Poszukiwanie ścieżek napędzających nabytą oporność na terapię celowaną: wytwarzanie subklonów opornych na leki i przywracanie wrażliwości przez knock-down genów

Podsumowanie

To jest efektywny czasowo i kosztowo protokół in vitro, badający mechanizmy nabytej oporności na ukierunkowane środki terapeutyczne, co jest wysoce niezaspokojoną potrzebą medyczną w leczeniu raka.

Streszczenie

Ostatnie dwie dekady przyniosły przejście od leków cytotoksycznych do terapii celowanej w onkologii medycznej. Chociaż celowane środki terapeutyczne wykazały bardziej imponującą skuteczność kliniczną i zminimalizowane działania niepożądane niż tradycyjne metody leczenia, oporność na leki stała się głównym ograniczeniem ich korzyści. W praktyce klinicznej opracowano kilka przedklinicznych modeli nabytej oporności na leki celowane in vitro/in vivo, głównie przy użyciu dwóch strategii: i) manipulacji genetycznej w celu modelowania genotypów nabytej oporności oraz ii) selekcji modeli oporności in vitro/in vivo. W niniejszej pracy proponujemy ujednolicenie ram do badania mechanizmów leżących u podstaw nabywanej oporności na celowane środki terapeutyczne, począwszy od generacji lekoopornych subklonów komórkowych, a skończywszy na opisie procedur wyciszania stosowanych w celu przywrócenia wrażliwości na inhibitor. To proste, efektywne czasowo i kosztowo podejście ma szerokie zastosowanie i może być łatwo rozszerzone w celu zbadania mechanizmów oporności na inne celowane leki terapeutyczne w różnych histotypach guza.

Wprowadzenie

Podążając za kluczowymi odkryciami w biologii molekularnej i komórkowej, opracowano szereg nowych syntetyzowanych cząsteczek przeciwnowotworowych, które selektywnie celują w onkogenne szlaki sygnałowe w szerokim zakresie typów nowotworów. W szczególności wiadomo, że dwie kategorie celowanych środków terapeutycznych o unikalnych właściwościach w onkologii, a mianowicie syntetyczne związki chemiczne i rekombinowane przeciwciała monoklonalne, osiągnęły sukcesy kliniczne i radykalnie zmieniły opiekę onkologiczną w ostatnich dziesięcioleciach^1,2,3.

Niemniej jednak, pomimo imponującej początkowej odpowiedzi na leczenie, większość pacjentów z rakiem rozwinęła lekooporność na wszystkie ukierunkowane środki terapeutyczne, zarówno przeciwciała monoklonalne, jak i inhibitory kinaz. W związku z tym oporność na leki, główna przeszkoda dla klasycznych leków przeciwnowotworowych⁴, jest nadal wielkim wyzwaniem dla pojawiających się terapii celowanych^5,6.

Oporność na terapię celowaną może być wrodzona (tj. pierwotna) lub nabyta (tj. wtórna). Oporność wewnętrzna opisuje brak odpowiedzi na leczenie de novo, podczas gdy oporność wtórna występuje po okresie odpowiedzi na leczenie farmakologiczne⁷. Ta ostatnia jest spowodowana wybuchami małych kohort komórek nowotworowych w obrębie większości pierwotnego guza lub zagnieżdżonych w dystalnych kryptycznych niszach anatomicznych, wykazujących do 90% oporności na jeden lub więcej ukierunkowanych środków terapeutycznych. Mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju oporności na terapię celowaną wynikają głównie z mutacji genów docelowych i nadmiarowej aktywacji innych szlaków sygnałowych sprzyjających przetrwaniu, których zrozumienie jest nadal dalekie od ukończenia⁸.

W tej pracy zaproponowaliśmy efektywne czasowo i kosztowo podejście do badania in vitro mechanizmów nabytej oporności na ukierunkowane środki terapeutyczne, zaczynając od generowania lekoopornych subklonów komórkowych do opisu procedur wyciszania stosowanych do przywracania wrażliwości na inhibitor, kluczowego narzędzia używanego do testowania i walidacji hipotez roboczych. W szczególności nasze podejście zostało wykorzystane do zbadania, w raku żołądka, mechanizmów oporności na trastuzumab (np. Herceptin), humanizowane przeciwciało monoklonalne skierowane do domeny zewnątrzkomórkowej białka HER2⁹. Trastuzumab + chemioterapia jest powszechnie akceptowana jako standardowe leczenie pierwszego rzutu HER2-dodatniego raka piersi z przerzutami. Dzięki niedawnym badaniom przedklinicznym wykazującym, że terapie anty-HER2 mają znaczącą aktywność zarówno in vitro, jak i in vivo HER2-dodatnich modeli raka żołądka^10,11, leki molekularne ukierunkowane na HER2 zostały szeroko przebadane w badaniach klinicznych, z których część jest nadal w toku, na pacjentach z rakiem żołądka i przełyku^12,13,14,15.

