Artykuł metodologiczny

Charakterystyka rozszerzeń błon komórkowych i badanie ich roli w dynamice adhezji komórek nowotworowych

DOI:

10.3791/56560

⸱

26 marca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery & Yale Endocrine Neoplasia Laboratory, Yale University School of Medicine, 2Yale New Haven Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie pokazuje użyteczność i łatwość ilościowego pomiaru wydłużenia błony komórkowej oraz jego korelację ze zdolnością adhezyjną komórek. Jako reprezentatywny przykład pokazujemy tutaj, że białko 3 związane z Dickkopfem (DKK3) sprzyja zwiększonemu tworzeniu lobopodiów i adhezji komórek w komórkach raka kory nadnerczy in vitro.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Repertuar przedłużania błony komórkowej moduluje różne złośliwe zachowania komórek nowotworowych, w tym ich adhezyjne i migracyjne potencjały. Zdolność do dokładnej klasyfikacji i ilościowego określenia wydłużenia komórek oraz pomiaru wpływu na zdolność adhezyjną komórki ma kluczowe znaczenie dla określenia, w jaki sposób zdarzenia sygnalizacji komórkowej wpływają na zachowanie i agresywność komórek nowotworowych. W tym miejscu opisujemy projekt in vitro i zastosowanie metody kwantyfikacji wydłużania komórek w połączeniu z testem zdolności adhezyjnej w ustalonym modelu in vitro raka kory nadnerczy (ACC). W szczególności testujemy wpływ DKK3, domniemanego supresora nowotworu i czynnika proróżnicującego, na fenotyp wydłużenia błony linii komórkowej ACC, SW-13. Proponujemy, aby testy te zapewniły stosunkowo proste, wiarygodne i łatwe do zinterpretowania wskaźniki do pomiaru tych cech w różnych warunkach eksperymentalnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dysregulowana sygnalizacja WNT odgrywa kluczową rolę w nowotworach kory nadnerczy1. Metody zastosowane w tym badaniu badają, czy wyciszenie DKK3, negatywnego regulatora sygnalizacji WNT, stanowi zdarzenie dedyferencjacji w korze nadnerczy i sprzyja powstawaniu guza w kontekście zmian w repertuarze rozszerzenia komórki. DKK3 jest glikoproteiną wydzielaną przez 38 kDa z N-końcowym peptydem sygnałowym, a wcześniejsze badania wykazały, że jej wymuszona ekspresja powodowała zatrzymanie cyklu komórkowego, hamowała agresywne złośliwe zachowanie i odwracała przejście nabłonkowo-mezenchymalne2.

Na złośliwe zachowanie raka kory nadnerczy (ACC) i innych nowotworów częściowo wpływa zdolność komórek nowotworowych do interakcji z otaczającymi powierzchniami, w tym z macierzą zewnątrzkomórkową, co z kolei ułatwia inwazję i migrację komórek nowotworowych3. Rola określonych rozszerzeń błon komórkowych w progresji raka jest coraz częściej wykazywana w różnych kontekstach, głównie poprzez tworzenie filopodiów. Na przykład stwierdzono, że nadekspresja kanałów wapniowych typu L indukuje powstawanie filopodiów i sprzyja inwazji komórek nowotworowych4. Podobnie, faszyna, białko wiążące aktynę, minimalnie wyrażane w normalnej tkance, jest również nadeksprymowane w komórkach rakowych w związku z tworzeniem filopodiów5. Tworzenie lobopodiów umożliwia niezłośliwym fibroblastom skuteczną migrację przez macierz zewnątrzkomórkową, jednak wykazano, że komórki włókniakomięsaka polegają na aktywności metaloproteinazy zamiast lobopodiów, aby ułatwić migrację i inwazję komórek6. Wykazaliśmy, że supresory nowotworów, w tym rodzina domen asocjacyjnych Ras 1 izoforma A (RASSF1A) i DKK3, mogą zmieniać elementy cytoszkieletu i promować tworzenie lamellipodiów oraz hamować właściwości inwazyjne7,8.

W związku z tym, kluczowe jest scharakteryzowanie efektów genów zaangażowanych w kancerogenezę i ich związku ze zmianami w rozszerzeniu błony komórkowej, szczególnie oceniając tworzenie filopodiów, lobopodiów i lamellipodiów w warunkach testowych. Obecne najnowocześniejsze techniki obejmują stosowanie coraz bardziej wyrafinowanych metod mikroskopowych, znakowania fluorescencyjnego i/lub złożonych algorytmów komputerowych do pozyskiwania i interpretacji danych. Chociaż metody te dostarczają nowych i potężnych narzędzi analitycznych, ich złożoność ogranicza ich powszechne zastosowanie i zdolność adaptacji w eksperymentach biologii komórki. Co więcej, dokładna kwantyfikacja i obserwacja zmian w morfologii wydłużenia komórki nie jest zwykle mierzona9,10. W przeciwieństwie do tego, wprowadzamy tutaj technikę, która dokładnie określa ilościowo zmiany w wydłużeniu komórek przy użyciu standardowych technik mikroskopowych i łatwo adaptowalnych metod in vitro. Metody te określają również ilościowo każdy typ rozszerzenia komórki jednocześnie dla każdej analizowanej komórki i określają ogólne zmiany w repertuarze wydłużania błony komórkowej. Pokazujemy również, w jaki sposób te zmiany mogą odnosić się do właściwości adhezji komórek.

