Ultrastruktura mitochondrialna 3D mięśnia lotu pośredniego Drosophila ujawniona przez tomografię elektronową o przekroju szeregowym

Mikroskopia elektronowa jest cennym narzędziem do badania kontekstu strukturalnego zespołów subkomórkowych i organelli, które wykonują procesy komórkowe. Opracowano metody zachowania ultrastruktury tkanek lub komórek poprzez chemiczne wiązanie aldehydami lub zamrażanie pod wysokim ciśnieniem (HPF), a następnie podstawienie przez zamrożenie (FS)^1,2. Osadzone bloki próbki można następnie podzielić, wybarwić i obserwować za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM). Próbka HPF może być również przetwarzana w warunkach kriogenicznych, takich jak kriosekcja lub mielenie skupionej wiązki jonów (FIB), i obserwowana przez cryo-EM^3,4.

Chociaż cienki przekrój EM dostarcza pouczających spostrzeżeń morfologicznych, wynikowe obrazy 2D mogą ujawnić tylko ultrastrukturę określonego przekroju. Sposób, w jaki ultrastruktura jest zorganizowana w objętości 3D, pozostaje niejasny. W celu wizualizacji ultrastruktury komórkowej w trzech wymiarach opracowano metodę tomografii elektronowej, w której uzyskano serię obrazów nachylenia i ponownie wyświetlono je w celu wygenerowania rekonstrukcji tomograficznej⁵ (Rysunek 1). Serię podwójnego przechyłu można zebrać, obracając próbkę o 90° i uzyskując drugą serię przechyłu. Zminimalizuje to artefakty brakującego klina, które wynikają z ograniczonych kątów próbkowania i poprawi rozdzielczość tomogramu.

Tutaj opisujemy zastosowanie tomografii elektronowej o przekroju szeregowym do badania ultrastruktury mitochondriów mięśni lotu pośredniego (IFM)^6,7,8,9. W celu uzyskania rekonstrukcji 3D obejmujących całe mitochondria (o grubości około 2,5 μm) uzyskano seryjne odcinki z bloków tkankowych Drosophila IFM. Tomogramy każdej sekcji zostały zebrane indywidualnie za pomocą oprogramowania do automatycznego zbierania danych. Wykonano rekonstrukcje tomograficzne i połączono tomogramy seryjne z pakietem IMOD w celu uzyskania zrekonstruowanej objętości całego mitochondrium. Połączone tomogramy zostały przeanalizowane przez oprogramowanie 3D. Gęstości grzebień mitochondrialnych zostały podzielone na segmenty w celu wygenerowania modelu segmentacji, który ujawnił organizację w trzech wymiarach.

1. Sekcja tkanek Drosophila za pomocą mikrotomu z wibrującym ostrzem

1. Znieczul Drosophila na lodzie i zanurz każdą pojedynczą muchę w 1 ml 4% niskotopliwej agarozy w buforze fosforanowym. Pozwól agarozie zastygnąć na lodzie. Zazwyczaj przetwarzano 4 - 6 much.
2. Za pomocą mikrotomu z wibrującymi ostrzami pokrój żel agarozowy zatopiony w Drosophila na plastry o grubości 100 μm i zanurz w roztworze utrwalającym zawierającym 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze fosforanowym.
   UWAGA: Preferowane jest cięcie wibratomem, ponieważ architektura tkanek pozostaje bardziej nienaruszona w porównaniu z innymi metodami. Alternatywnie, pęseta preparcyjna może być użyta do rozwarstwienia IFM do roztworu utrwalającego zawierającego 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze fosforanowym.

2. Przygotowanie próbek EM metodą wysokociśnieniowego zamrażania i podstawiania przez zamrażanie (HPF/FS)

1. Umyj skrawki tkanek w 3 kroplach (~150 μL) buforu fosforanowego, a następnie w 2 kroplach (~100 μL) buforu fosforanowego z 20% BSA. Następnie umieść skrawki w złotych nośnikach dla HPF wypełnionych buforem i 20% BSA.
2. Załaduj próbkę zawierającą nośniki do zamrażarki wysokociśnieniowej zgodnie z instrukcją obsługi.
3. Po zamrożeniu uwolnić nośniki z uchwytu pod ciekłym azotem i przenieść do urządzenia do zamrażania i substytucji schłodzonego do temperatury -140 °C.
4. Wykonaj protokół zamrażania-substytucji, jak pokazano w Tabeli 1, z koktajlem FS zawierającym 2% aldehydu glutarowego, 2% tetratlenku osmu i 0,1% octanu uranylu w acetonie.
5. Ostrożnie wyjmij próbki z nośników za pomocą igły i zanurz próbki w żywicy w temperaturze pokojowej. Polimeryzować żywicę w temperaturze 65 °C przez 16 godzin.
   UWAGA: Protokoły FS powinny zostać zmodyfikowane w celu przygotowania innych rodzajów próbek. HPF/FS jest preferowany w celu zachowania ultrastruktury i zminimalizowania utraty zawartości komórkowej.
   1. Alternatywnie zastosuj protokół utrwalania chemicznego. Utrwalić próbki 2,5% aldehydem glutarowym przez noc, przemyć, a następnie utrwalić 1% tetratlenkiem osmu przez 2 godziny. Przemyć i odwodnić rosnącym stężeniem etanolu, a następnie infiltrować i zatapiać próbki w żywicy Spurra przed polimeryzacją w temperaturze 65 °C przez 16 godzin.

