Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Poszukiwanie ścieżek napędzających nabytą oporność na terapię celowaną: wytwarzanie subklonów opornych na leki i przywracanie wrażliwości przez knock-down genów

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56583

⸱

11 grudnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS

W tym artykule

Podsumowanie

To jest efektywny czasowo i kosztowo protokół in vitro, badający mechanizmy nabytej oporności na ukierunkowane środki terapeutyczne, co jest wysoce niezaspokojoną potrzebą medyczną w leczeniu raka.

Streszczenie

Ostatnie dwie dekady przyniosły przejście od leków cytotoksycznych do terapii celowanej w onkologii medycznej. Chociaż celowane środki terapeutyczne wykazały bardziej imponującą skuteczność kliniczną i zminimalizowane działania niepożądane niż tradycyjne metody leczenia, oporność na leki stała się głównym ograniczeniem ich korzyści. W praktyce klinicznej opracowano kilka przedklinicznych modeli nabytej oporności na leki celowane in vitro/in vivo, głównie przy użyciu dwóch strategii: i) manipulacji genetycznej w celu modelowania genotypów nabytej oporności oraz ii) selekcji modeli oporności in vitro/in vivo. W niniejszej pracy proponujemy ujednolicenie ram do badania mechanizmów leżących u podstaw nabywanej oporności na celowane środki terapeutyczne, począwszy od generacji lekoopornych subklonów komórkowych, a skończywszy na opisie procedur wyciszania stosowanych w celu przywrócenia wrażliwości na inhibitor. To proste, efektywne czasowo i kosztowo podejście ma szerokie zastosowanie i może być łatwo rozszerzone w celu zbadania mechanizmów oporności na inne celowane leki terapeutyczne w różnych histotypach guza.

Wprowadzenie

Podążając za kluczowymi odkryciami w biologii molekularnej i komórkowej, opracowano szereg nowych syntetyzowanych cząsteczek przeciwnowotworowych, które selektywnie celują w onkogenne szlaki sygnałowe w szerokim zakresie typów nowotworów. W szczególności wiadomo, że dwie kategorie celowanych środków terapeutycznych o unikalnych właściwościach w onkologii, a mianowicie syntetyczne związki chemiczne i rekombinowane przeciwciała monoklonalne, osiągnęły sukcesy kliniczne i radykalnie zmieniły opiekę onkologiczną w ostatnich dziesięcioleciach1,2,3.

Niemniej jednak, pomimo imponującej początkowej odpowiedzi na leczenie, większość pacjentów z rakiem rozwinęła lekooporność na wszystkie ukierunkowane środki terapeutyczne, zarówno przeciwciała monoklonalne, jak i inhibitory kinaz. W związku z tym oporność na leki, główna przeszkoda dla klasycznych leków przeciwnowotworowych4, jest nadal wielkim wyzwaniem dla pojawiających się terapii celowanych5,6.

Oporność na terapię celowaną może być wrodzona (tj. pierwotna) lub nabyta (tj. wtórna). Oporność wewnętrzna opisuje brak odpowiedzi na leczenie de novo, podczas gdy oporność wtórna występuje po okresie odpowiedzi na leczenie farmakologiczne7. Ta ostatnia jest spowodowana wybuchami małych kohort komórek nowotworowych w obrębie większości pierwotnego guza lub zagnieżdżonych w dystalnych kryptycznych niszach anatomicznych, wykazujących do 90% oporności na jeden lub więcej ukierunkowanych środków terapeutycznych. Mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju oporności na terapię celowaną wynikają głównie z mutacji genów docelowych i nadmiarowej aktywacji innych szlaków sygnałowych sprzyjających przetrwaniu, których zrozumienie jest nadal dalekie od ukończenia8.

W tej pracy zaproponowaliśmy efektywne czasowo i kosztowo podejście do badania in vitro mechanizmów nabytej oporności na ukierunkowane środki terapeutyczne, zaczynając od generowania lekoopornych subklonów komórkowych do opisu procedur wyciszania stosowanych do przywracania wrażliwości na inhibitor, kluczowego narzędzia używanego do testowania i walidacji hipotez roboczych. W szczególności nasze podejście zostało wykorzystane do zbadania, w raku żołądka, mechanizmów oporności na trastuzumab (np. Herceptin), humanizowane przeciwciało monoklonalne skierowane do domeny zewnątrzkomórkowej białka HER29. Trastuzumab + chemioterapia jest powszechnie akceptowana jako standardowe leczenie pierwszego rzutu HER2-dodatniego raka piersi z przerzutami. Dzięki niedawnym badaniom przedklinicznym wykazującym, że terapie anty-HER2 mają znaczącą aktywność zarówno in vitro, jak i in vivo HER2-dodatnich modeli raka żołądka10,11, leki molekularne ukierunkowane na HER2 zostały szeroko przebadane w badaniach klinicznych, z których część jest nadal w toku, na pacjentach z rakiem żołądka i przełyku12,13,14,15.

