Artykuł metodologiczny

Ruch w górę: prosty i elastyczny protokół trójwymiarowego testu inwazyjnego in vitro

5.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56568

⸱

12 marca 2018

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota - Twin Cities, 2Stem Cell Institute, University of Minnesota - Twin Cities, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota - Twin Cities, 4Lillehei Heart Institute, University of Minnesota - Twin Cities, 5Institute for Engineering in Medicine, University of Minnesota - Twin Cities, 6Department of Biology, Jackson State University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje odwrócony test inwazji pionowej, który może być użyty do ilościowego określenia zdolności migracji i inwazji komórek w trójwymiarowym otoczeniu, przy jednoczesnym zachowaniu mikrośrodowiska komórki. Ten test jest odpowiedni dla rzadkich i/lub wrażliwych komórek.

Streszczenie

Chociaż testy inwazji 3D zostały już opracowane, wyzwaniem pozostaje badanie komórek bez wpływu na integralność ich mikrośrodowiska. Tradycyjne testy 3D, takie jak komora Boydena, wymagają, aby komórki zostały przemieszczone z pierwotnej lokalizacji hodowli i przeniesione do nowego środowiska. Nie tylko zaburza to procesy komórkowe, które są nieodłącznie związane z mikrośrodowiskiem, ale często prowadzi do utraty komórek. Problemy te są szczególnie trudne, gdy mamy do czynienia z komórkami, które są albo rzadkie, albo niezwykle wrażliwe na swoje mikrośrodowisko. W tym miejscu opisujemy rozwój testu inwazji 3D, który pozwala uniknąć obu tych problemów. W tym teście komórki są siane w małym studzienku, a na komórkach umieszcza się matrycę ECM zawierającą chemoatraktant. Nie wymaga to przemieszczenia komórek i pozwala komórkom na inwazję w górę matrycy. W tym teście można ocenić inwazję komórek, a także morfologię komórek w żelu kolagenowym. Za pomocą tego testu charakteryzujemy zdolność inwazyjną rzadkich i wrażliwych komórek; komórki hybrydowe powstałe w wyniku fuzji między komórkami raka piersi MCF7 a mezenchymalnymi/multipotencjalnymi komórkami macierzystymi/zrębowymi (MSC).

Wprowadzenie

Ruchliwość komórek to normalny proces rozwojowy i fizjologiczny komórek. Jednak zmiany we wzorcu i zdolności komórek do migracji i inwazji są związane ze stanami patologicznymi, w tym chorobami zapalnymi i przerzutami raka1,2,3. Przerzuty są prawdopodobnie najsłabiej poznanym aspektem raka. Aby uzyskać przerzuty, komórki rakowe muszą zdegradować macierz zewnątrzkomórkową (ECM), zaatakować lokalną tkankę i wejść w stan wewnątrznaczyniowy. Po wejściu do krążenia komórki rakowe rozprzestrzeniają się do odległego miejsca, wynaczyniają się i tworzą guzy wtórne. Dlatego zdolność komórek do degradacji ECM, migracji i inwazji jest związana z ich potencjałem przerzutowym. Opracowano różne podejścia do analizy i ilościowego określenia zdolności komórek do migracji i inwazji. Do najczęściej stosowanych podejść należą test gojenia się ran, mikroskopia poklatkowa i test w komorze Boydena. Test gojenia się ran4 i mikroskopia poklatkowa to proste i wygodne testy, które dają wstępny wgląd w migrację komórek. Jednak oba są testami 2D, które nie odzwierciedlają środowiska 3D, w którym komórki istnieją in vivo. Badania wykazały, że komórki reagują inaczej na środowisko 3D w porównaniu z 2D one5,6. Co więcej, testy gojenia się ran są trudne do odtworzenia i uzyskania wyników ilościowych7,8,9. Test Cell Exclusion Zone, który jest modyfikacją 3D testu gojenia się ran, jest testem bardziej istotnym fizjologicznie, ale nie jest odpowiedni dla komórek o niskiej liczbie, takich jak komórki hybrydowe powstałe w wyniku fuzji komórek10,11.