Te badania podkreśliły rosnącą liczbę pacjentów doświadczających oporności na trastuzumab¹⁶, podobnie jak w przypadku innych celowanych inhibitorów terapeutycznych. W szczególności odsetek odpowiedzi na trastuzumab wynosił 47%, a mediana całkowitego przeżycia u pacjentów przyjmujących trastuzumab + chemioterapia była tylko o 2,7 miesiąca dłuższa niż u pacjentów przyjmujących samą chemioterapię¹⁷. Sugeruje to, że podczas gdy pierwotna oporność na trastuzumab jest powszechna, wtórna oporność na trastuzumab jest nieunikniona. Z tego powodu istnieje pilna potrzeba wyjaśnienia mechanizmów powodujących oporność na terapię ukierunkowaną na HER2 w raku żołądka, co jest jeszcze bardziej problematyczne, biorąc pod uwagę wewnątrznowotworową heterogeniczność genetyczną tej nowotworu¹⁸.

Ponadto, mechanizmy oporności na trastuzumab w raku żołądka okazały się trudne do wyjaśnienia, częściowo z powodu trudności w uzyskaniu wiarygodnych modeli przedklinicznych reprezentatywnych dla tego schorzenia. Oshima i wsp. opisali metodę selekcji in vivo linii komórkowych raka żołądka opornych na trastuzumab, polegającą na wielokrotnym posiewie niewielkiego resztkowego przerzutu do otrzewnej po leczeniu trastuzumabem¹⁹. Jednak potrzeba wybiegu, specjalistycznej wiedzy w zakresie obchodzenia się ze zwierzętami oraz zatwierdzenia przez Komisję Etyki Zwierząt przyczyniła się do tego, że metoda ta stała się czasochłonna i kosztowna. Podejście, które opisujemy w tej pracy, jest proste i ma szerokie zastosowanie, i może być łatwo rozszerzone w celu zbadania mechanizmów oporności na inne leki terapeutyczne w różnych histotypach nowotworów²⁰.

Protokół

UWAGA: Ten protokół został specjalnie dostosowany do analizy mechanizmów leżących u podstaw nabytej oporności na trastuzumab HER-dodatnich linii komórkowych raka żołądka. Wszystkie potrzebne przyrządy laboratoryjne są podane w Tabeli Materiałów.

1. Generacja subklonów odpornych na terapię celowaną

UWAGA: Jest to najbardziej krytyczny i trudny do standaryzacji krok w protokole ze względu na fakt, że różne linie komórkowe mogą wykazywać różną wrażliwość na celowany inhibitor terapeutyczny, niezależnie od ich histotypu guza lub stężenia zastosowanego leku.

