Ten protokół opisuje użycie hodowanych Aorta-Gonad-Mesonephros do analiz ekspresji, jednostek tworzących kolonie w hodowli i śledzionie oraz długoterminowej rekonstytucji w celu określenia wpływu czynników regulacyjnych i szlaków sygnałowych na rozwój hematopoetycznych komórek macierzystych. Wykazano, że jest to skuteczny system do badania biologii i funkcji krwiotwórczych komórek macierzystych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zastosowanie systemu hodowli eksplantatów Aorta-gonad-mesonephros w hematopoezie rozwojowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ograniczeniem używania embrionów myszy do badań hematopoezy jest dodatkowa niedogodność w operacjach, która jest w dużej mierze spowodowana wewnątrzmacicznym rozwojem zarodka. Chociaż dane genetyczne od myszy z nokautem (KO) są przekonujące, nie jest realistyczne generowanie myszy KO dla wszystkich genów w razie potrzeby. Ponadto przeprowadzanie eksperymentów ratowniczych in vivo w celu konsolidacji danych uzyskanych od myszy KO nie jest wygodne. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano hodowlę eksplantatów Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) jako odpowiedni system do badania rozwoju hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC). Szczególnie w przypadku eksperymentów ratunkowych może być stosowany do odzyskiwania upośledzonej hematopoezy u myszy KO. Dodając odpowiednie substancje chemiczne do pożywki, można reaktywować upośledzoną sygnalizację lub zahamować szlaki regulowane w górę. Za pomocą tej metody można przeprowadzić wiele eksperymentów w celu zidentyfikowania krytycznych regulatorów rozwoju HSC, w tym ekspresji genów związanych z HSC na poziomie mRNA i białka, zdolności do tworzenia kolonii i zdolności do rekonstytucji. Ta seria eksperymentów byłaby pomocna w zdefiniowaniu mechanizmów leżących u podstaw rozwoju HSC u ssaków.
Wprowadzenie
Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) to specyficzne tkankowo dorosłe komórki macierzyste, które posiadają potencjał wieloliniowy, w tym komórki erytroidalne, szpikowe i limfoidalne, a także zdolność do samoodnawiania się. Ostatnie badania wykazały, że najwcześniejsze HSC powstały z wyspecjalizowanej populacji śródbłonka, znanej jako śródbłonek hemogenny (HE), poprzez przejście śródbłonka do układu krwiotwórczego (EHT) na brzusznej ścianie aorty grzbietowej1,2,3,4. Po utworzeniu w regionie aorta-gonad-mesonefrost (AGM) od embrionalnego (E) 10,5 do E12,5 w zarodku myszy, HSC będą migrować do wątroby płodu w celu ekspansji i ostatecznie skolonizują szpik kostny, aby utrzymać dorosłą hematopoezę przez całe życie danej osoby5,6. Chociaż jest to badane od wielu lat, mechanizmy leżące u podstaw powstawania i rozwoju HSC pozostają nie w pełni poznane.
W przeciwieństwie do zapłodnienia in vitro i rozwoju zarodków danio pręgowanego, wewnątrzmaciczny rozwój zarodków myszy sprawia, że badanie ostatecznej hematopoezy podczas embriogenezy jest znacznie bardziej niewygodne. Chociaż eksperymenty genetyczne z użyciem myszy z nokautem (KO) są powszechnie stosowane, brak niektórych myszy KO również ogranicza ich zastosowanie w dziedzinie badań krwiotwórczych. Ponadto eksperymenty ratunkowe in vivo nie są łatwe do przeprowadzenia na myszach KO. Od 1996 roku hodowla eksplantatów AGM jest opracowywana do badań krwiotwórczych przez pionierów w tej dziedzinie7. Za pomocą tego systemu hodowli zidentyfikowano, że tkanki brzuszne regionu AGM promują aktywność HSC, podczas gdy tkanki grzbietowe wywierają odwrotny efekt8,9. System hodowli eksplantatów AGM został również zastosowany do określenia ról sygnalizacji serotoniny, Mpl, SCF, BMP i Hedgehog w rozwoju HSC10,11,12,13,14. Co ważne, jest to również popularna metoda stosowana do ratowania wad krwiotwórczych u zmutowanych zarodków13,15.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury, w tym tematy zwierzęce, zostały zatwierdzone przez Komisję Oceny Etyki w Instytucie Zoologii Chińskiej Akademii Nauk, Pekin, Chiny.
