Method Article

Wizualna detekcja wielu kwasów nukleinowych w układzie kapilarnym

DOI:

10.3791/56597

⸱

November 15th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Systems Biomedicine (Ministry of Education), Shanghai Center for Systems Biomedicine, Shanghai Jiao Tong University, 2State Key Laboratory of Oncogenes and Related Genes, 3School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, 4Collaborative Innovation Center for Biosafety of GMOs, National Center for the Molecular Characterization of Genetically Modified Organisms, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, 5Key Laboratory of Crop Marker-Assisted Breeding of Huaian Municipality, Jiangsu Collaborative Innovation Center of Regional Modern Agriculture and Environmental Protection, 6Department of Biomedical Engineering, Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, School of Medicine, Tsinghua University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje produkcję małej, gotowej do użycia kasety, która może być zastosowana do wizualnego wykrywania wielu kwasów nukleinowych w jednym, łatwym w obsłudze teście. W tym podejściu wykorzystano matrycę kapilarną do multipleksu i wysoce skutecznego wykrywania celów GMO.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metodologie wykrywania wielu kwasów nukleinowych w jednym, łatwym w obsłudze teście są pilnie potrzebne w diagnostyce chorób, monitorowaniu mikroorganizmów, wykrywaniu organizmów modyfikowanych genetycznie (GMO) i analizie kryminalistycznej. Wcześniej opisaliśmy platformę o nazwie CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). W tym miejscu opisujemy ulepszone procesy produkcji i wydajności dla tej platformy. W tym przypadku stosujemy małą, gotową do użycia kasetę zmontowaną za pomocą macierzy kapilarnej do multipleksowej wizualnej detekcji kwasów nukleinowych. Układ kapilarny jest wstępnie obrabiany do hydrofobowego i hydrofilowego wzoru przed utrwaleniem w kapilarach zestawów starterów do amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP). Po zamontowaniu adaptera ładującego, mieszanina reakcyjna LAMP jest ładowana i izolowana do każdej kapilary, dzięki sile kapilarnej, przez pojedynczy etap pipetowania. Reakcje LAMP zachodzą równolegle w naczyniach włosowatych. Wyniki są wizualnie odczytywane przez oświetlenie ręczną latarką UV. Za pomocą tej platformy demonstrujemy monitorowanie 8 często pojawiających się pierwiastków i genów w próbkach GMO z wysoką swoistością i czułością. Podsumowując, opisana w niniejszym dokumencie platforma ma na celu ułatwienie wykrywania wielu kwasów nukleinowych. Wierzymy, że znajdzie szerokie zastosowanie w dziedzinach, w których wymagana jest wysokoprzepustowa analiza kwasów nukleinowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedrogie, szybkie i łatwe w użyciu systemy do jednoczesnego wykrywania wielu kwasów nukleinowych są pilnie potrzebne w szerokim zakresie dziedzin, takich jak diagnostyka kliniczna1,2,3, GMO detection4,5,6, monitorowanie mikrobiologiczne7,8,9, forensic analysis10,11, a zwłaszcza testy przyłóżkowe (POCTs), gdzie zasoby są zwykle ograniczone12,13,14.

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), w tym jej metody pochodne real-time PCR i multiplex PCR, jest najczęściej stosowaną techniką wykrywania w tych dziedzinach. Jednak metody te zazwyczaj wykrywają tylko jeden cel w jednym teście15 i wymagają elektryczności oraz zaawansowanego profesjonalnego sprzętu.