Te badania podkreśliły rosnącą liczbę pacjentów doświadczających oporności na trastuzumab16, podobnie jak w przypadku innych celowanych inhibitorów terapeutycznych. W szczególności odsetek odpowiedzi na trastuzumab wynosił 47%, a mediana całkowitego przeżycia u pacjentów przyjmujących trastuzumab + chemioterapia była tylko o 2,7 miesiąca dłuższa niż u pacjentów przyjmujących samą chemioterapię17. Sugeruje to, że podczas gdy pierwotna oporność na trastuzumab jest powszechna, wtórna oporność na trastuzumab jest nieunikniona. Z tego powodu istnieje pilna potrzeba wyjaśnienia mechanizmów powodujących oporność na terapię ukierunkowaną na HER2 w raku żołądka, co jest jeszcze bardziej problematyczne, biorąc pod uwagę wewnątrznowotworową heterogeniczność genetyczną tej nowotworu18.

Ponadto, mechanizmy oporności na trastuzumab w raku żołądka okazały się trudne do wyjaśnienia, częściowo z powodu trudności w uzyskaniu wiarygodnych modeli przedklinicznych reprezentatywnych dla tego schorzenia. Oshima i wsp. opisali metodę selekcji in vivo linii komórkowych raka żołądka opornych na trastuzumab, polegającą na wielokrotnym posiewie niewielkiego resztkowego przerzutu do otrzewnej po leczeniu trastuzumabem19. Jednak potrzeba wybiegu, specjalistycznej wiedzy w zakresie obchodzenia się ze zwierzętami oraz zatwierdzenia przez Komisję Etyki Zwierząt przyczyniła się do tego, że metoda ta stała się czasochłonna i kosztowna. Podejście, które opisujemy w tej pracy, jest proste i ma szerokie zastosowanie, i może być łatwo rozszerzone w celu zbadania mechanizmów oporności na inne leki terapeutyczne w różnych histotypach nowotworów20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Ten protokół został specjalnie dostosowany do analizy mechanizmów leżących u podstaw nabytej oporności na trastuzumab HER-dodatnich linii komórkowych raka żołądka. Wszystkie potrzebne przyrządy laboratoryjne są podane w Tabeli Materiałów.

1. Generacja subklonów odpornych na terapię celowaną

UWAGA: Jest to najbardziej krytyczny i trudny do standaryzacji krok w protokole ze względu na fakt, że różne linie komórkowe mogą wykazywać różną wrażliwość na celowany inhibitor terapeutyczny, niezależnie od ich histotypu guza lub stężenia zastosowanego leku.