3. Przygotowanie seryjnych przekrojów próbek do tomografii elektronowej

1. Przytnij bloki próbki, aby odsłonić żądaną powierzchnię bloku zawierającą tkankę.
2. Cząstki złota (o średnicy 10 nm) należy wstępnie traktować 1% powierzchnią ciała przez 30 minut. Przemyć i zawiesić cząsteczki złota w buforze PBS. Nakładaj cząsteczki złota na miedziane siatki szczelinowe pokryte folią węglową, aby stworzyć znaczniki odniesienia.
3. Sprawdź w TEM, czy w polu widzenia akwizycji tomografii znajduje się wystarczająca ilość markerów odniesienia (co najmniej 5 - 10 markerów).
4. Cięcie odcinków szeregowych o grubości 200 - 250 nm za pomocą ultramikrotomu.
5. Zbieraj sekcje szeregowe na siatkach szczelin za pomocą idealnej pętli dla cienkich sekcji.
6. Zabarwić skrawki cytrynianem ołowiu Reynoldsa przez 10 minut.
7. Nałóż drugą warstwę fiducialnych cząstek złota na wierzch sekcji.

4. Zbierz tomografię elektronową z podwójnym pochyleniem

1. Załadować siatkę na dwuosiowy uchwyt tomograficzny i włożyć do transmisyjnego mikroskopu elektronowego pracującego pod napięciem 200 kV.
2. Ustaw mikroskop w ogniskowej eucentrycznej.
3. Skonfiguruj oprogramowanie do automatycznego zbierania danych. Dostosuj i wyrównaj wiązkę elektronów przy ustawieniu obrazowania wieloskalowego. Szczegółowe informacje na temat obsługi można znaleźć w instrukcji obsługi¹⁰ (Rysunek 2).
4. Uzyskuj ciemne i jasne referencje z kamery w pustym obszarze bez filmu węglowego przy ustawieniu kolekcji tomografii.
5. Zbierz atlas siatki w małym powiększeniu. Wybierz mitochondria na odcinkach szeregowych jako cele do pobrania tomografii.
6. Uzyskaj serię pochylenia od -60° do +60° z krokami co 2° na osi-A dla każdego celu.
   UWAGA: Kąty nachylenia będą ograniczone mechanicznie przez konstrukcję uchwytu na próbki. Uchwyt zablokuje belkę pod dużymi kątami nachylenia.
7. Aby zebrać drugą serię przechyłu, obróć uchwyt próbki o 90°. Zdobądź nowy atlas. Wybierz odpowiednie pozycje i uzyskaj serię pochylenia na osi-B dla każdego celu.
   UWAGA: Inne pakiety oprogramowania, takie jak SerialEM i Xplore3D, są dostępne do automatycznego zbierania danych.

5. Rekonstrukcja tomogramów 3D i podobjętości segmentów za pomocą oprogramowania

1. Rekonstrukcja tomogramów obrazów pochylenia dwuosiowego za pomocą oprogramowania IMOD¹¹.
   1. Szczegółowe informacje na temat obsługi można znaleźć w instrukcji obsługi.
   2. Wyrównaj poszczególne serie pochylenia według pozycji złotych znaczników odniesienia. Rekonstrukcja tomogramów za pomocą metody projekcji wstecznej lub metody techniki symultanicznej rekonstrukcji iteracyjnej (SIRT) odpowiednio dla osi A i osi B (Rysunek 3).
   3. Połącz tomogramy osi-A i osi-B, aby wygenerować tomogram o podwójnym przechyleniu ze zmniejszonym brakującym artefaktem klina.
   4. Połącz ze sobą tomogramy o podwójnym pochyleniu odcinków szeregowych, aby uzyskać rekonstrukcje obejmujące całą objętość mitochondrium. Modelowanie przerw między sekcjami szeregowymi za pomocą programu IMOD.
   5. Przytnij połączone tomogramy i pojemnik do żądanego rozmiaru w celu segmentacji objętości.
2. Analizuj połączone tomogramy seryjne za pomocą oprogramowania 3D.
   1. Szczegółowe informacje na temat obsługi można znaleźć w instrukcji obsługi.
   2. Przefiltruj tomogramy za pomocą filtra Gaussa (lub innej pożądanej metody), aby poprawić kontrast cech i zmniejszyć gęstość tła.
   3. Segmentacja ultrastruktury mitochondriów ręcznie lub automatycznie.
   4. Wyświetlanie modeli segmentacji w celu umożliwienia inspekcji w 3D.
   5. Generuj filmy za pomocą narzędzi dostępnych w 3D.