Inną obiecującą technologią wykrywania kwasów nukleinowych jest amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP), która została po raz pierwszy opisana w 200016. LAMP to wysokowydajna metoda wykrywania DNA. Teoretycznie może amplifikować od 1 kopii do 109 kopii amplikonów w ciągu jednej godziny, a wszystko to wykonywane w stałej temperaturze (tj. między 60 - 65 °C). Udana amplifikacja wytworzy dużą ilość nierozpuszczalnego produktu ubocznego pirofosforanu i spowoduje zmianę zmętnienia17, które można bezpośrednio zaobserwować gołym okiem. Zmianę koloru można również zaobserwować poprzez dodanie jonów metali lub barwników fluorescencyjnych, takich jak Calcein18, Nucleic acid dye19 i hydroksylowo-naftol blue20. Ze względu na zalety wysokiej czułości i wygody obsługi, LAMP jest szeroko stosowany w wykrywaniu kwasów nukleinowych.

Obecnie istnieją głównie dwie strategie dla multipleksowych testów LAMP. Jednym z nich jest wykonanie wielu testów LAMP poprzez posiadanie wielu zestawów starterów LAMP w jednej probówce21,22,23. Jednak mnogość i wydajność wzmocnienia byłyby ograniczone przez wewnętrzną interferencję i konkurencję między różnymi zestawami starterów. Co więcej, identyfikacja różnych produktów LAMP w tej samej reakcji może być trudna. Inna strategia opiera się na izolacji fizycznej. Różne zestawy starterów zostały wyizolowane do poszczególnych zminiaturyzowanych komór, a następnie przeprowadzono jednocześnie wiele reakcji LAMP24,25. Podejścia te, które na ogół opierają się na chipach mikroprzepływowych, stanowią potencjalne rozwiązanie dla wysokoprzepustowych reakcji LAMP. Jednak produkcja chipów i wstępne powlekanie multipleksowe zestawów podkładów jest skomplikowane, co może zwiększyć koszty i zmniejszyć powtarzalność.

Ostatnio, kilka badań opisało przeprowadzanie reakcji LAMP w naczyniach włosowatych w celu ominięcia skomplikowanego wytwarzania chipów mikroprzepływowych i osiągnięto niskie koszty wykrywania26,27. Jednak w odniesieniu do analizy wysokoprzepustowej, kapilary te są podobne do miniaturowych wersji probówek paskowych do PCR, ponieważ próbki i odczynniki reakcyjne (w tym różne zestawy starterów) muszą być indywidualnie przygotowane i dostarczone do różnych jednostek reakcyjnych w kapilarach. Aby uzyskać analizę równoległą i multipleksową, wymagane jest dodatkowe wyposażenie, na przykład wielokanałowa pompa strzykawkowa, do równoległego ładowania próbek lub odczynników.

Aby przezwyciężyć ograniczenia związane z obecnymi metodami multipleksowego wykrywania kwasów nukleinowych, opracowaliśmy zminiaturyzowaną platformę, która łączy technologię wizualną LAMP z układem kapilarnym. Ta platforma jest wielokierunkowa, kompaktowa, tania i łatwa w obsłudze28. W tym miejscu opisujemy szczegóły dotyczące wytwarzania układu kapilarnego i przeprowadzania reakcji LAMP w układzie. Opisany tutaj protokół został ustandaryzowany przy użyciu wykrywania organizmów modyfikowanych genetycznie (GMO) jako modelu. Co ważne, protokół ten może być również stosowany w wysokoprzepustowym wykrywaniu innych celów kwasów nukleinowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ten protokół zakłada, że forma ze stali nierdzewnej o kształcie dla pożądanych mikrokanałów i adapter ładowania zostały już wykonane (pliki 3D są dostarczane jako Pliki Uzupełniające 1 i 2). Protokół ten zakłada również, że izolacja DNA roślin została już przeprowadzona.

