tworzenie synaps są kluczowymi procesami dla tworzenia precyzyjnych obwodów neuronalnych. Podczas rozwoju aksony czuciowe wzgórzowo-korowe (TC) tworzą gałęzie i synapsy w określonych warstwach kory mózgowej. Pomimo oczywistej korelacji przestrzennej między rozgałęzianiem się aksonów a tworzeniem synaps, związek przyczynowy między nimi jest słabo poznany. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy niedawno metodę jednoczesnego obrazowania rozgałęzień i tworzenia synaps poszczególnych aksonów TC w kokulturach organotypowych.

Ten protokół opisuje metodę, która składa się z połączenia kokultury organotypowej i elektroporacji. Organotypowe kokultury wzgórza i kory mózgowej ułatwiają manipulację genami i obserwację procesów aksonalnych, zachowując charakterystyczne struktury, takie jak konfiguracja laminarna. Dwa odrębne plazmidy kodujące DsRed i synaptofizynę znakowaną EGFP (SYP-EGFP) zostały połączone z transfekcją do niewielkiej liczby neuronów wzgórzowych za pomocą techniki elektroporacji. Metoda ta pozwoliła na jednoczesną wizualizację poszczególnych morfologii aksonalnych neuronów TC i ich miejsc presynaptycznych. Metoda umożliwiła również długoterminową obserwację, która ujawniła związek przyczynowo-skutkowy między rozgałęzianiem się aksonów a powstawaniem synaps.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projekcja korowo-wzgórzowa (TC) w mózgu ssaków jest odpowiednim systemem do badania mechanizmów naprowadzania aksonów i celowania. Podczas rozwoju aksony czuciowe TC rosną w płytce korowej i tworzą gałęzie i synapsy preferencyjnie w warstwie IV podstawowych obszarów czuciowych w korze mózgowej1,2. Nawet po ustanowieniu podstawowych połączeń, altanki aksonalne i zakończenia synaptyczne są przebudowywane w zależności od zmian środowiskowych3,4. Jednak sposób, w jaki morfologia aksonów TC jest dynamicznie zmieniana, jest słabo poznany. Jednym z głównych powodów jest brak odpowiedniej techniki obserwacji zmian strukturalnych na poziomie pojedynczej komórki. Chociaż ostatnie osiągnięcia w mikroskopii, takie jak mikroskopia dwufotonowa, umożliwiły bezpośrednią obserwację żywych neuronów korowych in vivo, nadal istnieją ograniczenia techniczne w rejestrowaniu ogólnych trajektorii TC5,6. W związku z tym metody in vitro do obrazowania na żywo aksonów TC dostarczyłyby potężnych narzędzi do analiz strukturalnych rozgałęziania się aksonów i tworzenia synaps.

Nasza grupa po raz pierwszy ustaliła metodę statycznej hodowli plastrów z przepuszczalną membraną7. Korzystając z tej metody, wycinek kory mózgowej szczura został poinstruowany z sensorycznym blokiem wzgórza, a połączenia TC specyficzne dla blaszek zostały zrekapitulowane w tych organotypowych kokulturach7,8. Rzadkie znakowanie białkiem fluorescencyjnym pozwoliło nam dodatkowo zaobserwować wzrost aksonów TC i tworzenie się gałęzi9,10,11. Niedawno opracowaliśmy nowatorską metodę jednoczesnego obrazowania rozgałęzień i tworzenia synaps poszczególnych aksonów TC w organotypowych kokulturach12. Aby jednocześnie uwidocznić aksony TC i miejsca presynaptyczne, DsRed i synaptofizyna znakowana EGFP (SYP-EGFP) zostały połączone z transfekcją do niewielkiej liczby neuronów wzgórzowych przez elektroporację kokultury organotypowej. Obecna metoda ułatwia analizę morfologiczną aksonów TC i pozwala na długotrwałą obserwację, która może być wykorzystana do wykazania związku przyczynowego między rozgałęzianiem się aksonów a powstawaniem synaps.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez komitety ds. dobrostanu zwierząt Uniwersytetu w Osace i Japońskiego Towarzystwa Neurologicznego.

1. Organotypowe kokultury wzgórza i kory mózgowej

Uwaga: Szczegółową procedurę można znaleźć w oryginalnych publikacjach7,8,13. Wszystkie zabiegi powinny być wykonywane w sterylnych warunkach. Szczury Sprague-Dawley (SD) są wykorzystywane do hodowli neuronów.