  1. Hodowla linii komórkowej NCI-N87 w pożywce RPMI uzupełniona płodową surowicą cielęcą (10%) i glutaminą (2 mM, 1%) jako monowarstwą w temperaturze 37 °C i wysiewem na 25 cm2 kolby hodowlane.
  2. Dodać do pożywki w każdej kolbie 10 μg/ml trastuzumabu jako dawkę początkową. Wystawić komórki na działanie dawki początkowej do momentu wznowienia wzrostu.
    UWAGA: Dawka początkowa inhibitora terapii celowanej powinna być 10-krotnie mniejsza niż jego maksymalne stężenie w osoczu. Maksymalne stężenie leku w osoczu jest najwyższym poziomem stężenia leku wykrywanym we krwi pacjenta, zwykle po wielokrotnym podaniu dawki standardowego leczenia. Wartość tę można uzyskać z badań farmakokinetycznych.
  3. Monitoruj wzrost komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego; gdy wzrost komórek zostanie wznowiony (zwykle po okresie od dwóch do trzech tygodni), należy wystawić komórki na działanie 10-krotnie wyższej dawki trastuzumabu.
  4. Poddać komórki stopniowo zwiększającej się dawce trastuzumabu (od 100 μg/ml do 400 μg/ml) do momentu, gdy komórki będą rosły (po około 2 tygodniach) pomimo obecności wysokiego stężenia leku (co najmniej 2,5 - 4-krotnie wyższego niż pik w osoczu).
  5. Wykonać test klonogenny w celu oceny poziomu oporności na terapię celowaną przy każdej zmianie stężenia inhibitora terapii docelowej w pożywce hodowlanej i zdefiniować wskaźnik względnej oporności IC50 (RR IC50) w następujący sposób.
    1. Wysiewaj 500 komórek na 24 wielodołkowych płytkach hodowlanych.
      UWAGA: Dla każdego zestawu warunków należy przygotować 5 studzienek.
    2. Wystawić komórki na działanie zwiększających się stężeń inhibitora terapii celowanej (trastuzumabu) od 100 μg/ml do 400 μg/ml.
    3. Inkubować komórki w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 15 dni.
    4. Po inkubacji utrwalić i wybarwić próbki w następujący sposób.
      1. Usuń pożywkę i spłucz komórki 10 ml 1x PBS. Usunąć 1x PBS i dodać 2 - 3 ml roztworu utrwalającego (kwas octowy: metanol, 1:7, (obj./obj.)). Usunąć roztwór utrwalający i dodać 0,5% roztworu fioletu krystalicznego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny
      2. Ostrożnie usunąć roztwór fioletu krystalicznego, zasysając go pipetą, a następnie zanurzyć płytki w wodzie z kranu, aby spłukać wszelkie pozostałości roztworu fioletu krystalicznego. Suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej do 2 dni.
    5. Policz kolonie liczące ponad 50 komórek za pomocą mikroskopu odwróconego (4-krotne powiększenie).
      UWAGA: Do tego potrzebnych jest dwóch niezależnych obserwatorów.
    6. Obliczyć RR IC50 jako stosunek wartości IC50 komórek subklonów opornych na terapię celowaną do wartości komórek pierwotnych/nieleczonych.

2. Protokół walidacji dla potencjalnego genu oporności na terapię celowaną (gen R)

UWAGA: Po scharakteryzowaniu ekspresji genów, sygnatury związane z nabytą opornością na terapię celowaną i dowolnym genem kandydującym jako czynnik wywołujący oporność będą badane poprzez: a) RT-PCR i b) analizę Western blot.