1. Produkcja gotowej do użycia kasety opartej na macierzy kapilarnej

  1. Wyczyść formę ze stali nierdzewnej.
    1. Umyj formę ze stali nierdzewnej detergentem, etanolem i wodą dejonizowaną, aby usunąć potencjalne zanieczyszczenia. Wysuszyć formę azotem.
  2. Oczyść naczynia włosowate
    1. Nosić okulary ochronne, strój laboratoryjny i rękawice chroniące przed chemikaliami.
    2. Umieść naczynia włosowate w zlewce. Oczyść naczynia włosowate 30 ml acetonu przez 5 minut, aby usunąć materię organiczną, a następnie umyj naczynia włosowate wodą dejonizowaną.
      Uwaga: Z acetonem należy obchodzić się w dygestorium.
    3. Wlać 10 mlH2O2do zlewki, a następnie dodać 30 mlH2O2doH2O2, powoli wstrząsając, aby zapobiec przegrzaniu. Upewnij się, że roztwór (roztwór piranii) całkowicie zakrywa naczynia włosowate przez co najmniej 30 min.
      Uwaga: Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z roztworem piranii (H2SO4/H2O2 = 3: 1, v/v). Jeśli roztwór piranii zostanie rozlany, szybko zmyj roztwór dużą ilością wody i przetrzyj powierzchnię ręcznikami papierowymi.
      UWAGA: Dokładne czyszczenie naczyń włosowatych jest jednym z kluczowych punktów zapewniających powodzenie reakcji LAMP. Podczas procesu czyszczenia konieczne jest potrząśnięcie butlą z kwasem w celu usunięcia pęcherzyków w naczyniach włosowatych, a w razie potrzeby czas czyszczenia można również wydłużyć.
    4. Zmyj roztwór piranii dużą ilością wody. Myć naczynia włosowate etanolem i wodą dejonizowaną przez 5 minut każda. Wysuszyć naczynia włosowate w suszarce.
  3. Wlać polidimetylosiloksan (PDMS)
    1. Odważyć odczynniki bazowe i utwardzające PDMS w stosunku 1:1 w probówce o pojemności 50 ml. Zazwyczaj miesza się 5 g bazy elastomerowej z 5 g utwardzacza elastomerowego.
    2. Mieszaninę dokładnie mieszać przez około 5 minut szklaną pałeczką. Umieść probówkę z PDMS w kielichu próżniowym na 30 minut w celu odgazowania.
    3. Powoli wlej PDMS do cylindra formy ze stali nierdzewnej. Pozostawić PDMS do utwardzenia przez 3 godziny w suszarce w temperaturze 60 °C
      UWAGA: Należy uważać, aby uniknąć pęcherzyków powietrza podczas nalewania PDMS. Po nalaniu PDMS odstaw na 5 minut, aby w naturalny sposób usunąć pęcherzyki z PDMS.
  4. Usuń formę z PDMS
    1. Po utwardzeniu PDMS usuń formę, wyciągając formę z cylindrem. Usuń PDMS z cylindra, przecinając margines pleśni skalpelem.
    2. Umyj PDMS trzykrotnie etanolem i wodą dejonizowaną. Wysuszyć podporę PDMS azotem.
  5. Traktuj dolną powierzchnię podpory PDMS jako hydrofobową. Namocz podporę PDMS w superhydrofobowej powłoce na 1 s. Suszyć przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Włóż kapilę do wspornika PDMS
    1. Włóż oczyszczone kapilary 4 mm do otworów wspornika PDMS i pozostaw 0,5 mm kapilar na zewnątrz górnej powierzchni wspornika PDMS. Upewnij się, że końce naczyń włosowatych znajdują się na tym samym poziomie.
  7. Traktować zewnętrzną powierzchnię naczyń włosowatych i górną powierzchnię podpory PDMS jako hydrofobową.
    1. Nałóż 15 μl powłoki superhydrofobowej na górną powierzchnię podpory PDMS. Należy pamiętać, że powłoka natychmiast rozprzestrzenia się po całej górnej powierzchni (w tym na górnej powierzchni podpory PDMS i zewnętrznych powierzchniach odsłoniętej części naczyń włosowatych) pod wpływem siły kapilarnej.
    2. Wysuszyć na powietrzu superhydrofobowy zmodyfikowany układ kapilarny.
  8. Napraw starter w układzie kapilarnym
    1. Przygotuj roztwór podkładowy. Odważyć 0,65 g chitozanu (wzór cząsteczkowy: (C6H11NO4) n) i rozpuścić go w 50 ml wody dejonizowanej, dostosowując pH do 4,5-5,5 kwasem octowym, aby uzyskać stężenie chitozanu 1,3%. Przygotować mieszankę składników podkładu zgodnie z tabelą 1. Patrz Tabela uzupełniająca 1 dla podkładów
    2. Dodać 1,6 μl mieszaniny jednego zestawu starterów, aby wypełnić jedną odpowiednią kapilarnę układu kapilarnego zgodnie z wcześniej ustaloną kolejnością.
      UWAGA: Pozostałe dwie ślepe kapilary ustawiono jako kontrolę ujemną.
    3. Zakotwiczyć tablicę w przezroczystym dołku na standardowej 96-dołkowej płytce z płaskim dnem i suszyć tablicę w temperaturze 60 °C przez co najmniej 2 godziny.
pkt.
LAMP grunt utrwalający składniki mieszanki (stężenie początkowe)Objętość (μL)
ddH2O17,0
Chitozan (1,3%)1,0
Podkład FIP/BIP (20 μM)2,0/2,0
Podkład LoopF/LoopB (20 μM)1,0/1,0
Podkład F3/B3 (20 μM)0,5/0,5
Całkowita objętość25,0

