W tym protokole demonstrujemy zastosowanie tomografii elektronowej o przekroju szeregowym do wyjaśnienia struktury mitochondrialnej w mięśniu lotu pośredniego Drosophila.
Artykuł metodologiczny
Ultrastruktura mitochondrialna 3D mięśnia lotu pośredniego Drosophila ujawniona przez tomografię elektronową o przekroju szeregowym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mitochondria to komórkowe elektrownie, które produkują ATP, lipidy i metabolity, a także regulują homeostazę wapnia i śmierć komórki. Unikalna, bogata w grzebienia ultrastruktura podwójnej błony tej organelli jest elegancko ułożona, aby pełnić wiele funkcji poprzez partycjonowanie biomolekuł. Ultrastruktura mitochondriów jest ściśle związana z różnymi funkcjami; Jednak drobne szczegóły tych relacji struktura-funkcja dopiero zaczynają być opisywane. Tutaj pokazujemy zastosowanie tomografii elektronowej o przekroju seryjnym do wyjaśnienia struktury mitochondrialnej w mięśniu lotu pośredniego Drosophila. Tomografia elektronowa o przekroju szeregowym może być przystosowana do badania dowolnej struktury komórkowej w trzech wymiarach.
Wprowadzenie
Mikroskopia elektronowa jest cennym narzędziem do badania kontekstu strukturalnego zespołów subkomórkowych i organelli, które wykonują procesy komórkowe. Opracowano metody zachowania ultrastruktury tkanek lub komórek poprzez chemiczne wiązanie aldehydami lub zamrażanie pod wysokim ciśnieniem (HPF), a następnie podstawienie przez zamrożenie (FS)1,2. Osadzone bloki próbki można następnie podzielić, wybarwić i obserwować za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM). Próbka HPF może być również przetwarzana w warunkach kriogenicznych, takich jak kriosekcja lub mielenie skupionej wiązki jonów (FIB), i obserwowana przez cryo-EM3,4.
Chociaż cienki przekrój EM dostarcza pouczających spostrzeżeń morfologicznych, wynikowe obrazy 2D mogą ujawnić tylko ultrastrukturę określonego przekroju. Sposób, w jaki ultrastruktura jest zorganizowana w objętości 3D, pozostaje niejasny. W celu wizualizacji ultrastruktury komórkowej w trzech wymiarach opracowano metodę tomografii elektronowej, w której uzyskano serię obrazów nachylenia i ponownie wyświetlono je w celu wygenerowania rekonstrukcji tomograficznej5 (Rysunek 1). Serię podwójnego przechyłu można zebrać, obracając próbkę o 90° i uzyskując drugą serię przechyłu. Zminimalizuje to artefakty brakującego klina, które wynikają z ograniczonych kątów próbkowania i poprawi rozdzielczość tomogramu.
Tutaj opisujemy zastosowanie tomografii elektronowej o przekroju szeregowym do badania ultrastruktury mitochondriów mięśni lotu pośredniego (IFM)6,7,8,9. W celu uzyskania rekonstrukcji 3D obejmujących całe mitochondria (o grubości około 2,5 μm) uzyskano seryjne odcinki z bloków tkankowych Drosophila IFM. Tomogramy każdej sekcji zostały zebrane indywidualnie za pomocą oprogramowania do automatycznego zbierania danych. Wykonano rekonstrukcje tomograficzne i połączono tomogramy seryjne z pakietem IMOD w celu uzyskania zrekonstruowanej objętości całego mitochondrium. Połączone tomogramy zostały przeanalizowane przez oprogramowanie 3D. Gęstości grzebień mitochondrialnych zostały podzielone na segmenty w celu wygenerowania modelu segmentacji, który ujawnił organizację w trzech wymiarach.
Protokół
1. Sekcja tkanek Drosophila za pomocą mikrotomu z wibrującym ostrzem
- Znieczul Drosophila na lodzie i zanurz każdą pojedynczą muchę w 1 ml 4% niskotopliwej agarozy w buforze fosforanowym. Pozwól agarozie zastygnąć na lodzie. Zazwyczaj przetwarzano 4 - 6 much.
- Za pomocą mikrotomu z wibrującymi ostrzami pokrój żel agarozowy zatopiony w Drosophila na plastry o grubości 100 μm i zanurz w roztworze utrwalającym zawierającym 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze fosforanowym.