  1. RT-PCR w czasie rzeczywistym
    1. Ekstrahować całkowite RNA z linii komórkowych za pomocą mieszaniny kwasu tiocyjanianu guanidyny, fenolu i chloroformu (patrz tabela materiałów).
    2. Przeprowadzić reakcje odwrotnej transkrypcji (RT) przy użyciu losowych starterów heksamerów i ustawić termocykler w następujący sposób: zalewanie w temperaturze 25 °C przez 5 minut, RT w temperaturze 46 °C przez 20 minut i inaktywacja RT w temperaturze 95 °C przez 1 minutę.
    3. Użyj 400 ng całkowitego RNA do reakcji 20 μl. Przygotować mieszaninę reakcyjną dla próbki w następujący sposób: 7 μl H2O wolne od RNaz, 2 μl cDNA (10 ng / μL), 1 μL 20x znakowana fluorescencyjnie sonda specyficzna dla celu i 10 μL 2x Mieszanina zawierająca bufor, dNTP i polimerazę DNA (patrz tabela materiałów).
    4. Dodać 20 μl mieszaniny reakcyjnej do każdej płytki dołka i uruchomić następujący program: etap utrzymywania w temperaturze 50 °C przez 2 minuty, w temperaturze 95 °C przez 10 minut (1 cykl); następnie 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s i w temperaturze 60 °C przez 1 minutę.
  2. Plama zachodnia
    1. Odzyskaj zawiesiny komórek, dodając 2 ml 0,05% roztworu trypsyny/EDTA i pozostawiając 2-3 minuty na działanie trypsyny.
    2. Dodać 2 objętości pożywki zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej w celu zneutralizowania trypsyny (np. 2 ml pożywki na każdy 1 ml trypsyny) i odwirować przy 1,200 x g przez 5 min. Odrzucić supernatant i przemyć komórki zimnym 1x PBS.
    3. Wirować przy 1 200 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy z buforem do lizy i inkubować na kołysku w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
      1. Ilość buforu do lizy zależy od liczby komórek (np. 100 μl na 1 x10 6 komórek); należy pamiętać o każdorazowym przygotowaniu nowego buforu do lizy. Na 1 ml preparatu buforowego do lizy (pozostawić na lodzie): użyć 975 μL M-PER Bufor lizatu ssaków, 15 μl inhibitorów proteazy i fosfatazy oraz 10 μl 100 μM inhibitorów PMSF.
    4. Odzyskać białko sklarowane nad osadem przez odwirowanie lizatu komórkowego w temperaturze 13 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut.
    5. Określ stężenia białek za pomocą testu białka BCA.
    6. Dodać 4x LaemmLi Sample Buffer do próbek białka (co najmniej 20 - 30 μg białka) i podgrzewać w temperaturze 100 °C przez 3 min.
    7. Użyj prefabrykowanych żeli 4 - 20% i załaduj 20 - 30 μg roztworu białka LaemmLi i 5 - 10 μl wzorca białkowego na próbkę.
    8. Napełnij pierścień Western blot buforem TRIS/GLICYNE /SDS 1x i uruchom żel pod napięciem 110 V przez 30 - 60 min (gdy czas się zatrzyma, sprawdź, czy barwnik dotarł do końca żelu, w przeciwnym razie uruchom przez kilka dodatkowych minut)
    9. Elektroblot do przenoszenia białka do membrany PVDF (patrz Tabela materiałów) przy użyciu systemu półsuchego.
    10. Zablokuj membranę, mocząc w odpowiednim roztworze białkowym (mleko/BSA 5%) na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    11. Przygotować roztwór w stosunku 1:400 z przeciwciałem pierwszorzędowym anty-IQGAP1 w 5% roztworze mleka (patrz tabela materiałów).
    12. Umieść membranę w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego na wytrząsarce w chłodnym pomieszczeniu na noc.
    13. Następnego dnia wyrzuć roztwór przeciwciała i zanurz w T-TBS 1x roztwór (1x T-TBS: 1x Tris Saline Buffer dodany przez Tween20 0,1%) na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 7 min.
    14. Wyrzuć roztwór T-TBS 1x i wymień. Powtórz 3 razy.
    15. Przygotować wtórny roztwór przeciwciała myszy w stosunku 1:10 000, dodając przeciwciało do standardowego wykrywania Western blot (patrz Tabela Materiałów) i umieścić membranę na shakerze; pozostawić w temperaturze pokojowej na 2 godziny.
    16. Wyrzucić roztwór przeciwciała i zanurzyć w roztworze T-TBS 1x na shakerze w temperaturze pokojowej przez 7 minut.
    17. Wyrzuć roztwór T-TBS 1x i wymień. Powtórz 3 razy.
    18. Namocz membranę przez 5 minut w roztworze chemiluminescencyjnym i zobrazuj membranę na obrazowniku chemiluminescencyjnym.