Test komorowy Boydena jest testem trójwymiarowym, który dostarcza odpowiednich mikrośrodowisk do badań komórkowych. Wymaga to jednak usunięcia komórek z ich pierwotnego mikrośrodowiska i zdeponowania ich w górnej komorze systemu testów Boydena, aby migrować i atakować w dół w kierunku pożywki zawierającej chemoatraktant. To podejście 3D nie jest odpowiednie do analizy zdolności migracji i inwazji komórek podatnych na ich mikrośrodowisko i/lub ograniczonej liczby10,11,12. Nowszym podejściem do analizy migracji i inwazji komórek jest test w komorze gradientowej mikroprzepływów13. Chociaż test ten jest odpowiedni i wiarygodny w badaniach migracji i inwazji, jest droższy i może być technicznie trudny dla typowego laboratorium. Opisujemy tutaj prosty test odwróconej inwazji pionowej, który jest kompatybilny z wieloma typami komórek, w tym komórkami wrażliwymi na swoje mikrośrodowisko i/lub ograniczoną liczbą. Test ten został zaadaptowany z protokołu zaproponowanego przez Hoopera i wsp.14. W tym teście komórki pozostają w swoim pierwotnym mikrośrodowisku, a ich migracja i inwazja są monitorowane, gdy przemieszczają się w górę w żelu kolagenowym zawierającym chemoattractant11. Test ten jest powtarzalny i został zoptymalizowany i zwalidowany w 35-milimetrowej naczyniu hodowlanym. Można go dostosować do różnych warunków testowych, w tym do różnych rozmiarów hodowli komórkowych, różnych matryc lub siły adhezji oraz różnych chemoatraktantów. Test ten może służyć jako platforma in vitro do wstępnych badań przesiewowych w procesie odkrywania leków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Ten protokół jest opisany w McArdle et al.11. Oś czasu znajduje się w Rysunek 1.

1. Przygotowanie płytki hodowlanej

  1. Umyć naczynie hodowlane o średnicy 35 mm zawierające studzienkę ze szklanym dnem o średnicy 10 mm w 1 ml 1 M kwasu solnego (HCl) przez 15 minut, aby obniżyć hydrofobowość szklanego dna.
  2. Przemyć płytkę hodowlaną dwukrotnie 1 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), aby pozbyć się całego HCl.
  3. Umyj płytkę hodowlaną dwukrotnie 1 ml 70% etanolu.
  4. Przepłukać płytkę hodowlaną 1 ml pożywki do hodowli specyficznej dla komórki (tutaj użyj α-MEM uzupełnionego 10% inaktywowanego termicznie FBS i 1% aminokwasów endogennych).
    nuta: Poddaną działaniu substancji płytkę hodowlaną zawierającą pożywkę hodowlaną można przechowywać w inkubatorze CO2 z nawilżaczem w temperaturze 37 °C do następnego dnia.
  5. Hoduj komórki (MSCs i kokulturę MCF-7) w poddanej działaniu szklanego dna 35-milimetrowej szalki hodowlanej do 100% zgryzu. Wspólna hodowla 35 000 komórek MSC i 75 000 komórek MCF7 przez 24 godziny.

2. Przygotowanie żelu kolagenowego

  1. Końcówki mikropipet używane do pipetowania żelu kolagenowego należy przechowywać w zamrażarce, aby zapobiec polimeryzacji kolagenu w kontakcie.
    nuta: To jest najważniejszy krok.
  2. Określ objętość kolagenu I z ogona szczura do użycia na podstawie stężenia zapasu kolagenu. Przygotuj 100 μl żelu kolagenowego do tego testu.
    nuta: Wysokie stężenie kolagenu z ogona szczura I działa lepiej. Określ objętość 10x Zmodyfikowanego Podłoża Orła firmy Dulbecco, które ma być użyte do odpowiedniego rozcieńczenia kolagenu.
  3. Połączyć na lodzie kolagen z ogona szczura I (3,8 μg/ml bulionu), 10x Dulbecco's Modified Eagle's Medium i 1x pożywkę do hodowli komórkowych uzupełnioną 2% płodową surowicą bydlęcą i odpowiednim chemoatraktantem do końcowego stężenia kolagenu 2,4 mg/ml.
  4. Dodać do mieszaniny 4,5% roztworu wodorowęglanu sodu, aby zneutralizować żel kolagenowy.
    nuta: Objętość dodanego roztworu wodorowęglanu sodu może się różnić w zależności od dokładnego pH innych odczynników. Najlepiej jest przetestować mieszaninę za pomocą pasków pH, aby zapewnić neutralny roztwór, lub użyć wskaźnika pH w pożywce hodowlanej.
  5. Umieścić 80 μl mieszaniny kolagenu na komórkach w studzience ze szklanym dnem naczynia hodowlanego.
  6. Pozostawić żel kolagenowy do polimeryzacji przez 30 minut w inkubatorze CO2 z nawilżaczem w temperaturze 37 °C.
  7. Przykryj żel kolagenowy 2 ml pożywki komórkowej ze zredukowaną surowicą (2%) i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 z nawilżaczem przez 24, 48 lub 72 godziny
    ostrożność: Z płytką należy obchodzić się ostrożnie, aby zapobiec odklejaniu się żelu kolagenowego od szklanego dna.

3. Przykład przygotowania żelu kolagenowego przy użyciu wywaru kolagenu z ogona szczura o sile 3,8 μg /ml

  1. Na lodzie połącz 114,5 μl kolagenu z ogona szczura, 16,6 μl 10x DMEM i 33,1 μl pożywki hodowlanej zawierającej chemoatraktant.
  2. Zneutralizować mieszaninę kolagenu za pomocą 14,0 μl wodorowęglanu sodu.
  3. Postępuj jak w kroku 2.5.