UWAGA: Preferowane jest cięcie wibratomem, ponieważ architektura tkanek pozostaje bardziej nienaruszona w porównaniu z innymi metodami. Alternatywnie, pęseta preparcyjna może być użyta do rozwarstwienia IFM do roztworu utrwalającego zawierającego 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze fosforanowym.
2. Przygotowanie próbek EM metodą wysokociśnieniowego zamrażania i podstawiania przez zamrażanie (HPF/FS)
- Umyj skrawki tkanek w 3 kroplach (~150 μL) buforu fosforanowego, a następnie w 2 kroplach (~100 μL) buforu fosforanowego z 20% BSA. Następnie umieść skrawki w złotych nośnikach dla HPF wypełnionych buforem i 20% BSA.
- Załaduj próbkę zawierającą nośniki do zamrażarki wysokociśnieniowej zgodnie z instrukcją obsługi.
- Po zamrożeniu uwolnić nośniki z uchwytu pod ciekłym azotem i przenieść do urządzenia do zamrażania i substytucji schłodzonego do temperatury -140 °C.
- Wykonaj protokół zamrażania-substytucji, jak pokazano w Tabeli 1, z koktajlem FS zawierającym 2% aldehydu glutarowego, 2% tetratlenku osmu i 0,1% octanu uranylu w acetonie.
- Ostrożnie wyjmij próbki z nośników za pomocą igły i zanurz próbki w żywicy w temperaturze pokojowej. Polimeryzować żywicę w temperaturze 65 °C przez 16 godzin.
UWAGA: Protokoły FS powinny zostać zmodyfikowane w celu przygotowania innych rodzajów próbek. HPF/FS jest preferowany w celu zachowania ultrastruktury i zminimalizowania utraty zawartości komórkowej.- Alternatywnie zastosuj protokół utrwalania chemicznego. Utrwalić próbki 2,5% aldehydem glutarowym przez noc, przemyć, a następnie utrwalić 1% tetratlenkiem osmu przez 2 godziny. Przemyć i odwodnić rosnącym stężeniem etanolu, a następnie infiltrować i zatapiać próbki w żywicy Spurra przed polimeryzacją w temperaturze 65 °C przez 16 godzin.
3. Przygotowanie seryjnych przekrojów próbek do tomografii elektronowej
- Przytnij bloki próbki, aby odsłonić żądaną powierzchnię bloku zawierającą tkankę.
- Cząstki złota (o średnicy 10 nm) należy wstępnie traktować 1% powierzchnią ciała przez 30 minut. Przemyć i zawiesić cząsteczki złota w buforze PBS. Nakładaj cząsteczki złota na miedziane siatki szczelinowe pokryte folią węglową, aby stworzyć znaczniki odniesienia.
- Sprawdź w TEM, czy w polu widzenia akwizycji tomografii znajduje się wystarczająca ilość markerów odniesienia (co najmniej 5 - 10 markerów).
- Cięcie odcinków szeregowych o grubości 200 - 250 nm za pomocą ultramikrotomu.
- Zbieraj sekcje szeregowe na siatkach szczelin za pomocą idealnej pętli dla cienkich sekcji.
- Zabarwić skrawki cytrynianem ołowiu Reynoldsa przez 10 minut.
- Nałóż drugą warstwę fiducialnych cząstek złota na wierzch sekcji.
4. Zbierz tomografię elektronową z podwójnym pochyleniem
- Załadować siatkę na dwuosiowy uchwyt tomograficzny i włożyć do transmisyjnego mikroskopu elektronowego pracującego pod napięciem 200 kV.
- Ustaw mikroskop w ogniskowej eucentrycznej.
- Skonfiguruj oprogramowanie do automatycznego zbierania danych. Dostosuj i wyrównaj wiązkę elektronów przy ustawieniu obrazowania wieloskalowego. Szczegółowe informacje na temat obsługi można znaleźć w instrukcji obsługi10 (Rysunek 2).
- Uzyskuj ciemne i jasne referencje z kamery w pustym obszarze bez filmu węglowego przy ustawieniu kolekcji tomografii.
- Zbierz atlas siatki w małym powiększeniu. Wybierz mitochondria na odcinkach szeregowych jako cele do pobrania tomografii.
- Uzyskaj serię pochylenia od -60° do +60° z krokami co 2° na osi-A dla każdego celu.
UWAGA: Kąty nachylenia będą ograniczone mechanicznie przez konstrukcję uchwytu na próbki. Uchwyt zablokuje belkę pod dużymi kątami nachylenia. - Aby zebrać drugą serię przechyłu, obróć uchwyt próbki o 90°. Zdobądź nowy atlas. Wybierz odpowiednie pozycje i uzyskaj serię pochylenia na osi-B dla każdego celu.