3. Przywracanie wrażliwości inhibitora terapii celowanej przez kandydujący gen R knock-down

  1. Przygotowanie komórek
    1. Przygotować zawiesinę jednokomórkową przez trypsynizację. Wykonaj transfekcję w dniu, w którym komórki są powlekane.
      1. Przemyć komórki NCI-N87 PBS i inkubować w temperaturze 37 °C z 0,05% roztworem trypsyny/EDTA przez 5 - 10 minut. Dodać 2 objętości pożywki RPMI zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej w celu zneutralizowania trypsyny (np. 2 ml pożywki na każdy 1 ml trypsyny).
      2. Policz komórki za pomocą hemocytometru za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Wysiewaj 2,5 x 105 komórek (60% konfluencji) na kolbie T25 cm2 dla każdego stanu.
        UWAGA: Odpowiednia liczba komórek do wysiewu zależy od czasu podwojenia linii komórkowej i czasu trwania eksperymentu. Celem jest osiągnięcie knock-down genu docelowego przez cały czas trwania eksperymentu. Dziewięć kolb T25 cm2 jest idealnych do warunków transfekcji i testu klonogennego (3 kolby do kontroli, 3 kolby do negatywnych kontroli transfekcji, 3 kolby do transfekcji genu-celu).
  2. Odwrotna transfekcja
    1. Przygotować mieszaninę do transfekcji genu docelowego i kontroli ujemnej dla każdej kolby T25 cm2 w następujący sposób.
      1. Rozcieńczyć 12,5 μl każdego genu ukierunkowanego na oligonukleotydy siRNA lub oligonukleotydy siRNA kontroli negatywnej w minimalnym niezbędnym pożywce transfekcyjnej (stosunek 1:55; patrz tabela materiałów).
      2. Dodać kationowy odczynnik do transfekcji liposomów (stosunek 1:1 z oligonukleotydami siRNA ukierunkowanymi na geny; patrz tabela materiałów). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 min.
        UWAGA: Całkowita objętość mieszanki transfekcyjnej wynosi 700 μL.
      3. Dodać 700 μl mieszanki transfekcyjnej do każdej kolby T25 cm2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 1-3 dni.
    2. Zweryfikuj nokaut genu za pomocą RT-PCR i analizy Western blot. Dokładnie sprawdź wpływ domniemanego knock-down genu R na przywrócenie wrażliwości na celowy środek terapeutyczny poprzez eksperymenty z tworzeniem kolonii (powtórz krok 1.5 ).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 1 przedstawia schemat procedury eksperymentalnej. Trzy linie komórkowe raka żołądka wykazujące wysoką ekspresję HER2 i wrażliwość na trastuzumab (IC50 < szczytowe stężenie leku w osoczu, Rycina 2A, wykres lewy) hodowano w pożywce zawierającej celowany środek terapeutyczny. Jako dawkę początkową ustalono stężenie 10-krotnie niższe od szczytowego stężenia trastuzumabu w osoczu (10 µg/mL), a następnie stopniowo ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podczas gdy spersonalizowane i celowane terapie wywołują rosnący entuzjazm, te tak zwane "inteligentne" terapie napotykają tę samą poważną przeszkodę, co tradycyjne leki stosowane w chemioterapii, tj. szybkie i nieprzewidywalne nabycie oporności na leki. Aby poprawić wyniki terapii celowanej, problemy związane z lekoopornością muszą być rozwiązywane poprzez lepsze zrozumienie mechanizmów, które je powodują. W tym artykule przedstawiliśmy szeroko dostępną metodologię in vitro do badania mechanizmów nabyt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować dr Veronice Zanoni za redakcję manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik TrizolOdczynnik Invitrogen15596026TRIzol to odczynnik do izolowania wysokiej jakości całkowitego RNA lub jednoczesnego izolowania RNA, DNA i białka z różnych próbek biologicznych
ZESTAW DO SYNTEZY CDNA ISCRIPTBio-Rad1708891Zestaw do syntezy cDNA iScript to czuły i łatwy w użyciu zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA do analizy ekspresji genów przy użyciu qPCR w czasie rzeczywistym.
Test ekspresji genów TaqManLife Technologies4331182Applied Biosystems Testy ekspresji genów TaqMan składają się z pary nieznakowanych starterów PCR i sondy TaqMan z etykietą barwnika Applied Biosystems FAM lub VIC na końcu 5' i spoiwem z małym rowkiem (MGB) oraz niefluorescencyjnym wygaszaczem (NFQ) na końcu 3'.
Odczynnik do ekstrakcji białek ssaków M-PERThermo Scientific78501Thermo Scientific Odczynnik do ekstrakcji białek ssaków M-PER został zaprojektowany, aby zapewnić wysoce wydajną ekstrakcję całkowitego rozpuszczalnego białka z hodowanych komórek ssaków.
proteazy i fosfatazy Halt (100X)Thermo Scientific78440Thermo Scientific Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy Halt (100X) zapewnia wygodę pojedynczego roztworu z pełną ochroną próbki białka dla lizatów komórkowych i tkankowych.