  1. Preparaty odczynników
    nuta: Objętości poniższych odczynników dotyczą jednego mózgu szczura.
    1. Przygotuj 10x zmodyfikowany suplement N213: Insulina (50 μg/mL), progesteron (200 nM), hydrokortyzon (200 nM), selenin sodu (300 nM), transferyna (1 mg/ml), putrescyna (1 mM), glukoza (60 mg/mL)
    2. Przygotuj pożywkę hodowlaną zawierającą surowicę (10 ml): 85% DMEM/F12, 10% 10x zmodyfikowany suplement N2, 5% płodowa surowica bydlęca (FBS)
    3. Przygotuj pożywkę hodowlaną bez surowicy (20 ml): 90% DMEM/F12, 10% 10x modyfikowany suplement N2
    4. Przygotuj roztwór kolagenu z ogona szczura (0,5 ml). Krótko mówiąc, weź delikatne włókna z ogona szczura w sterylnych warunkach i inkubuj przez noc w roztworze kwasu octowego. Po odwirowaniu zebrać supernatant (kilka mg/ml) i przechowywać w lodówce13.
  2. Przygotowanie potraw kulturowych
    1. Umieścić wkład membranowy na szalce Petriego o średnicy 35 mm.
    2. Dodaj 40 - 50 μl roztworu kolagenu z ogona szczura do błony i rozprowadź roztwór kolagenu wokół środka.
    3. Całkowicie wysuszyć membranę na powietrzu w czystej ławce.
    4. Umieść 1,5 - 2 ml pożywki hodowlanej zawierającej surowicę do naczynia, tak aby membrana była nasączona pożywką.
    5. Umieścić naczynie hodowlane w inkubatorze (37 °C, nawilżone 95% powietrza i 5% CO2 ) przed posiewem.
  3. Przygotowanie plastrów kory mózgowej
    1. Sterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne 70% etanolem przez 10 minut lub dłużej.
    2. Szybko wypreparuj cały mózg od dnia poporodowego (P) 2 szczura w lodowatej narkozy (zanurzonego w wiórach lodowych na kilka minut).
    3. Umieść mózg na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 100 ml zimnego zbilansowanego roztworu soli Hanksa.
    4. Usuń materię pia z mózgu za pomocą cienkich kleszczy i odetnij plasterki kory mózgowej (o grubości 300 - 400 μm) z kory wzrokowej i somatosensorycznej za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych (szczegóły patrz Rysunek 1).
      nuta: Grubość wycinków korowych jest z grubsza szacowana przez skalę siatek pod mikroskopem lornetkowym.
      nuta: Alternatywnie, plastry korowe można wykonać za pomocą wibratomu w sterylnych warunkach.
    5. Przenieś kilka plasterków kory mózgowej na wkładkę membranową za pomocą jednorazowej plastikowej pipety.
    6. Dostosuj położenie plastrów w pobliżu środka wkładki hodowlanej za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura (szczegółowe informacje można znaleźć w 8,13) i usuń nadmiar pożywki z wkładki.
      nuta: Dostosuj poziom pożywki nieco poniżej powierzchni plastrów, tak aby plastry mogły otrzymać wystarczający dopływ zarówno gazu, jak i pożywki. Ma to kluczowe znaczenie dla żywotności komórek.
    7. Utrzymywać plastry w pożywce hodowlanej zawierającej surowicę w temperaturze 37 °C w środowisku nawilżonym 95% powietrzem i 5% CO2 oraz hodować same warstwy przez jeden dzień przed pobraniem bloku wzgórza i umieszczeniem go obok niego.
  4. Przygotowanie bloków wzgórzowych
    1. Sterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne 70% etanolem przez 10 minut lub dłużej.
    2. Znieczulić ciężarną szczurkę (15. dzień zarodka) przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu (50 mg/kg) zawierającego środek znieczulający.
    3. Wypreparuj każdy zarodek z rogów macicy i umieść zarodki na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 100 ml zimnego roztworu soli Hanksa.
    4. Pod mikroskopem dwuokularowym usuń mózg z każdego zarodka i przetnij bloki wzgórza, które zawierają głównie kompleks brzuszny i jądro kolankowate boczne (około 0,5 mm x 3)7 za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych (patrz Ryc. 1).
  5. Hodowla i utrzymanie współkultur organotypowych
    1. Za pomocą pipety Pasteura umieść blok wzgórzowy obok powierzchni komory wycinka korowego, który został umieszczony na filtrze membranowym.
    2. Utrzymywać kokultury w pożywce zawierającej surowicę w temperaturze 37 °C w środowisku nawilżonego 95% powietrza i 5%CO2.
    3. Po dwóch dniach w hodowli wymień połowę pożywki na pożywkę hodowlaną bez surowicy. Następnie wymieniaj pożywkę co 2 - 3 dni.
      nuta: Poziom pożywki należy sprawdzić po wymianie pożywki, ponieważ jest to ważne dla przeżycia komórki.