UWAGA: Inne pakiety oprogramowania, takie jak SerialEM i Xplore3D, są dostępne do automatycznego zbierania danych.
5. Rekonstrukcja tomogramów 3D i podobjętości segmentów za pomocą oprogramowania
- Rekonstrukcja tomogramów obrazów pochylenia dwuosiowego za pomocą oprogramowania IMOD11.
- Szczegółowe informacje na temat obsługi można znaleźć w instrukcji obsługi.
- Wyrównaj poszczególne serie pochylenia według pozycji złotych znaczników odniesienia. Rekonstrukcja tomogramów za pomocą metody projekcji wstecznej lub metody techniki symultanicznej rekonstrukcji iteracyjnej (SIRT) odpowiednio dla osi A i osi B (Rysunek 3).
- Połącz tomogramy osi-A i osi-B, aby wygenerować tomogram o podwójnym przechyleniu ze zmniejszonym brakującym artefaktem klina.
- Połącz ze sobą tomogramy o podwójnym pochyleniu odcinków szeregowych, aby uzyskać rekonstrukcje obejmujące całą objętość mitochondrium. Modelowanie przerw między sekcjami szeregowymi za pomocą programu IMOD.
- Przytnij połączone tomogramy i pojemnik do żądanego rozmiaru w celu segmentacji objętości.
- Analizuj połączone tomogramy seryjne za pomocą oprogramowania 3D.
- Szczegółowe informacje na temat obsługi można znaleźć w instrukcji obsługi.
- Przefiltruj tomogramy za pomocą filtra Gaussa (lub innej pożądanej metody), aby poprawić kontrast cech i zmniejszyć gęstość tła.
- Segmentacja ultrastruktury mitochondriów ręcznie lub automatycznie.
- Wyświetlanie modeli segmentacji w celu umożliwienia inspekcji w 3D.
- Generuj filmy za pomocą narzędzi dostępnych w 3D.
Wyniki
Zastosowaliśmy seryjną tomografię elektronową w celu analizy cech strukturalnych grzebieni mitochondrialnych, które odzwierciedlają stan energetyczny i starzenie się organellum. Wykazaliśmy, że mitochondria mięśni nielotnych (Drosophila IFM) tworzą zintegrowaną trójwymiarową sieć grzebieni i macierzy (Rysunek 4)7. Ponadto u much mutantów z defektem replikacji mitochondrialnego DNA i przyspieszonym fenotypem starzenia nagromadziły się mitochondria zawierające fragmenty cebulowatego, wirującego rdzenia (Rysunek 5)7.
Rysunek 1: Ilustracja rekonstrukcji tomografii elektronowej z serii obrazów pod różnymi kątami nachylenia. W eksperymencie wiązka elektronów przechodzi przez obiekt 3D, podczas gdy obiekt jest pochylany pod różnymi kątami. Dla każdego stopnia pochylenia generowana jest projekcja 2D, która zostaje zarejestrowana przez kamerę. Następnie z projekcji 2D wykonuje się projekcję wsteczną w celu zrekonstruowania obiektu 3D w oparciu o twierdzenie o przekroju środkowym. Na ilustracji ten sam proces przedstawiono dla oryginalnego obrazu 2D, który jest projektowany na jeden wymiar pod różnymi kątami pochylenia. Projekcje 1D są następnie wykorzystywane do rekonstrukcji obrazu 2D. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rycina 2: Automatyczny zbieranie danych. Wyświetlacz przeglądarki obrazów prezentujący oprogramowanie z atlasem siatki slotów zawierającej sekcje seryjne, wieloskalowe celowanie w mitochondria oraz pozyskane obrazy przechylone. Pasek skali = 500 µm (lewy górny panel), 100 µm (lewy dolny panel), 1 µm (prawy panel). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rycina 3: Tomografia elektronowa seryjnych przekrojów pojedynczej mitochondrium w Muszka owocówka pośredni mięsień latający. (A) mikrografie 2D oraz (B) Tomogramy 3D z sekcji seryjnych obejmujące całą objętość mitochondrium. (CPołączone tomogramy z seryjnych przekrojów zostały rzutowane w celu utworzenia przekroju podłużnego, w którym oś z jest przedstawiona pionowo. Należy zauważyć, że sekcjonowanie tkanki doprowadziło do utraty materiału, co spowodowało powstanie przerw między połączonymi tomogramami. Pasek skali = 50 nm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rycina 4: Zintegrowana sieć grzebieni i macierzy wewnątrzmitochondrialnej przedstawiona w 3D. (APrzekroje tomograficznych rekonstrukcji elektronowych mitochondriów, pokazujące przejścia między błonami lamelarnymi wzdłuż osi z.B) Ilustracje zaobserwowanych wzorców przełączania grzebieni spiral prawoskrętnych i/lub lewoskrętnych. (C) Segmentacja tomograficzna ilustrująca spiralę lewoskrętną w 3D (DWzorce przełączania grzebieni zostały przeanalizowane i odwzorowane kolorystycznie na modelu segmentacji (E, F). Przekrój tomograficzny ukazujący lateralną konfluencję macierzy (ciemne zagęszczenia, zaznaczone na czerwono) w obrębie błon grzebieniastych (białe zagęszczenia). (G) Model segmentacji tomogramu w (E) przedstawiające konfluencję macierzy bocznej (na czerwono) oraz reprezentatywne grzebienie (na szaro). Pasek skali = 50 nm (A), 20 nm (C) oraz 300 nm (D, E, F, G). Rysunek jest przedrukiem z pracy Jiang i in.7 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rycina 5: Mitochondria z cebulowymi, spiralnymi rdzeniami nagromadzone w muchach z defektami replikacji mitochondrialnego DNA podczas starzenia. Reprezentatywne przekroje tomograficzne i odpowiadająca im segmentacja (panele po prawej stronie), przedstawiające widok w przekroju poprzecznym (góra) i widok w przekroju podłużnym (dół) wirującego rdzenia. Segmentacja objętościowa została zaznaczona za pomocą dowolnego renderowania kolorów, aby wyróżnić wirujący rdzeń. Pasek skali: 20 nm. Rysunek jest przedrukiem z pracy Jiang i in.7 Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Krok | Temp. | Czas | Roztwór | |||
| 1 | -140 °C do -9 0°C | 30 min | Ciekły azot | |||
| 2 | -90 °C | 96 h | koktajl FS | |||
| 3 | -90 °C do -60 °C | 6 godz. (5 °C/godz) | koktajl FS | |||
| 4 | -60 °C | 12 godz. | koktajl FS | |||
| 5 | -60 °C do -25 °C | 7 godz. (5 °C/godz) | koktajl FS | |||
| 6 | -25 °C | 12 godz. | koktajl FS | |||
| 7 | -25 °C Nie podano tekstu źródłowego do tłumaczenia. Proszę o wprowadzenie treści, którą należy przetłumaczyć na język polski. 0 °C | 5 godz. (5 °C/godz) | koktajl FS | |||
| 8 | 0 °C | 1 godz. x 3 razy | Aceton | |||
| 9 | Temperatura pokojowa | Infiltracja żywicą | ||||
Tabela 1: Protokół substytucji mrożonej.
Dyskusja
W tym protokole opisujemy zoptymalizowany przepływ pracy w celu zastosowania tomografii elektronowej o przekroju szeregowym do badania ultrastruktury mitochondrialnej 3D mięśnia lotu pośredniego Drosophila . Zachowanie ultrastruktury w próbce jest podstawowym wyzwaniem technicznym dla tego typu analiz. Aby jak najlepiej zachować ultrastrukturę, uwzględniono dwa etapy metodologiczne. W pierwszej kolejności pobrano próbki tkanek poprzez sekcje za pomocą mikrotomu z wibrującymi ostrzami, aby w jak największym stopniu zachować architekturę tkanki. Po drugie, zoptymalizowano protokół HPF/FS w celu zachowania ultrastruktury organelli podczas przygotowywania osadzonych bloków próbek. Próbki zamrożono pod wysokim ciśnieniem, co obniża temperaturę zamarzania wody i ogranicza tworzenie się kryształków lodu, które uszkadzają ultrastrukturę1. Próbki o grubości zaledwie 0,1 mm mogą być natychmiast zeszklone, a następnie poddane podstawieniu przez zamrażanie w celu wygenerowania bloków próbek do analizy EM. Zauważono lepsze zachowanie ultrastruktury przez HPF/FS w porównaniu z metodami wiązania chemicznego. Korzystając z tej serii etapów przygotowania próbki, znacznie poprawiono zachowanie podwójnych błon mitochondrialnych i błon grzebienia.