4. Obrazowanie komórek

  1. Delikatnie wyjmij nośnik z naczynia.
  2. Delikatnie spłucz żel 1 ml PBS.
  3. Utrwal komórki 1 ml 4% paraformaldehydu przez 15 minut.
  4. Umyj komórki dwukrotnie 1 ml PBS.
  5. Wybarwić komórki roztworem DAPI (100 ng/ml) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego w różnych miejscach i wykonaj obrazy 400 μm z-stack każdego miejsca w krokach co 16 μm. Zastosowany mikroskop posiada dyskowy zespół skanujący, który umożliwia obrazowanie konfokalne za pomocą światła białego, źródła wzbudzenia łukowego. Użyj obiektywu 20X z przysłoną numeryczną 0,75.
  7. Odtwórz obrazy .
    1. Otwórz obrazy dla danego żelu (około 25 obrazów) i utwórz stos obrazów, klikając obraz → układa → obrazy do stosu. Pierwszy obraz odpowiadał dnu żelu (z = 0 μm), drugi obraz odpowiadał pierwszemu krokowi w kierunku z (z = 16 μm), trzeci obraz odpowiadał drugiemu krokowi w kierunku z (z = 32 μm). Oceń każde jądro na każdej głębokości obrazu i wyznacz głębokość, na której jądro było w najostrzejszej ostrości, jako głębokość inwazji dla tej konkretnej komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Do opracowania i optymalizacji protokołu testu inwazji 3D in vitro wykorzystaliśmy naczynie hodowlane o średnicy 35 mm z szklanym dnem oraz kolagen I z ogona szczura. Przeprowadzony test wykazał, że komórki raka piersi MCF7 oraz komórki MSC potrafiły wniknąć w żel kolagenowy na średnią odległość odpowiednio 0,04 ± 1,8 µm i 41,3 ± 76,0 µm po 48 h, gdy w roli chemoatraktanta zastosowano IGF1 (18,6 ng/mL) (Rycina 2). Co ważniejsze, wykazaliśmy, że produ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj opisujemy prosty test odwróconej inwazji pionowej, który jest wygodny dla różnych typów komórek, w tym komórek rzadkich i / lub zależnych od ich mikrośrodowiska. W tym teście inwazji 3D komórki pozostają w swoim pierwotnym mikrośrodowisku i są pokryte żelem kolagenowym zawierającym chemoatraktant. Komórki następnie migrują i atakują kolagen. W tym teście komórki mogą być barwione i łatwo monitorowane w żelu. Prostota i powtarzalność tego testu sprawia, że jest to wygodne narzędzie do badania migracji i inwazji komó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczyli, że nie istnieje żaden konkurencyjny interes.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (NIMHD-G12MD007581) przez RCMI-Center for Environmental Health na Uniwersytecie Stanowym Jackson oraz Departament Obrony USA, Idea Award 11-1-0205.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MatTek P35G-1.5-10CMatTek Corporation, Ashland, MAP35G-1.5-10-CNaczynia ze szkła matowego
Kolagen z ogona szczura ICorning, Corning, NY, USA354236Żel kolagenowy
Kwas solnySigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USAH1758HCl
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemThermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA10010023Pbs
10X Dulbecco's Modified Eagle's MediumSigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USAD242910X DMEM
Wodorowęglan soduSigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USAS5761NaHCO3
konfokalny mikroskop fluorescencyjnyOlympus America, Center Valley, PA, USAkoncentrycznyOlympus IX81
Zdefiniowana płodowa surowicabydlęcaGE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USASH30070.03FBS
Ti:Sapphire wielofotonowy laserowy mikroskop skaningowyPrarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA40x NA 0,8 obiektywMPLSM
Oprogramowanie ImarisBitplane Inc. Zurych, CHImaris 7.5.2Imaris oprogramowanie
DAPISigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USAD9542DAPI
ParaformaldehydThermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, StanyZjednoczone 50980487PFA
&alfa--minimum niezbędne podłożeSigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USAM0894
MDA-MB-231ATCC; Manassas, Wirginia, Stany ZjednoczoneHBT-22
MSCTrivedi i Hematti, 2007
Obiektyw 20X UPLAPOOlympus America, Center Valley, PA, USA36-064Obiektyw Olympus UPLSAPO 20X
Mikroskop

Bibliografia

  1. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  2. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
  3. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
  4. Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21(2004).
  5. Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).
  6. Sahai, E., Marshall, C. J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).
  7. Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro. BMC Cancer. 8, 198(2008).
  8. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).
  9. Poujade, M., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).
  10. Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis. FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).
  11. McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types. J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).
  12. Noubissi, F. K., Ogle, B. M. Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel. Int J Mol Sci. 17, (2016).
  13. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).
  14. Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).
  15. Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat Materials. 13, 645-652 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

3D test inwazjiel kolagenowymigracja kom rekmikroskopia konfokalnachemoatraktantkom rki raka piersiprodukty fuzji kom rkowejmacierz ECMtraktowanie kwasem solnymutrwalanie paraformaldehydem

Powiązane artykuły