Jako eksperymentalny przykład, użyjemy wcześniej utworzonej linii komórkowej SW-13, oznaczonej jako SW-DDK3, która została stabilnie transfekowana wektorami plazmidowymi pCMV6-Entry/DKK3 i konstytutywnie wykazuje nadekspresję DKK3, czynnika różnicującego w nadnerczach. Nietransfekowane komórki SW-13 i komórki SW-13 stabilnie transfekowane pustym wektorem (pCMV6-Entry), oznaczone SW-Neo, będą służyć jako eksperymentalne kontrole.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Charakterystyka rozszerzenia komórki

  1. Utrzymuj komórki SW-13, SW-Neo i SW-DKK3 w standardowym nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37,0 °C i 5% CO2 w zmodyfikowanym pożywce Eagle firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 10 000 U/ml penicyliny i streptomycyny (oznaczonej jako "pożywka wzrostowa").
    1. Policz komórki za pomocą hemocytometru i umieść 5,000 komórek na dołku dla linii SW-13, SW-Neo i SW-DKK3 na oddzielnych płytkach 6-dołkowych i hoduj przez noc w pożywce wzrostowej na sterylnych szklanych szkiełkach nakrywkowych.
  2. Po całonocnym wzroście, dla każdej studzienki, odessać pożywkę wzrostową, umyć komórki 1 ml ciepłej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), a następnie utrwalić komórki 1 ml 3,7% formaldehydu przez 10 minut.
  3. Odessać formaldehyd i zabarwić komórki w każdym dołku 1 ml 0,05% fioletu krystalicznego przez 30 minut. Zmyć nadmiar barwnika za pomocą trzech płukań 1 ml wody dejonizowanej.
    UWAGA: W zależności od poziomu wchłaniania barwnika może być konieczne kilka dodatkowych prań w celu usunięcia przebarwień tła w celu ułatwienia wizualizacji komórek.
    1. Za pomocą szczypiec z cienką końcówką wyjmij szkiełka nakrywkowe i połóż je stroną zadrukowaną do dołu na oznakowanym szkiełku podstawowym z kroplą przezroczystego odczynnika montażowego.
  4. Pod mikroskopem świetlnym losowo wybierz 20 widoków nienakładających się komórek z każdego szkiełka nakrywkowego do testu przedłużania komórek.
    1. Zrób mikrofotografie w 400-krotnym powiększeniu każdego pola widzenia. Bezpośrednio policz liczbę każdego typu rozszerzenia dla każdej z 20 reprezentatywnych komórek.
      UWAGA: W związku z tym należy zbadać 20 izolowanych komórek dla każdego badanego stanu, aby zapewnić wiarygodne wyniki. Filopodia zdefiniowano za pomocą rozszerzeń komórkowych o podstawie 5 mikronów lub mniejszej i pojedynczym wierzchołku. Lobopodia zdefiniowano za pomocą przedłużeń komórkowych o podstawie o długości od 5 do 20 mikronów, zawierających przedłużenia z wieloma wierzchołkami. Blaszki zdefiniowano za pomocą przedłużeń komórek o długości większej niż 20 mikronów i z wierzchołkami lub bez. W zależności od badanego typu ogniwa, rozmiary przedłużeń ogniw mogą się różnić i mogą wymagać doprecyzowania parametrów identyfikacyjnych.
  5. Określ średnią liczbę każdego przedłużenia komórki w każdym typie komórki (tj. SW-13, SW-Neo, SW-DDK) w 6 badanych studzienkach.
  6. Korzystając z testu statystycznego jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), porównaj różnice w średnim odsetku rozszerzeń błony komórkowej między różnymi typami komórek testowych.