Tabela 1: Składniki odczynników utrwalających podkład LAMP. Składniki mieszanki utrwalającej podkład LAMP są wymienione w lewej kolumnie tabeli, a objętość każdego składnika jest podana w prawej kolumnie.

  1. Zmontuj kasetę w następujący sposób. Umieść adapter ładujący na górze zakotwiczonej tablicy. Upewnij się, że miska adaptera zakrywa tylko odsłonięte części wszystkich dziesięciu naczyń włosowatych (patrz Rysunek 1).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Produkcja i montaż kasety. (a) Forma nierdzewna i wspornik PDMS. Forma składa się z 3 części: cylindra, płyty zaporowej i płyty słupkowej. (b) Schemat wytwarzania i montażu kasety kapilarnej z podporą PDMS. Cały proces składa się z 5 kroków: 1. Wylewanie PDMS, 2. Usuwanie pleśni, 3. Wprowadzanie kapilary i powlekanie powierzchni, 4. Mocowanie podkładu i 5. kotwienie kasety. 1. Wlej PDMS do cylindra formy; 2. Wypchnij deskę zapory, aby usunąć pleśń ze wspornika PDMS; 3. Pokryj dolną powierzchnię podpory PDMS, a następnie włóż kapilary do podpory PDMS, na koniec pokryj górną powierzchnię podpory PDMS i odsłonięte naczynia włosowate. Gruba niebieska linia wskazuje na super hydrofobową powłokę; 4. Załaduj zestaw podkładu do poszczególnych naczyń włosowatych; 5. Zakotwicz układ kapilarny w pojedynczej 96-dołkowej płytce i zainstaluj na niej adapter do ładowania próbki. Szczegóły zostały opisane w krokach protokołu 1.1 - 1.9. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Wydajność reakcji LAMP w układzie kapilarnym

  1. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej
    1. Przygotować mieszaninę reakcyjną LAMP zgodnie z Table 2.
    2. Dodać odczynniki do mieszaniny zgodnie z wybraną kolejnością, jak w tabeli 2, i wirować mieszaninę reakcyjną przez 5 s po dodaniu kalceiny. Delikatnie odwróć probówkę 20 razy po dodaniu polimerazy Bst.
pkt.
Składniki LAMP (stężenie początkowe)Objętość (μL)
ddH2ORozdział 11,6
MgSO4 (100 mM)2.0
dNTP (25 mM)1.4
Betaina (5 M)Wersja 4.0
Bufor (10x)Rozdział 2.5
Kalceina (1,25 mM)0,5
MnCl2 (25 mM)0,5
Polimeraza Bst (8 U/μL)1,5
DNA roślin (10 ng/μL)1,0
Całkowita objętość25,0

Tabela 2: System reakcji układu kapilarnego-LAMP. Składniki układu reakcyjnego składników LAMP z matrycą kapilarną są wymienione w lewej kolumnie, a objętość każdego składnika jest podana w prawej kolumnie.