1. Przygotowanie materiału
- Sterylizuj filtry 0,65 μm promieniami ultrafioletowymi wytwarzanymi pod lampą ultrafioletową na czystej ławie przez 4 godziny i odwróć filtry po upływie 2 godzin.
UWAGA: Podczas pracy ze światłem UV należy nosić odpowiednią ochronę. - Sterylizuj siatki ze stali nierdzewnej za pomocą sterylizatora autoklawu w temperaturze 121 °C przez 30 minut.
UWAGA: Do podparcia filtrów na granicy faz powietrze-ciecz potrzebna jest pewna wysokość siatki ze stali nierdzewnej i można to zrealizować za pomocą drutu na stalowej siatce (Rysunek 1A). - Rozcieńczyć fluoksetynę do końcowego stężenia 10 μM w pożywce do hodowli długoterminowej M5300 i równomiernie wymieszać.
UWAGA: W przypadku płytki sześciodołkowej dla każdej studzienki odpowiednie są 2 ml pożywki do hodowli długoterminowej M5300. Hydrokortyzon w 10-6 M można selektywnie rozcieńczać w pożywce. - Przenieść pożywkę uzupełnioną fluoksetyną w stężeniu 10 μM do sześciodołkowych płytek lub szalek i umieścić wysterylizowane siatki ze stali nierdzewnej w pożywce.
- Umyj filtry 0,65 μm wrzącą wodą dwa razy przez 3 minuty za każdym razem w naczyniu do hodowli komórek szklanych w celu sterylizacji. Po każdym myciu umieść filtry w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na 2 minuty i umieść mokre filtry na siatkach ze stali nierdzewnej stojących na granicy faz powietrze-ciecz, jak pokazano na Rysunek 1A [schemat w środku].
UWAGA: Za pomocą sterylizatora autoklawu można wytworzyć wrzącą wodę, aby osiągnąć aseptykę, a sprzęt należy wyjąć ze sterylizatora autoklawu w odpowiednim czasie, aby uniknąć spadku temperatury.
2. AGM Hodowla eksplantatów
- Ostrożnie oddziel obszary AGM od zarodków w E10.5 lub E11 za pomocą kleszczy.
- Usuń macice z ciężarnych myszy nożyczkami preparacyjnymi i oddziel zarodki od macic .
- Zetrzyj woreczek żółtkowy, pępowinę i wnętrzności z ciała zarodka.
- Ostrożnie usuń grzbietowe tkanki nerwowe i otaczające tkanki mięśniowe.
- Odetnij tkanki kleszczami w miejscu kończyn przednich i tylnych i oddziel obszar AGM od ciała zarodka. Rysunki 1B-C pokazują schematyczną reprezentację i morfologię wypreparowanego AGM.
- Wypreparowane AGM należy oddzielnie umieścić na filtrach na granicy faz powietrze-ciecz (Rysunek 1A) i hodować w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 2 - 3 dni.
UWAGA: Nie umieszczaj rozciętego AGM na drucie stalowej siatki i upewnij się, że filtry znajdują się na granicy faz powietrze-ciecz podczas hodowli. Oprócz AGM, woreczek żółtkowy i wątroba płodu mogą być również hodowane za pomocą tego systemu7.
3. Analizy wyrażeń
- Poziom mRNA
- Zebrać wyhodowane AGM do 1 ml PBS i odwirować w temperaturze 4 °C, 310 x g przez 6 minut.
- Po usunięciu supernatantu całkowity RNA jest ekstrahowany z zebranych AGM za pomocą jednofazowego roztworu fenolu, zgodnie z instrukcjami producenta.
- Całkowite RNA (2 μg) jest następnie poddawane odwrotnej transkrypcji przy użyciu odwrotnej transkryptazy M-MLV w celu uzyskania cDNA jako matrycy. Ilościowe testy PCR w czasie rzeczywistym są wykonywane za pomocą SYBR Green, a Gapdh jest używany jako kontrola wewnętrzna.
- Poziom białka
- Zebrać wyhodowany AGM zgodnie z powyższym opisem w kroku 3.1.1.
- Przygotuj białko z hodowanego AGM z buforem do lizy komórek (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl i 0,5% NP-40) zawierającym inhibitor proteazy i użyj do western blotting w celu wykrycia poziomu białka, jak opisano wcześniej13.
4. Jednostki tworzące kolonie w teście kulturowym (CFU-C)
- Po hodowli przez 2 - 3 dni, zebrać regiony AGM do 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i odwirować w temperaturze 4 °C, 310 x g przez 6 minut i dysocjować za pomocą 200 μl kolagenazy (0,1% w PBS) w temperaturze 37 °C.