1. Hodowla linii komórkowej NCI-N87 w pożywce RPMI uzupełniona płodową surowicą cielęcą (10%) i glutaminą (2 mM, 1%) jako monowarstwą w temperaturze 37 °C i wysiewem na 25 cm² kolby hodowlane.
2. Dodać do pożywki w każdej kolbie 10 μg/ml trastuzumabu jako dawkę początkową. Wystawić komórki na działanie dawki początkowej do momentu wznowienia wzrostu.
   UWAGA: Dawka początkowa inhibitora terapii celowanej powinna być 10-krotnie mniejsza niż jego maksymalne stężenie w osoczu. Maksymalne stężenie leku w osoczu jest najwyższym poziomem stężenia leku wykrywanym we krwi pacjenta, zwykle po wielokrotnym podaniu dawki standardowego leczenia. Wartość tę można uzyskać z badań farmakokinetycznych.
3. Monitoruj wzrost komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego; gdy wzrost komórek zostanie wznowiony (zwykle po okresie od dwóch do trzech tygodni), należy wystawić komórki na działanie 10-krotnie wyższej dawki trastuzumabu.
4. Poddać komórki stopniowo zwiększającej się dawce trastuzumabu (od 100 μg/ml do 400 μg/ml) do momentu, gdy komórki będą rosły (po około 2 tygodniach) pomimo obecności wysokiego stężenia leku (co najmniej 2,5 - 4-krotnie wyższego niż pik w osoczu).
5. Wykonać test klonogenny w celu oceny poziomu oporności na terapię celowaną przy każdej zmianie stężenia inhibitora terapii docelowej w pożywce hodowlanej i zdefiniować wskaźnik względnej oporności IC₅₀ (RR IC₅₀) w następujący sposób.
   1. Wysiewaj 500 komórek na 24 wielodołkowych płytkach hodowlanych.
      UWAGA: Dla każdego zestawu warunków należy przygotować 5 studzienek.
   2. Wystawić komórki na działanie zwiększających się stężeń inhibitora terapii celowanej (trastuzumabu) od 100 μg/ml do 400 μg/ml.
   3. Inkubować komórki w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C przez 15 dni.
   4. Po inkubacji utrwalić i wybarwić próbki w następujący sposób.
      1. Usuń pożywkę i spłucz komórki 10 ml 1x PBS. Usunąć 1x PBS i dodać 2 - 3 ml roztworu utrwalającego (kwas octowy: metanol, 1:7, (obj./obj.)). Usunąć roztwór utrwalający i dodać 0,5% roztworu fioletu krystalicznego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny
      2. Ostrożnie usunąć roztwór fioletu krystalicznego, zasysając go pipetą, a następnie zanurzyć płytki w wodzie z kranu, aby spłukać wszelkie pozostałości roztworu fioletu krystalicznego. Suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej do 2 dni.
   5. Policz kolonie liczące ponad 50 komórek za pomocą mikroskopu odwróconego (4-krotne powiększenie).
      UWAGA: Do tego potrzebnych jest dwóch niezależnych obserwatorów.
   6. Obliczyć RR IC₅₀ jako stosunek wartości IC₅₀ komórek subklonów opornych na terapię celowaną do wartości komórek pierwotnych/nieleczonych.

2. Protokół walidacji dla potencjalnego genu oporności na terapię celowaną (gen R)

UWAGA: Po scharakteryzowaniu ekspresji genów, sygnatury związane z nabytą opornością na terapię celowaną i dowolnym genem kandydującym jako czynnik wywołujący oporność będą badane poprzez: a) RT-PCR i b) analizę Western blot.