  1. Załaduj odczynniki i zamknij kasetę
    1. Odpipetować 20 μL mieszaniny reakcyjnej LAMP ze standardową końcówką 100 μL. Włóż końcówkę do wlotu adaptera ładowania, aby ją zablokować. Delikatnie wstrzyknąć mieszaninę reakcyjną do naczynia adaptera; Mieszanina reakcyjna szybko wypełni naczynie, a następnie automatycznie załaduje naczynia włosowate za pomocą siły kapilarnej.
    2. Wyjmij adapter z zablokowaną końcówką i uszczelnij studzienkę przezroczystą folią uszczelniającą kompatybilną z PCR.
      UWAGA: Tylko naczynia włosowate stykające się z mieszaniną reakcyjną w naczyniu hydrofilowym mogą być wypełnione. Upewnij się więc, że górna strona wszystkich naczyń włosowatych jest tej samej wysokości (patrz Rysunek 2).

figure-protocol-2
Rysunek 2: Schemat ładowania próbki za pomocą adaptera ładowania. Rysunek przedstawia proces załadunku na przykładzie niebieskiego roztworu. Włóż końcówkę do wlotu i powoli wstrzykuj próbkę do adaptera, a następnie wyjmij adapter z zablokowaną końcówką. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Inkubować układ kapilarny w inkubatorze w temperaturze 63 °C przez 1 godzinę.

3. Odczyt wyników i analiza danych

  1. Zdobądź obrazy emisji fluorescencji.
    1. Zamocuj filtr UV na górnej powierzchni małej ręcznej latarki UV LED, aby przefiltrować światło widzialne.
    2. Wzbudz zdysocjowaną kalceinę, aby wyemitowała fluorescencję za pomocą latarki UV. Rób obrazy z górnej części układu kapilarnego za pomocą aparatu cyfrowego lub smartfona.
    3. Podczas robienia zdjęcia upewnij się, że aparat jest maksymalnie przybliżony na obszar naczyń włosowatych, aby uzyskać wysokiej jakości, wyraźne obrazy.
  2. Analizuj wyniki
    1. Otwórz obraz za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, a następnie wybierz "Image>Mold>Grayscale>Yes" i "Image>Mold>16bit>Yes". Wybierz "Plik>Zapisz jako>format>TIFF", aby przekonwertować obraz na 16-bitowy format TIFF.
    2. Wyodrębnij wartość intensywności fluorescencji
      1. Otwórz oprogramowanie do analizy mikromacierzy. Przeciągnij 16-bitowy obraz w formacie TIFF do interfejsu oprogramowania, a następnie wybierz długość fali "532 nm" i kolor "zielony", aby wyświetlić obraz.
      2. Utwórz nowy blok, aby zlokalizować sygnał fluorescencji z naczyń włosowatych. Wybierz "Narzędzia>Nowe bloki" i wprowadź liczbę kolumn i wierszy jako "1; 1" i "2; 5" oddzielnie w interfejsach "bloków" i "funkcji".
      3. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz model "Cechy", a następnie dostosuj położenie i średnicę, aby dopasować je do obszaru fluorescencji naczyń włosowatych. Wybierz "Analizuj", aby wyodrębnić wartość intensywności fluorescencji.
      4. Wybierz "Plik>zapisz ustawienia jako", aby zapisać dokumenty bloków i wybierz "Plik>zapisz wyniki jako", aby zapisać wyniki intensywności fluorescencji. Oblicz SNR, aby określić, czy LAMP jest pomyślnie wykonywany w kapilarnach.
        UWAGA: Sygnały kapilar uzyskano poprzez rejestrację wartości szarości plam, a stosunek sygnału do szumu (SNR) zdefiniowano jako stosunek średnich wartości sygnałów pierwszoplanowych celów do średnich wartości sygnałów pierwszoplanowych dwóch kontroli ujemnych. Punkt odcięcia w celu wyznaczenia pozytywnych sygnałów został ustalony jako SNR >2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej metodzie ważne jest, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu między różnymi naczyniami włosowatymi podczas ładowania próbki. W tym celu wprowadzono chitozan, który mógł zatrzymywać startery w poszczególnych naczyniach włosowatych. Aby sprawdzić, czy to działa, czy nie, wstępnie utrwaliliśmy zestaw starterów ADH1 (endogenny gen referencyjny kukurydzy) w kasecie kapilarnej ze wzorem "T" i "U", jak pokazano w Rysunek 3a. Zgodnie z...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zademonstrowana tutaj platforma CALM, która łączy technologię LAMP z układem kapilarnym, umożliwia jednoczesne wykrywanie wielu celów genowych związanych z GMO w jednym, wysoce skutecznym i łatwym w obsłudze teście.