UWAGA: Czas potrzebny kolagenazie do wytworzenia zawiesin jednokomórkowych wynosi około 20 minut. Potrząsanie probówką zawierającą AGM co 5 minut może przyspieszyć proces trawienia. Do każdego AGM stosuje się 200 μl 0,1% kolagenazy, a 200 μl 10% surowicy stosuje się do zatrzymania reakcji. - Zawiesiny jednokomórkowe do hodowli w pożywce M3434 na 24-dołkowych płytkach o bardzo niskim mocowaniu.
UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, roztwór penicyliny i streptomycyny można selektywnie dodawać do pożywki. Ponieważ podłoże M3434 jest lepkie, do mieszania komórek i podłoża używa się strzykawki o pojemności 1,0 ml bez igły. - Po 7 - 10 dniach hodowli w temperaturze 37 °C w 5% CO2 rozróżnia się liczbę dla każdego typu kolonii, w tym jednostkę tworzącą Burst - erytroidalną (BFU-E), CFU-granulo-monocyty (CFU-GM) i CFU-granulocyty, erytrocyty, makrofagi, megakariocyty (CFU-GEMM) na podstawie morfologii i oceniane za pomocą odwróconego mikroskopu (Rysunek 2C).
5. Test transplantacyjny in vivo
- Test jednostek tworzących kolonie – śledziona (CFU-S)
- Po 2 - 3 dniach hodowli eksplantacyjnej, zebrać AGM i przygotować zawiesiny pojedynczych komórek, inkubując z 200 μl kolagenazy (0,1% w PBS) przez 20 minut.
- Wykonaj śmiertelne napromienianie (9 Gy promieni rentgenowskich) 8- do 10-tygodniowego samca myszy C57BL / 6 4 - 5 godzin przed wstrzyknięciem komórek.
- Umieść napromieniowaną mysz w ograniczniku, aby ograniczyć jej aktywność.
- Przetrzyj ogon bawełnianym wacikiem nasączonym 75% alkoholem, aby pobudzić rozszerzenie naczyń krwionośnych żyły.
- Wstrzyknąć dożylnie 0,5 ekwiwalentu zarodka (ee) lub 1 ee zawiesiny jednokomórkowej AGM do żyły ogonowej napromienianej myszy za pomocą strzykawki o pojemności 1,0 cm3.
UWAGA: Komórki są zawieszone za pomocą PBS, a 0,5 ml PBS na odbiorcę to odpowiednia objętość. Igła o rozmiarze 25 lub 26 G jest używana do wstrzykiwania za pomocą strzykawki o pojemności 1,0 cm3. Do strzykawki nie można wprowadzić powietrza. Uciskać miejsce wstrzyknięcia wacikiem antyseptycznym, aby zatrzymać krwawienie. - Jedenaście dni po przeszczepie zbierz i utrwal śledziony myszy biorcy w roztworze Bouina (15 ml 1,22% nasyconego kwasu pikrynowego roztworu wodnego, 2 ml 40% metanolu i 1 ml kwasu octowego) przez 1-2 dni i myj 80% alkoholem przez kolejne 1-2 dni. Policz makroskopowo widoczne kolonie w śledzionie i określ liczbę kolonii na ee.
UWAGA: Utrwalacz Bouina, nosić odpowiednią ochronę.
- Długoterminowy test transplantacyjny
- Po 2 - 3 dniach hodowli eksplantacyjnej, zebrać AGM i przygotować zawiesiny jednokomórkowe poprzez inkubację z 200 μl kolagenazy (0,1% w PBS) przez 20 minut.
- Wykonaj śmiertelne napromienianie (9 Gy promieniowania rentgenowskiego) 8- do 10-tygodniowego samca myszy C57BL / 6 4 - 5 godzin przed wstrzyknięciem komórek.
- Umieść napromieniowaną mysz w ograniczniku, aby ograniczyć jej aktywność.
- Przetrzyj ogon bawełnianym wacikiem nasączonym 75% alkoholem, aby pobudzić rozszerzenie naczyń krwionośnych żyły.
- Wstrzyknąć dożylnie 0,5 ekwiwalentu zarodka (ee) lub 1 ee zawiesiny jednokomórkowej AGM do żyły ogonowej napromienianej myszy za pomocą strzykawki o pojemności 1,0 cm3. AGM wstrzykuje się w dawce 1 ee na biorcę z 2×105 komórek szpiku kostnego (tło CD45.1).