1. RT-PCR w czasie rzeczywistym
   1. Ekstrahować całkowite RNA z linii komórkowych za pomocą mieszaniny kwasu tiocyjanianu guanidyny, fenolu i chloroformu (patrz tabela materiałów).
   2. Przeprowadzić reakcje odwrotnej transkrypcji (RT) przy użyciu losowych starterów heksamerów i ustawić termocykler w następujący sposób: zalewanie w temperaturze 25 °C przez 5 minut, RT w temperaturze 46 °C przez 20 minut i inaktywacja RT w temperaturze 95 °C przez 1 minutę.
   3. Użyj 400 ng całkowitego RNA do reakcji 20 μl. Przygotować mieszaninę reakcyjną dla próbki w następujący sposób: 7 μl H₂O wolne od RNaz, 2 μl cDNA (10 ng / μL), 1 μL 20x znakowana fluorescencyjnie sonda specyficzna dla celu i 10 μL 2x Mieszanina zawierająca bufor, dNTP i polimerazę DNA (patrz tabela materiałów).
   4. Dodać 20 μl mieszaniny reakcyjnej do każdej płytki dołka i uruchomić następujący program: etap utrzymywania w temperaturze 50 °C przez 2 minuty, w temperaturze 95 °C przez 10 minut (1 cykl); następnie 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s i w temperaturze 60 °C przez 1 minutę.
2. Plama zachodnia
   1. Odzyskaj zawiesiny komórek, dodając 2 ml 0,05% roztworu trypsyny/EDTA i pozostawiając 2-3 minuty na działanie trypsyny.
   2. Dodać 2 objętości pożywki zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej w celu zneutralizowania trypsyny (np. 2 ml pożywki na każdy 1 ml trypsyny) i odwirować przy 1,200 x g przez 5 min. Odrzucić supernatant i przemyć komórki zimnym 1x PBS.
   3. Wirować przy 1 200 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy z buforem do lizy i inkubować na kołysku w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
      1. Ilość buforu do lizy zależy od liczby komórek (np. 100 μl na 1 x^{10 6} komórek); należy pamiętać o każdorazowym przygotowaniu nowego buforu do lizy. Na 1 ml preparatu buforowego do lizy (pozostawić na lodzie): użyć 975 μL M-PER Bufor lizatu ssaków, 15 μl inhibitorów proteazy i fosfatazy oraz 10 μl 100 μM inhibitorów PMSF.
   4. Odzyskać białko sklarowane nad osadem przez odwirowanie lizatu komórkowego w temperaturze 13 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut.
   5. Określ stężenia białek za pomocą testu białka BCA.
   6. Dodać 4x LaemmLi Sample Buffer do próbek białka (co najmniej 20 - 30 μg białka) i podgrzewać w temperaturze 100 °C przez 3 min.
   7. Użyj prefabrykowanych żeli 4 - 20% i załaduj 20 - 30 μg roztworu białka LaemmLi i 5 - 10 μl wzorca białkowego na próbkę.
   8. Napełnij pierścień Western blot buforem TRIS/GLICYNE /SDS 1x i uruchom żel pod napięciem 110 V przez 30 - 60 min (gdy czas się zatrzyma, sprawdź, czy barwnik dotarł do końca żelu, w przeciwnym razie uruchom przez kilka dodatkowych minut)
   9. Elektroblot do przenoszenia białka do membrany PVDF (patrz Tabela materiałów) przy użyciu systemu półsuchego.
   10. Zablokuj membranę, mocząc w odpowiednim roztworze białkowym (mleko/BSA 5%) na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   11. Przygotować roztwór w stosunku 1:400 z przeciwciałem pierwszorzędowym anty-IQGAP1 w 5% roztworze mleka (patrz tabela materiałów).
   12. Umieść membranę w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego na wytrząsarce w chłodnym pomieszczeniu na noc.
   13. Następnego dnia wyrzuć roztwór przeciwciała i zanurz w T-TBS 1x roztwór (1x T-TBS: 1x Tris Saline Buffer dodany przez Tween20 0,1%) na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 7 min.
   14. Wyrzuć roztwór T-TBS 1x i wymień. Powtórz 3 razy.
   15. Przygotować wtórny roztwór przeciwciała myszy w stosunku 1:10 000, dodając przeciwciało do standardowego wykrywania Western blot (patrz Tabela Materiałów) i umieścić membranę na shakerze; pozostawić w temperaturze pokojowej na 2 godziny.
   16. Wyrzucić roztwór przeciwciała i zanurzyć w roztworze T-TBS 1x na shakerze w temperaturze pokojowej przez 7 minut.
   17. Wyrzuć roztwór T-TBS 1x i wymień. Powtórz 3 razy.
   18. Namocz membranę przez 5 minut w roztworze chemiluminescencyjnym i zobrazuj membranę na obrazowniku chemiluminescencyjnym.

3. Przywracanie wrażliwości inhibitora terapii celowanej przez kandydujący gen R knock-down

1. Przygotowanie komórek
   1. Przygotować zawiesinę jednokomórkową przez trypsynizację. Wykonaj transfekcję w dniu, w którym komórki są powlekane.
      1. Przemyć komórki NCI-N87 PBS i inkubować w temperaturze 37 °C z 0,05% roztworem trypsyny/EDTA przez 5 - 10 minut. Dodać 2 objętości pożywki RPMI zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej w celu zneutralizowania trypsyny (np. 2 ml pożywki na każdy 1 ml trypsyny).
      2. Policz komórki za pomocą hemocytometru za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Wysiewaj 2,5 x 10⁵ komórek (60% konfluencji) na kolbie T25 cm² dla każdego stanu.
         UWAGA: Odpowiednia liczba komórek do wysiewu zależy od czasu podwojenia linii komórkowej i czasu trwania eksperymentu. Celem jest osiągnięcie knock-down genu docelowego przez cały czas trwania eksperymentu. Dziewięć kolb T25 cm² jest idealnych do warunków transfekcji i testu klonogennego (3 kolby do kontroli, 3 kolby do negatywnych kontroli transfekcji, 3 kolby do transfekcji genu-celu).
2. Odwrotna transfekcja
   1. Przygotować mieszaninę do transfekcji genu docelowego i kontroli ujemnej dla każdej kolby T25 cm² w następujący sposób.
      1. Rozcieńczyć 12,5 μl każdego genu ukierunkowanego na oligonukleotydy siRNA lub oligonukleotydy siRNA kontroli negatywnej w minimalnym niezbędnym pożywce transfekcyjnej (stosunek 1:55; patrz tabela materiałów).
      2. Dodać kationowy odczynnik do transfekcji liposomów (stosunek 1:1 z oligonukleotydami siRNA ukierunkowanymi na geny; patrz tabela materiałów). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 min.
         UWAGA: Całkowita objętość mieszanki transfekcyjnej wynosi 700 μL.
      3. Dodać 700 μl mieszanki transfekcyjnej do każdej kolby T25 cm². Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 1-3 dni.
   2. Zweryfikuj nokaut genu za pomocą RT-PCR i analizy Western blot. Dokładnie sprawdź wpływ domniemanego knock-down genu R na przywrócenie wrażliwości na celowy środek terapeutyczny poprzez eksperymenty z tworzeniem kolonii (powtórz krok 1.5 ).