Aby skutecznie przeprowadzić reakcje multipleksowe LAMP w kasecie, należy zwrócić uwagę na trzy krytyczne punkty. Po pierwsze, osiągnięcie tej samej wysokości górnej strony naczyń włosowatych oraz hydrofilowego i hydrofobowego wzoru układu kapilarnego ma kluczowe znaczenie dla jedn...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało częściowo sfinansowane przez National Natural Science Foundation of China Grants (31370813, 3147670, 31670831 i 31600672,), National Transgenic Plant Special Fund (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), Program for New Century Excellent Talents in University, National Key Research and Development Project of China (2016YFA0500601) oraz China Postdoctoral Science Foundation (2016M591667).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
UltraEverDry (powłoka superhydrofobowa)UltraTech4001dostawca: Exiron chemistry (CHINA) CO., LTD.
PDMSDow Corning8332557
Polimeraza BstNew England BioLabsM0275L
betainaSigma-AldrichB0300-1VL
kalceinaSigma-AldrichC0875-5G
MnCl2Sigma-AldrichMKBP0495V
MgSO4New England BioLabsB1003S
dNTPsShanghai SangonB804BA0022
chitozanShanghai SangonLJ0805S309J
oprogramowanie Photoshop 7.0Adobe Systems Inc., CA, USAAnaliza obrazu
GenePix Pro 6.1Molecular Devices, CA, USAOprogramowanie do analizy mikromacierzy
AutoCADAdobe Systems Inc.Oprogramowanie do budowy 3D
Filtr UV (ZWB2)YXSodawca: taobao
materiałów