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo Scientific23225Zestaw do oznaczania białek Thermo Scientific Pierce BCA to dwuskładnikowy, wysoce precyzyjny, kompatybilny z detergentami odczynnik do oznaczania całkowitego stężenia białka (A562nm) w porównaniu ze wzorcem białka.
4x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610747Użyj 4x Laemmli Sample Buffer do przygotowania próbek do SDS PAGE. W celu rozdrobnienia próbek, przed zmieszaniem z próbką dodać do buforu środek redukujący, taki jak 2-merkaptoetanol.
4– 20% Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowane żele białkoweBio-Rad456-1094Żele TGX (Tris-Glycine eXtended) o długiej żywotności mają nowatorską formułę i mogą być stosowane zarówno do standardowych separacji białek denaturujących, jak i do natywnej elektroforezy.
Standardy Blottingu Precision Plus Protein WesternCBio-Rad1610376Precision Plus są dostępne w formatach Dual Color, All Blue, Kalejdoskop i Dual Xtra. Wszystkie cztery mają takie same wzorce migracji żelu, z 3 pasmami odniesienia o wysokiej intensywności (25, 50 i 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDSBio-Rad161073210x Tris/glycine/SDS to wstępnie zmieszany bufor do separacji próbek białek metodą SDS-PAGE.
Zestawy transferowe Trans-Blot Turbo Mini PVDFBio-Rad1704156Zestawy transferowe Trans-Blot Turbo Mini PVDF do szybkiego i wydajnego transferu białek z mini żeli za pomocą systemu Trans-Blot Turbo Transfer. Każdy uszczelniony próżniowo, gotowy do użycia pakiet transferowy zawiera dwa stosy zbiorników jonów nasyconych buforem i wstępnie zwilżoną membranę PVDF.
Precyzyjny koniugat białkowy StrepTactin-HRPBio-Rad1610381koniugatu StrepTactin-Peroksydaza chrzanowa (HRP) do chemiluminescencyjnej lub kolorymetrycznej detekcji wzorców białek niebarwionych Precision Plus Protein lub wzorców białkowych Precision Plus Protein WesternC na zachodnich plamach.
Roztwór Immun-Star WesternCBio-Rad5572Roztwór Immun-Star WesternC, metoda wykrywania białek, wykrywa średnie ilości białka w femtogramie.
Uniwersalna kontrola negatywnaInvitrogen12935300Kontrola negatywna siRNA nie ma znaczącego podobieństwa sekwencji do sekwencji genów myszy, szczurów lub ludzi. Kontrola została również przetestowana w badaniach przesiewowych opartych na komórkach i udowodniono, że nie ma znaczącego wpływu na proliferację komórek, żywotność lub morfologię.
opti-MEM Glutamax MediumThermo Fisher Scientific51985026Opti-MEM Medium to ulepszone Minimal Essential Medium (MEM), które pozwala na zmniejszenie suplementacji płodowej surowicy bydlęcej o co najmniej 50% bez zmiany tempa wzrostu lub morfologii.
Wybór tłumika Wstępnie zaprojektowany i Zwalidowany siRNAAmbion4390824interferencja RNA (RNAi) to najlepszy sposób na skuteczne obniżenie ekspresji genów w celu zbadania funkcji białek w szerokim zakresie typów komórek.
Odczynnik do transfekcji lipofekcjony RNAiMAXInvitrogen13778075Odczynnik do transfekcji Lipofectamine RNAiMAX oferuje zaawansowane, wydajne rozwiązanie do dostarczania siRNA. Żaden inny odczynnik do transfekcji specyficznej dla siRNA nie zapewnia tak łatwego i wydajnego dostarczania siRNA w szerokiej gamie linii komórkowych, w tym w typowych typach komórek, komórkach macierzystych i komórkach pierwotnych, a także w tradycyjnie trudnych do transfekcji typach komórek.
Mysi anty-IQGAP1Invitrigen33-8900stężenie robocze: 1:400 w 5% roztworze mleka
koza anty-mysie IgG-HRP: sc-2005Santa Cruzsc-2005stężenie robocze: 1:10000 w 5% roztworze mleka
PMSFSigma AldrichP 7626jest to inhibitor proteaz serynowych i acetylocholinoesterazy
Termocykler do badań RT-PCRMJ Research MJResearch Termocykler PTC-200umożliwia jednorodność temperatury i prędkość narastania do 3° C/sek. Protokół może być również wykonywany z innymi termocyklerami
Przyrząd Real Time RT-PCR System RT-PCRApplied Biosystems7500 RT-PCRJest to pięciokolorowa platforma, która wykorzystuje odczynniki reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) na bazie fluorescencji w celu zapewnienia względnej kwantyfikacji przy użyciu porównawczego typu testu CT. Protokół może być również wykonywany z innymi termocyklerami
Spektrofotometry mikroobjętościoweThermo ScientificNanodropZapewnia dokładny i szybki pomiar kwasowych nukleidów przy użyciu niewielkiej objętości próbki
System BlottBio-RadTrans-Blot TurboWykonuje transfer sejmowo-suchy w ciągu kilku minut
System akwizycji obrazu i dokumentacja żeluObraz Bio-RadChemidoc systemJest łatwy w użyciu do detekcji chemiluminescencyjnej
Koktajl inhibitorów Wzorce do barwienia białek System