Zastosowaliśmy tomografię elektronową o przekroju szeregowym, aby przeanalizować cechy strukturalne grzebienia mitochondrialnego, które odzwierciedlają ich stan energetyczny i starzenie się. Wykazaliśmy, że mitochondria Drosophila IFM tworzą zintegrowaną sieć grzebień i macierzy w 3D ( Rysunek 4) < sup class = "xref">7. Ponadto zmutowane muchy z defektem replikacji mitochondrialnego DNA i fenotypem przyspieszonego starzenia się zgromadziły mitochondria, które zawierały podsekcje przypominającego cebulę wirującego rdzenia (Ryc. 5)7.

Rysunek 1: Ilustracja rekonstrukcji tomografii elektronowej na podstawie serii pochylenia. W eksperymencie wiązka elektronów jest przepuszczana przez obiekt 3D, gdy obiekt jest nachylony pod różnymi stopniami. Dla każdego warunku pochylenia generowana jest projekcja 2D, która jest rejestrowana za pomocą kamery. Rzuty 2D są następnie rzutowane z powrotem w celu zrekonstruowania obiektu 3D w oparciu o twierdzenie o centralnym przekroju. Na ilustracji ten sam proces jest pokazany dla oryginalnego obrazu 2D, który jest rzutowany do jednego wymiaru pod różnymi kątami nachylenia. Projekcje 1D są następnie wykorzystywane do rekonstrukcji obrazu 2D. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Automatyczne zbieranie danych. Przeglądarka obrazów wyświetlająca oprogramowanie pokazujące atlas siatki szczelinowej zawierającej sekcje szeregowe, wieloskalowe celowanie w mitochondria i uzyskane obrazy pochylenia. Podziałka = 500 μm (lewy górny panel), 100 μm (lewy dolny panel), 1 μm (prawy panel). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 3: Tomografia elektronowa przekroju szeregowego pojedynczego mitochondrium w mięśniu lotu pośredniego Drosophila. (A) mikrofotografie 2D i (B) tomogramy 3D z odcinków seryjnych obejmujących całą objętość mitochondrium. (C) Połączone tomogramy o przekroju szeregowym są rzutowane tak, aby utworzyć przekrój podłużny, z osią z pokazaną pionowo. Warto zauważyć, że sekcje tkanek prowadziły do utraty materiału, pozostawiając luki między połączonymi tomogramami. Podziałka = 500 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Zintegrowana sieć wewnątrz mitochondriów i macierzy ujawniona w 3D. (A) Wycinki mitochondrialnych rekonstrukcji tomografii elektronowej pokazujące przejścia między błonami blaszkowymi przez oś z. (B) Ilustracje obserwowanych wzorów przełączania się grzebieniaków prawoskrętnych i/lub lewoskrętnych spiral. (C) Segmentacja tomograficzna ilustrująca lewoskrętną spiralę w 3D (D) Wzorce przełączania Cristae zostały przeanalizowane i odwzorowane kolorystycznie na modelu segmentacji (E, F). Wycinek tomograficzny przedstawiający zbieg macierzy bocznej (ciemne gęstości, zaznaczone na czerwono) w poprzek błon grzebiczastych (gęstości białe). (G) Model segmentacji tomogramu w (E) pokazujący zbieganie się macierzy bocznej (na czerwono) i reprezentatywne cristae (na szaro). Podziałka = 50 nm (A), 200 nm (C) i 300 nm (D, E, F, G). Rysunek był przedrukiem z Jiang et al.7 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 5: Mitochondria z wirującymi rdzeniami przypominającymi cebulę zgromadzone u muszek z defektami replikacji mitochondrialnego DNA podczas starzenia. Reprezentatywne przekroje tomograficzne i odpowiadające im segmentacje (prawe panele) przedstawiające przekrój poprzeczny (na górze) i przekrój podłużny (na dole) wirującego rdzenia. Segmentacja objętości jest wskazywana przez dowolne oddawanie kolorów w celu podkreślenia wirującego rdzenia. Podziałka: 200 nm. Rysunek był przedrukiem z Jiang et al.7 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Protokół zamrożenia i podstawiania.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.