UWAGA: Do strzykawki nie można wprowadzić powietrza. Uciskać miejsce wstrzyknięcia wacikiem antyseptycznym, aby zatrzymać krwawienie. - Cztery miesiące po przeszczepie należy pobrać szpik kostny biorcy i użyć go do testu rekonstytucji za pomocą FACS. Tylko biorcy z ≥10% chimeryzmem pochodzącym od dawcy są uważani za wykazujących udaną rekonstytucję.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niedawnej publikacji wykazano, że serotonina pochodząca z komórek śródbłonka wspomaga przeżywalność HSC poprzez hamowanie szlaku proapoptotycznego w obszarze AGM.13Aby potwierdzić promujący wpływ serotoniny na rozwój HSC, zastosowano fluoksetynę. Jako selektywny inhibitor zwrotnego wychwytu serotoniny (SSRI), fluoksetyna wykazuje zdolność do hamowania reabsorpcji serotoniny w tkankach obwodowych.16,17
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Powszechnie wiadomo, że dojrzałe HSC w szpiku kostnym mogą ponownie zasiedlać układ krwionośny napromieniowanych biorców. W przeciwieństwie do tych funkcjonalnych HSC, pojawiające się HSC w AGM zarodków myszy są niedojrzałe. Wyniki bezpośredniego przeszczepu wykazały, że pre-HSC typu I (VE-cad+ CD45-CD41+) i typu II (VE-cad+ CD45+) nie mają zdolności do rekonstytucji20. Korzystając z systemu hodowli eksplantatów AGM, powstające HSC w regionie ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy Suwei Gao za pomoc w przygotowaniu figury. Prace te były wspierane przez granty Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81530004, 31425016) oraz Ministerstwa Nauki i Technologii Chin (2016YFA0100500). J.L. przeprowadził eksperymenty i sporządził szkic rękopisu; F.L. zredagował rękopis. Obaj autorzy przeczytali i zatwierdzili ostateczną wersję rękopisu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| durapore 0,65 &mikro; m filtry | Millipore | R5BA63787 | AGM hodowla eksplantatów |
| M5300 pożywka do hodowli długoterminowej | Technologie komórek macierzystych | 5300 | AGM hodowla eksplantatów |
| Trizol | Tiangen | 5829 | Ekstracja RNA |
| Odwrotna transkryptaza M-MLV | Promega | 90694 | odwrotna transkrypcja |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | ilościowy |
| inhibitor proteazy | Roche | 55622 | Ekstracja białek |
| kolagenaza | Sigma | C2674 | trawienie tkanek AGM |
| MethoCult GF M3434 średni | Test komórek macierzystych | 3434 | CFU-C |
| 24-dołkowe płytki o bardzo niskim przyczepie | Costar | 3473 | Test CFU-C |
| C57BL/6 CD45.2 myszy | HFK Bioscience Co., Ltd | Test CFU-S | |
| C57BL/6 CD45.1 myszy | HFK Bioscience Co. Ltd | Długoterminowa transplantacja | |
| sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Life Technologines | 8115284 | Kolekcja AGM |
| Roztwór penicyliny i streptomycyny | HyClone | SV30010 | AGM hodowla eksplantatów |
| anty-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Długoterminowy przeszczep |
| anty-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | |
| Długotrwała lampa UV | Pekin jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | moc: 30W |
| siatka ze stali nierdzewnej | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | średnica otworu: 2,5 mm |
| hydrokortyzon | Sigma | H0396 | selektywnie rozcieńczony do podłoża M5300 |
Bibliografia
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129, 4891-4899 (2002).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86, 897-906 (1996).
- Peeters, M., et al. Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development. Development. 136, 2613-2621 (2009).
- Taoudi, S., Medvinsky, A. Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta. PNAS. 104, 9399-9403 (2007).
- Crisan, M., et al. BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).
- Durand, C., et al. Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells. PNAS. 104, 20838-20843 (2007).
- Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis. Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).
- Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. 5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival. J Exp Med. 214, 529-545 (2017).
- Souilhol, C., et al. Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells. Nature communications. 7, 10784(2016).
- Fitch, S. R., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).
- Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).
- Ortiz, J., Artigas, F. Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine. Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).
- Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine. Life sciences. 15, 471-479 (1974).
- Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter. Nature. 457, 887-891 (2009).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).
- Muthuswamy, S. K. Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead. Development. 144, 963-967 (2017).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