2. Elektroporacja

Wszystkie procedury powinny być wykonywane w sterylnych warunkach.

Uwaga: Wykonaj elektroporację dzień po przygotowaniu bloków wzgórza, aby zapobiec ich oderwaniu.

  1. plazmidy
    1. Wykonać mieszaninę plazmidów w następujący sposób: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3,5 μg/μL.
      nuta: Oczyść oba plazmidy za pomocą zestawu Maxiprep bez endotoksyn i rozpuść w zrównoważonym roztworze soli Hanksa.
  2. Konfiguracja sprzętu do elektroporacji
    Przyrządy elektryczne, takie jak stymulator i izolator, powinny być podłączone, jak pokazano na rysunku Rysunek 2.
    1. Podłącz stymulator do izolatora dwufazowego.
    2. Podłącz elektrodę (srebrny drut o średnicy 0,2 mm) do ujemnego zacisku izolatora.
    3. Podłącz elektrodę (srebrny drut o średnicy 1 mm) szeregowo do rezystora 100 Ω i dodatniego zacisku izolatora.
    4. Podłącz amplifier do oscyloskopu, aby monitorować, czy prąd elektryczny przepływa przez rezystor, mierząc napięcie za pomocą wzmacniacza.
  3. Przygotowanie pipet szklanych
    Uwaga: Do wyrzucania roztworu plazmidu i stosowania impulsów elektrycznych stosuje się dwa rodzaje pipet szklanych.
    1. Wykonaj pipety ze szklanych kapilar za pomocą ściągacza do elektrod.
    2. Złamać końcówkę pipety wyrzutowej (średnica końcówki powinna wynosić 20 - 50 μm).
    3. Zmielić i wypolerować końcówkę pipety elektrody papierem ściernym, a następnie wypolerować ogniowo (średnica wewnętrzna powinna wynosić 50 - 200 μm).
      nuta: Końcówka elektrody powinna być płaska i gładka, ponieważ bezpośrednio dotyka tkanki.
  4. Procedura elektroporacji
    1. Podłącz pipety wyrzutowe i elektrodowe do manipulatorów.
    2. Włóż srebrny drut (o średnicy 0,2 mm) do pipety elektrody.
    3. Podłączyć pipetę wyrzutową do strzykawki o pojemności 1 ml z plastikową rurką.
    4. Pobrać >5 μl roztworu plazmidu do pipety eżekcyjnej przez odsysanie strzykawki.
    5. Umieścić kokulturę na stoliku do elektroporacji i włożyć elektrodę o średnicy 1 mm do pożywki hodowlanej.
    6. Umieść pipetę wyrzutową na eksplantacie wzgórzowym.
    7. Wcisnąć strzykawkę ręcznie po tym, jak końcówka dotknie powierzchni bloku wzgórzowego.
      nuta: Zwykle stosuje się około 0,5 μl roztworu plazmidu na jeden blok wzgórza.
    8. Umieścić pipetę elektrodową na bloku wzgórza natychmiast po wycofaniu pipety wyrzutowej.
    9. Dostarczanie impulsów elektrycznych (50 - 400 μA, 3 do 5 ciągów po 200 impulsów kwadratowych o czasie trwania 1 ms przy 200 Hz). Monitoruj amplitudę i liczbę pociągów na oscyloskopie.
      nuta: Amplituda prądów elektrycznych zależy od wewnętrznej średnicy pipety elektrodowej13.
    10. Wycofaj pipetę elektrodową i włóż naczynie z powrotem do inkubatora.
  5. Obserwacja mikroskopowa
    1. Umieść szalkę hodowlaną na mikroskopowym stoliku pionowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w dwa zestawy filtrów dla EGFP (wzbudzenie, 488 nm; emisja, 515 nm) i DsRed (wzbudzenie, 514 nm; emisja, 565 nm).
    2. Rób zdjęcia 10 - 25 sekcji optycznych w rozmiarach co 1 - 7 μm za pomocą soczewki obiektywowej o 20-krotnej odległości roboczej. Wybierz indywidualnie rozróżnialne znakowane aksony, które wyrażają zarówno DsRed, jak i SYP-EGFP.
      nuta: Obserwowany obszar wynosi około 0,7 x 0,7 mm (co odpowiada 1024 x 1024 pikselom, czyli 0,68 μm/piksel).
    3. Rób zdjęcia co 24 godziny w celu codziennego obrazowania. Zakończyć w ciągu 10 minut w temperaturze pokojowej i wrzucić kultury z powrotem do inkubatora. W przypadku obrazowania poklatkowego w krótkich odstępach czasu należy przechowywać kulturę w komorze hodowlanej, która utrzymuje środowisko nawilżonego 95% powietrza i 5%CO2 w temperaturze 37 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj eksperyment ma na celu odkrycie związku między rozgałęzianiem aksonów TC a powstawaniem synaps. Aby jednocześnie uwidocznić trajektorie aksonów i lokalizacje miejsc presynaptycznych, pojedyncze lub kilka komórek wzgórza w organotypowych kokulturach transfekowano dwoma plazmidami kodującymi SYP-EGFP i DsRed za pomocą elektroporacji. W drugim tygodniu hodowli indywidualnie rozróżnialne aksony TC zostały wyraźnie oznaczone przez DsRed (Ryc. 3). Do obserwacji...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół jest również potężnym narzędziem do badania rozwojowych aspektów wzrostu aksonów innych niż projekcja TC11. Na przykład połączenie hodowli warstw korowych i techniki elektroporacji pozwala na wizualizację indywidualnej morfologii aksonalnej neuronów korowych i długoterminową obserwację 9,18.