Uzyskanie seryjnych przekrojów próbki jest najtrudniejszym etapem metody. Ponieważ wiązka elektronów ma ograniczoną zdolność penetracji, grubość przekroju jest ograniczona do 250 nm lub 500 nm przy użyciu TEM działającego odpowiednio przy napięciu 200 kV lub 300 kV. Ponieważ grubość mitochondrium może być większa niż 2 μm, do uzyskania pełnych rekonstrukcji objętościowych wymagane są sekcje szeregowe. Jednak odzyskanie wystarczającej liczby odcinków seryjnych, aby objąć całe organelle, jest wyzwaniem technicznym. Przycięcie powierzchni bloku tak, aby była jak najbardziej płaska między podstawami trapezu, może pozwolić siatce szczelinowej pomieścić więcej sekcji, a tym samym pokryć większe objętości. Dodatkowo, użycie idealnej pętli dla cienkich odcinków zwiększa wskaźnik sukcesu przenoszenia sekcji szeregowych do siatki.
Tomografia elektronowa o przekroju szeregowym może być wykonana za pomocą standardowego sprzętu rdzeniowego EM. Metoda ta ma jednak pewne nieuniknione ograniczenia, które wynikają z ograniczeń technicznych. Jednym z nich jest to, że materiał jest nieuchronnie tracony między sekcjami seryjnymi, pozostawiając luki w połączonej rekonstrukcji. Drugi to brakujący artefakt klina, który powstaje z powodu ograniczonych kątów nachylenia, które są osiągalne. To ograniczenie występuje, ponieważ uchwytu próbki nie można obrócić w pełnym obrocie bez zablokowania wiązki elektronów. Pomimo tych ograniczeń, tomografia elektronowa o przekroju szeregowym zapewnia wystarczającą rozdzielczość, aby ujawnić ultrastrukturę komórek i organelli w 3D.
W przypadku obrazowania na mniejszą skalę, krioelektronowa tomografia jest nową technologią, którą można wykorzystać do uzyskania struktury kompleksów i zespołów makromolekularnych in situ w rozdzielczości nm lub sub-angstrem w połączeniu z rekonstrukcją subtomograficzną3. W tym zastosowaniu komórki są rozrzedzane przez cięcie lub mielenie wiązką jonów w ciekłym azocie. Tomogramy są zbierane w warunkach kriogenicznych, w których struktury molekularne są zachowane blisko stanu rodzimego bez chemicznego utrwalania, odwadniania lub osadzania. Z drugiej strony, do analizy dużych objętości tkanek kosztem rozdzielczości, seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa z blokową powierzchnią jest atrakcyjną metodą, mimo że wymaga specjalnego instrumentu4.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Badania zostały przeprowadzone w rdzeniu EM w Instytucie Biologii Komórkowej i Organizmów oraz w rdzeniu cryo-EM Academia Sinica, Tajpej, Tajwan. Prace były wspierane przez Academia Sinica i MOST.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikrotom z wibracyjnym ostrzem | Leica | VT1200S | |
| Zamrażarka wysokociśnieniowa | Leica | EM HPM100 | Urządzenie do przygotowywania próbek |
| zamiany | Leica | EM AFS2 | Przygotowanie próbek |
| ultramikrotom | Leica | EM UC7 | Ultracienki |
| uchwyt do tomografii dwuosiowej | Fischione | Kolekcja tomografii | model 2040 |
| transmisyjny mikroskop elektronowy | FEI | Tecnai F20 | kolekcja tomografii |
| CCD | Gatan | UltraScan 1000 | kolekcja tomografii |
| Leginon | NRAMM/AMI | ||
| IMOD | 3D electron Microscan of Cells | ||
| Analiza tomografii | Avizo 3D | FEI |
Bibliografia
- Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice. J Electron Microsc Tech. 13 (3), 165-174 (1989).
- Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. J Struct Biol. 172 (2), 169-179 (2010).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), e329(2004).
- Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).
- Soto, G. E., et al. Serial section electron tomography: a method for three-dimensional reconstruction of large structures. Neuroimage. 1 (3), 230-243 (1994).
- Jiang, Y. F., et al. Electron tomographic analysis reveals ultrastructural features of mitochondrial cristae architecture which reflect energetic state and aging. SciRep. 7, 45474(2017).
- Cogliati, S., Enriquez, J. A., Scorrano, L. Mitochondrial Cristae: Where Beauty Meets Functionality. TrendsBiochemSci. 41 (3), 261-273 (2016).
- Friedman, J. R., Nunnari, J. Mitochondrial form and function. Nature. 505 (7483), 335-343 (2014).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J Struct Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).
Przedruki i uprawnienia