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia ramy procedury eksperymentalnej. Trzy linie komórkowe raka żołądka wykazujące wysoki poziom HER2 i wrażliwe na trastuzumab (IC₅₀ < szczytowy poziom leku w osoczu, Rysunek 2A, lewy wykres) hodowano w pożywce hodowlanej zawierającej celowany środek terapeutyczny. Jako dawkę początkową ustalono dawkę 10-krotnie mniejszą niż szczytowe stężenie trastuzumabu w osoczu (10 μg/ml), którą stopniowo zwiększano do 4...

Dyskusja

Podczas gdy spersonalizowane i celowane terapie wywołują rosnący entuzjazm, te tak zwane "inteligentne" terapie napotykają tę samą poważną przeszkodę, co tradycyjne leki stosowane w chemioterapii, tj. szybkie i nieprzewidywalne nabycie oporności na leki. Aby poprawić wyniki terapii celowanej, problemy związane z lekoopornością muszą być rozwiązywane poprzez lepsze zrozumienie mechanizmów, które je powodują. W tym artykule przedstawiliśmy szeroko dostępną metodologię in vitro do badania mechanizmów nabyt...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik Trizol	Odczynnik Invitrogen	15596026	TRIzol to odczynnik do izolowania wysokiej jakości całkowitego RNA lub jednoczesnego izolowania RNA, DNA i białka z różnych próbek biologicznych
ZESTAW DO SYNTEZY CDNA ISCRIPT	Bio-Rad	1708891	Zestaw do syntezy cDNA iScript to czuły i łatwy w użyciu zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA do analizy ekspresji genów przy użyciu qPCR w czasie rzeczywistym.
Test ekspresji genów TaqMan	Life Technologies	4331182	Applied Biosystems Testy ekspresji genów TaqMan składają się z pary nieznakowanych starterów PCR i sondy TaqMan z etykietą barwnika Applied Biosystems FAM lub VIC na końcu 5' i spoiwem z małym rowkiem (MGB) oraz niefluorescencyjnym wygaszaczem (NFQ) na końcu 3'.
Odczynnik do ekstrakcji białek ssaków M-PER	Thermo Scientific	78501	Thermo Scientific Odczynnik do ekstrakcji białek ssaków M-PER został zaprojektowany, aby zapewnić wysoce wydajną ekstrakcję całkowitego rozpuszczalnego białka z hodowanych komórek ssaków.
proteazy i fosfatazy Halt (100X)	Thermo Scientific	78440	Thermo Scientific Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy Halt (100X) zapewnia wygodę pojedynczego roztworu z pełną ochroną próbki białka dla lizatów komórkowych i tkankowych.
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA	Thermo Scientific	23225	Zestaw do oznaczania białek Thermo Scientific Pierce BCA to dwuskładnikowy, wysoce precyzyjny, kompatybilny z detergentami odczynnik do oznaczania całkowitego stężenia białka (A562nm) w porównaniu ze wzorcem białka.
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	Użyj 4x Laemmli Sample Buffer do przygotowania próbek do SDS PAGE. W celu rozdrobnienia próbek, przed zmieszaniem z próbką dodać do buforu środek redukujący, taki jak 2-merkaptoetanol.
4– 20% Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowane żele białkowe	Bio-Rad	456-1094	Żele TGX (Tris-Glycine eXtended) o długiej żywotności mają nowatorską formułę i mogą być stosowane zarówno do standardowych separacji białek denaturujących, jak i do natywnej elektroforezy.
Standardy Blottingu Precision Plus Protein WesternC	Bio-Rad	1610376	Precision Plus są dostępne w formatach Dual Color, All Blue, Kalejdoskop i Dual Xtra. Wszystkie cztery mają takie same wzorce migracji żelu, z 3 pasmami odniesienia o wysokiej intensywności (25, 50 i 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glycine/SDS to wstępnie zmieszany bufor do separacji próbek białek metodą SDS-PAGE.