Bibliografia

  1. Gerber, D. E. Targeted therapies: a new generation of cancer treatments. Am Fam Physician. 77 (3), 311-319 (2008).
  2. Zhang, J., Yang, P. L., Gray, N. S. Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nat Rev Cancer. 9 (1), 28-39 (2009).
  3. Nelson, A. L., Dhimolea, E., Reichert, J. M. Development trends for human monoclonal antibody therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 767-774 (2010).
  4. Chabner, B. A., Roberts, T. G. Timeline: Chemotherapy and the war on cancer. Nat Rev Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
  5. Gilbert, L. A., Hemann, M. T. Chemotherapeutic resistance: surviving stressful situations. Cancer Res. 71 (15), 5062-5066 (2011).
  6. Izar, B., Rotow, J., Gainor, J., Clark, J., Chabner, B. Pharmacokinetics, clinical indications, and resistance mechanisms in molecular targeted therapies in cancer. Pharmacol Rev. 65, 1351-1395 (2013).
  7. Ellis, L. M., Hicklin, D. J. Resistance to Targeted Therapies: Refining Anticancer Therapy in the Era of Molecular Oncology. Clin Cancer Res. 15 (24), 7471-7478 (2009).
  8. Asić, K. Dominant mechanisms of primary resistance differ from dominant mechanisms of secondary resistance to targeted therapies. Crit Rev Oncol Hematol. 97, 178-196 (2016).
  9. Arienti, C., et al. Preclinical evidence of multiple mechanisms underlying trastuzumab resistance in gastric cancer. Oncotarget. 7 (14), 18424-18439 (2016).
  10. Tanner, M., et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol. 16 (2), 273-278 (2005).
  11. Bang, Y. J., et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet. 376 (9742), 687-697 (2010).
  12. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01130337. A Study of Capecitabine [Xeloda] in Combination With Trastuzumab [Herceptin] and Oxaliplatine in Patients With Resectable Gastric Cancer. , Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01130337 (2017).
  13. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01748773. A Study of the Combination of Oxaliplatin, Capecitabine and Herceptin (Trastuzumab) and Chemoradiotherapy in The Adjuvant Setting in Operated Patients With HER2+ Gastric or Gastro-Esophageal Junction Cancer (TOXAG Study). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/show/NCT01748773 (2017).
  14. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01472029. Explorative Phase II Study of Perioperative Treatment in Patients With Adenocarcinoma of the Gastroesophageal Junction or Stomach (HerFLOT). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01472029 (2017).
  15. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01196390. Radiation Therapy, Paclitaxel, and Carboplatin With or Without Trastuzumab in Treating Patients With Esophageal Cancer. , Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01196390 (2017).
  16. Shimoyama, S. Unraveling trastuzumab and lapatinib inefficiency in gastric cancer: Future steps (Review). Mol Clin Oncol. 2 (2), 175-181 (2014).
  17. Kelly, C. M., Janjigian, Y. Y. The genomics and therapeutics of HER2-positive gastric cancer-from trastuzumab and beyond. J Gastrointest Oncol. 7 (5), 750-762 (2016).
  18. Wong, S. S., et al. Genomic landscape and genetic heterogeneity in gastric adenocarcinoma revealed by whole-genome sequencing. Nat Commun. 5, 5477(2014).
  19. Oshima, Y., et al. Lapatinib sensitivities of two novel trastuzumab-resistant HER2 gene-amplified gastric cancer cell lines. Gastric Cancer. 17 (3), 450-462 (2014).
  20. Pignatta, S., et al. Prolonged exposure to (R)-bicalutamide generates a LNCaP subclone with alteration of mitochondrial genome. Mol Cell Endocrinol. 382 (1), 314-324 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Lekoopornooporno na trastuzumabHER2 dodatnistosunek IC50wyciszanie IQGAP1test kolonogennyhodowla kom rkowa
Poszukiwanie ścieżek napędzających nabytą oporność na terapię celowaną: wytwarzanie subklonów opornych na leki i przywracanie wrażliwości przez knock-down genów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.