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, Suppl 1. 73-79 (2006).
  2. Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
  3. Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infec. 21 (4), 323-331 (2015).
  4. Guo, J., et al. MPIC: A High-Throughput Analytical Method for Multiple DNA Targets. Anal Chem. 83 (5), 1579-1586 (2011).
  5. Shao, N., et al. MACRO: a combined microchip-PCR and microarray system for high-throughput monitoring of genetically modified organisms. Anal Chem. 86 (2), 1269-1276 (2014).
  6. Kamle, S., Ali, S. Genetically modified crops: detection strategies and biosafety issues. Gene. 522 (2), 123-132 (2013).
  7. Galvin, S., Dolan, A., Cahill, O., Daniels, S., Humphreys, H. Microbial monitoring of the hospital environment: why and how? J Hosp Infect. 82 (3), 143-151 (2012).
  8. Sciancalepore, A. G., et al. Microdroplet-based multiplex PCR on chip to detect foodborne bacteria producing biogenic amines. Food Microbiol. 35 (1), 10-14 (2013).
  9. Saxena, G., Bharagava, R. N., Kaithwas, G., Raj, A. Microbial indicators, pathogens and methods for their monitoring in water environment. J Water Health. 13 (2), 319-339 (2015).
  10. Hopwood, A. J., et al. Integrated Microfluidic System for Rapid Forensic DNA Analysis: Sample Collection to DNA Profile. Anal Chem. 82 (16), 6991-6999 (2010).
  11. Estes, M. D., et al. Optimization of multiplexed PCR on an integrated microfluidic forensic platform for rapid DNA analysis. Analyst. 137 (23), 5510-5519 (2012).
  12. Niemz, A., Ferguson, T. M., Boyle, D. S. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends Biotechnol. 29 (5), 240-250 (2011).
  13. Peeling, R. W., Mabey, D. Point-of-care tests for diagnosing infections in the developing world. Clin Microbiol Infec. 16 (8), 1062-1069 (2010).
  14. Perkins, M. D., Kessel, M. What Ebola tells us about outbreak diagnostic readiness. Nat Biotechnol. 33 (5), 464-469 (2015).
  15. Li, Y., et al. A universal multiplex PCR strategy for 100-plex amplification using a hydrophobically patterned microarray. Lab Chip. 11 (21), 3609-3618 (2011).
  16. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
  17. Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
  18. Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
  19. Iwamoto, T., Sonobe, T., Hayashi, K. Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M-avium, and M-intracellulare in sputum samples. J Clin Microbiol. 41 (6), 2616-2622 (2003).
  20. Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 46 (3), 167-172 (2009).
  21. Iseki, H., et al. Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites. J Microbiol Methods. 71 (3), 281-287 (2007).
  22. Liang, C., et al. Multiplex loop-mediated isothermal amplification detection by sequence-based barcodes coupled with nicking endonuclease-mediated pyrosequencing. Anal Chem. 84 (8), 3758-3763 (2012).
  23. Shao, Y., Zhu, S., Jin, C., Chen, F. Development of multiplex loop-mediated isothermal amplification-RFLP (mLAMP-RFLP) to detect Salmonella spp. and Shigella spp. in milk. Int J Food Microbiol. 148 (2), 75-79 (2011).
  24. Fang, X., Chen, H., Yu, S., Jiang, X., Kong, J. Predicting viruses accurately by a multiplex microfluidic loop-mediated isothermal amplification chip. Anal Chem. 83 (3), 690-695 (2011).
  25. Stedtfeld, R. D., et al. Gene-Z: a device for point of care genetic testing using a smartphone. Lab Chip. 12 (8), 1454-1462 (2012).
  26. Liu, D., Liang, G., Zhang, Q., Chen, B. Detection of Mycobacterium tuberculosis using a capillary-array microsystem with integrated DNA extraction, loop-mediated isothermal amplification, and fluorescence detection. Anal Chem. 85 (9), 4698-4704 (2013).
  27. Zhang, Y., et al. Point-of-Care Multiplexed Assays of Nucleic Acids Using Microcapillary-based Loop-Mediated Isothermal Amplification. Anal Chem. 86 (14), 7057-7062 (2014).
  28. Shao, N., et al. Visual detection of multiple genetically modified organisms in a capillary array. Lab Chip. 17 (3), 521-529 (2017).
  29. Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-moledule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet. , (1998).
  30. Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biol. 4 (7), 1115-1121 (2006).
  31. Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infect. 21 (4), 323-331 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Capillary ArrayNucleic Acid DetectionLoop Mediated Isothermal AmplificationMultiplex Visual DetectionGMO DetectionCapillary Force LoadingUV Flashlight ImagingFluorescence Intensity AnalysisCapillary Array CassetteLAMP Primer Sets

Related Articles