Zestawy transferowe Trans-Blot Turbo Mini PVDF	Bio-Rad	1704156	Zestawy transferowe Trans-Blot Turbo Mini PVDF do szybkiego i wydajnego transferu białek z mini żeli za pomocą systemu Trans-Blot Turbo Transfer. Każdy uszczelniony próżniowo, gotowy do użycia pakiet transferowy zawiera dwa stosy zbiorników jonów nasyconych buforem i wstępnie zwilżoną membranę PVDF.
Precyzyjny koniugat białkowy StrepTactin-HRP	Bio-Rad	1610381	koniugatu StrepTactin-Peroksydaza chrzanowa (HRP) do chemiluminescencyjnej lub kolorymetrycznej detekcji wzorców białek niebarwionych Precision Plus Protein lub wzorców białkowych Precision Plus Protein WesternC na zachodnich plamach.
Roztwór Immun-Star WesternC	Bio-Rad	5572	Roztwór Immun-Star WesternC, metoda wykrywania białek, wykrywa średnie ilości białka w femtogramie.
Uniwersalna kontrola negatywna	Invitrogen	12935300	Kontrola negatywna siRNA nie ma znaczącego podobieństwa sekwencji do sekwencji genów myszy, szczurów lub ludzi. Kontrola została również przetestowana w badaniach przesiewowych opartych na komórkach i udowodniono, że nie ma znaczącego wpływu na proliferację komórek, żywotność lub morfologię.
opti-MEM Glutamax Medium	Thermo Fisher Scientific	51985026	Opti-MEM Medium to ulepszone Minimal Essential Medium (MEM), które pozwala na zmniejszenie suplementacji płodowej surowicy bydlęcej o co najmniej 50% bez zmiany tempa wzrostu lub morfologii.
Wybór tłumika Wstępnie zaprojektowany i Zwalidowany siRNA	Ambion	4390824	interferencja RNA (RNAi) to najlepszy sposób na skuteczne obniżenie ekspresji genów w celu zbadania funkcji białek w szerokim zakresie typów komórek.
Odczynnik do transfekcji lipofekcjony RNAiMAX	Invitrogen	13778075	Odczynnik do transfekcji Lipofectamine RNAiMAX oferuje zaawansowane, wydajne rozwiązanie do dostarczania siRNA. Żaden inny odczynnik do transfekcji specyficznej dla siRNA nie zapewnia tak łatwego i wydajnego dostarczania siRNA w szerokiej gamie linii komórkowych, w tym w typowych typach komórek, komórkach macierzystych i komórkach pierwotnych, a także w tradycyjnie trudnych do transfekcji typach komórek.
Mysi anty-IQGAP1	Invitrigen	33-8900	stężenie robocze: 1:400 w 5% roztworze mleka
koza anty-mysie IgG-HRP: sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	stężenie robocze: 1:10000 w 5% roztworze mleka
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	jest to inhibitor proteaz serynowych i acetylocholinoesterazy
Termocykler do badań RT-PCR	MJ Research MJ	Research Termocykler PTC-200	umożliwia jednorodność temperatury i prędkość narastania do 3° C/sek. Protokół może być również wykonywany z innymi termocyklerami
Przyrząd Real Time RT-PCR System RT-PCR	Applied Biosystems	7500 RT-PCR	Jest to pięciokolorowa platforma, która wykorzystuje odczynniki reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) na bazie fluorescencji w celu zapewnienia względnej kwantyfikacji przy użyciu porównawczego typu testu CT. Protokół może być również wykonywany z innymi termocyklerami
Spektrofotometry mikroobjętościowe	Thermo Scientific	Nanodrop	Zapewnia dokładny i szybki pomiar kwasowych nukleidów przy użyciu niewielkiej objętości próbki
System Blott	Bio-Rad	Trans-Blot Turbo	Wykonuje transfer sejmowo-suchy w ciągu kilku minut
System akwizycji obrazu i dokumentacja żelu	Obraz Bio-Rad	Chemidoc system	Jest łatwy w użyciu do detekcji chemiluminescencyjnej