2. Test adhezji

  1. Utrzymuj komórki SW-13, SW-Neo i SW-DKK3 w standardowym nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37,0 °C i 5% CO2 w podłożu wzrostowym.
    1. Za pomocą hemocytometru policz i umieść 100 000 komórek SW-13, SW-Neo i SW-DKK3 na studzienku na oddzielnych 6-dołkowych płytkach i hoduj przez noc w pożywce wzrostowej.
    2. Wysiewaj 6-dołkowe płytki dla każdego badanego typu komórek, używając jednej płytki dla każdego z 6 wyznaczonych punktów czasowych badanych poniżej.
      UWAGA: Punkty czasowe mogą się różnić dla różnych typów komórek.
  2. Po całonocnej inkubacji umyj komórki ciepłym PBS, a następnie dodaj 0,5 ml 1x nieenzymatycznego roztworu dysocjacji komórek do każdej studzienki.
    1. Zakręć płytką, aby rozprowadzić roztwór dysocjacji komórek. Odessać wyznaczoną płytkę w określonych punktach czasowych (tj. 1, 2, 3, 5, 10 i 15 minut), a następnie trzykrotnie przemyć 1 ml ciepłego roztworu PBS.
    2. Pomiędzy praniami delikatnie postukaj w płytki, aby odłączyć luźno przymocowane komórki.
  3. Odessać pozostały PBS i przymocować pozostałe komórki do płytki za pomocą 1 ml 3,7% formaldehydu przez 10 minut.
  4. Zabarwić komórki 1 ml 0,05% fioletu krystalicznego przez 30 minut, a następnie zmyć nadmiar barwnika 1 ml wody dejonizowanej. Miareczkowanie płukania w celu ułatwienia wizualizacji komórek.
    UWAGA: W zależności od poziomu wchłaniania barwnika może być konieczne kilka dodatkowych płukań, aby ułatwić wizualizację komórek.
  5. Używając mikroskopu świetlnego przy 100-krotnym powiększeniu, policz pozostałe przyłączone komórki w każdym dołku dla każdej płytki.
    UWAGA: Używanie przezroczystych linijek lub zaznaczanie cienkich prowadnic pisaków na spodniej stronie płytki pomoże uniknąć wielokrotnego liczenia tych samych komórek.
  6. Określ średnią liczbę przyłączonych komórek na studzienkę dla każdej płytki.
  7. Porównaj szybkość odłączania komórek między komórkami SW-13, SW-Neo i SW-DDK3 w danym okresie czasu za pomocą dwukierunkowego testu statystycznego ANOVA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z powyższych testów, przetestowano wpływ nadekspresji DKK3 na morfologię rozszerzenia komórki i właściwości adhezji komórek w ustalonej linii komórkowej ACC SW-13, in vitro. Komórki z nadekspresją DKK3 zostały wygenerowane przez stabilną transfekcję komórek SW-13 z wektorami plazmidowymi pCMV6-Entry / DKK3 oznaczonymi Myc-DDK i oznaczonymi jako SW-DKK3. Podobnie, komórki stabilnie transfekowane pustym wektorem pCMV6-Entry zostały utworzone jako kontrola transfekcji i ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy ilościową metodę in vitro do łatwego charakteryzowania rozszerzeń komórek, z niewielką liczbą pułapek i wiarygodną odtwarzalnością, którą można zastosować w różnych warunkach testowych. Co więcej, proste, mierzalne testy adhezji i/lub ruchliwości mogą być wykonywane jednocześnie w celu skorelowania potencjalnego znaczenia funkcjonalnego obserwowanych zmian w rozszerzeniach błony komórkowej.

Jednak te metody mogą wiązać się z pewnymi potencjalnymi ograniczeniami...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fundacja Grantu Ohse sfinansowała tę pracę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher11965-092Uzupełniony płodową surowicą bydlęcą oraz penicyliną i streptomycyną
Roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanem DeulbecoSigma-AldrichD85371X, stosowany bezpośrednio
3,7% formaldehydu Sigma-AldrichF8775Rozcieńczony roztwór podstawowy
0,05% fioletu krystalicznego Harleco192-12Rozcieńczony roztwór podstawowy
Woda dejonizowanaNANA NA
Mikroskop z 400-krotnym powiększeniem NANA
Płytki 6-dołkoweCorning353046NA
Roztwór do dysocjacji komórek nieenzymatyczny 1XSigma-AldrichC5914 1X roztwór, stosowany bezpośrednio

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
  2. Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).
  3. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
  4. Jacquemet, G., et al. L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling. Nat Commun. 7, 13297(2016).
  5. Machesky, L. M., Li, A. Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis. Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).
  6. Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells. J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).
  7. Korah, R., et al. Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma. Molecular cancer. 12, 87(2013).
  8. Cheng, J. Y., et al. A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis. BMC cancer. 17 (1), 164(2017).
  9. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
  10. Cliffe, A., et al. Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration. Nat Commun. 8, 14905(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rak nadnerczykwantyfikacja elongacji kom rektest zdolno ci adhezyjnychfilopodia lamellipodia lobopodiasupresor nowotworowy DKK3linia kom rkowa SW 13analiza pod mikroskopem wietlnymbarwienie fioletem krystalicznym

Powiązane artykuły