Korzystając z obecnego protokołu, role interesujących genów w rozgałęzianiu aksonów i tworzeniu synaps mog...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez MEXT KAKENHI na temat innowacyjnych obszarów, mezoskopowych obwodów neurologicznych 23115102 i dynamicznej regulacji funkcji mózgu przez Scrap and Build System 16H06460 do N.Y. Dziękujemy również Gabrielowi Handowi za krytyczną lekturę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM/F12GIBCO11320-033
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)Nissui5905
Surowica bydlęca płodu (FBS)Thermo ScientificSH30396-03
HyklonInsulina SigmaI6634
ProgesteronSigmaP8783
HydrokortyzonSigma& nbsp;H0888
Selenin soduWako Pure
Chemical Industries		192-10843
Transferyna SigmaT1147
Putrescyna SigmaP5780
GlukozaWako
Pure Chemical Industries		16806-25
35 mm szalki PetriegoFalcon351008
Millicell-CMWkładka MilliporePICMORG50
100 mmszalki Petriego BIO-BIKI-90-20szalka Petriego sterylna
HiPure Plasmid Maxiprep KitInvitrogen
Jednorazowe sterylne pipety plastikowe Pipety202-ISsterylne
Kapilara szklana: OD 1,2 mmNarishige  G-1,2średnica wewnętrzna, 1,2 mm
Drut srebrny: 0,2 i 1 mm NilacoAG-401265 (średnica, 0,2 mm), AG-401485 (średnica, 1,0 mm)
Strzykawka 1 mlTerumoSS-01T
 A.M.P.IMaster 8
 BSI-2firmy BAK ELECTRONICS
 Systemy AMModel 1800
OscyloskopHitachiVC-6723
ManipulatorNarishigeSM-15
MikromanipulatorNarishigeMO-10
Mikroskop stereoskopowy OlympusSZ40
Stojak uniwersalny OlympusSZ-STU2
 Ściągacz elektrod OlympusLG-PS2, LG-DI, HLL301
 NarishigePC-10
NikonDigital eclipse C1 laser
x20 obiektywNikonELWD 20x/0.45
Komorahodowlana Tokai HitUK A16-U
Sprague-Dawley (SD) szczurJaponia SLC i Nihon-Dobutsu
Nożyczki mikrochirurgiczneNatsume MB-54-1
K210006 transferowe Stymulator Izolator dwufazowy Wzmacniacz System oświetlenia świetlnego Mikroskop konfokalny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).
  2. Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical development: how are we going to get there. Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).
  3. Espinosa, J. S., Stryker, M. P. Development and plasticity of the primary visual cortex. Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).
  4. Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3 (8), 272(2005).
  5. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
  6. Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. Dendritic spine dynamics. Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).
  7. Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
  8. Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations. Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).
  9. Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures. J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).
  10. Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching. J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).
  11. Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices. Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).
  12. Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity. Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).
  13. Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures. Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).
  14. Molnar, Z., Blakemore, C. Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture. Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).
  15. Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).
  16. Yamamoto, N., et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).
  17. Yamamoto, N., et al. Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons. J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).
  18. Ohnami, S., et al. Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching. J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).
  19. Yamada, A., et al. Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Organotypowa kokulturatechnika elektroporacjimikroskopia konfokalnaznakowanie DsRedtagowanie Syp EGFPmorfologia aksonalnaformowanie obwod w neuronalnychhodowla skrawk w kory m zgowej

Powiązane artykuły