Artykuł metodologiczny

Przyleganie bakterii do powierzchni roślin mierzone w laboratorium

13.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56599

⸱

19 czerwca 2018

1Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

W tym artykule

Podsumowanie

Prosta metoda pomiaru i charakteryzowania przyczepności bakterii do roślin, szczególnie korzeni i pędów, jest opisana w tym artykule.

Streszczenie

Ten manuskrypt opisuje metodę pomiaru wiązania bakterii z powierzchniami roślin aksenicznych w mikroskopie świetlnym i za pomocą zliczania żywych komórek. Użyte materiały roślinne to korzenie, kiełki, liście i cięte owoce. Opisane metody są niedrogie, łatwe i odpowiednie dla małych próbek. Wiązanie jest mierzone w laboratorium i można stosować różne podłoża i warunki inkubacji. Wpływ inhibitorów można określić. Można również ocenić sytuacje, które sprzyjają wiązaniu się i je hamują. W niektórych przypadkach możliwe jest rozróżnienie, czy różne warunki zmieniają wiązanie, głównie ze względu na ich wpływ na roślinę, czy na bakterie.

Wprowadzenie

Pomiar wiązania bakterii z powierzchniami roślin stał się ważny w trzech różnych sytuacjach. Pierwszą sytuacją jest badanie przenoszenia ludzkich patogenów na powierzchniach roślin1,2,3. Celem jest zapobieżenie wiązaniu się bakterii lub usunięcie lub zabicie związanych bakterii, a tym samym ograniczenie przenoszenia chorób przez materiał roślinny. Drugą sytuacją jest badanie wiązania patogenów roślinnych z powierzchniami roślin4. Po raz kolejny celem jest zapobieżenie wiązaniu lub usunięcie lub zabicie związanych bakterii, a tym samym ograniczenie choroby. Trzecią sytuacją jest badanie wiązania się bakterii symbiotycznych lub wspomagających wzrost roślin5,6. Celem jest pobudzenie wiązania bakterii, a tym samym zwiększenie zdrowotności roślin i plonów.

Techniki pomiaru wiązania bakterii z powierzchniami roślin opisane w tym artykule są tanie i stosunkowo łatwe do przeprowadzenia. Jedyne wymagania to mikroskop i materiały, które zwykle można znaleźć w laboratorium bakteriologicznym. W przypadku niektórych technik przydatny jest sonikator do kąpieli. Opisane techniki przeznaczone są do eksperymentów wiążących przeprowadzanych przy stosunkowo małych rozmiarach prób. Pomiary wiązania są wykonywane w laboratorium, chociaż możliwe jest zmodyfikowanie niektórych z tych technik do użytku w szklarni lub w terenie.

Te techniki zostały użyte do zmierzenia wiązania bakterii z korzeniami, kiełkami, ściętymi liśćmi, ciętymi owocami i nienaruszonymi pomidorami koktajlowymi w laboratorium7,8,9,10,11,12,13,14, 15. Zostały one również wykorzystane do pomiaru kolonizacji korzeni roślin rosnących w glebie lub piasku w laboratorium16. Techniki te zostały wykorzystane w przypadku wielu gatunków bakterii, w tym Agrobacterium tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, Escherichia coli, Salmonella enterica i Pseudomonas fluorescens. Przydatny opis metod oceny interakcji A. tumefaciens z powierzchniami można znaleźć w Morton and Fuqua (2012)17. We wszystkich przypadkach wielkość próby była niewielka, na ogół mniejsza niż 25 - 50 roślin. Opisane techniki są odpowiednie do stosowania w odniesieniu do ludzkich czynników chorobotwórczych, które muszą być przechowywane w sposób zamknięty podczas doświadczeń.

Protokół

1. Przygotowanie aksenicznego materiału roślinnego

  1. Przygotuj siewki hodowane w wodzie.
    1. Umieść niewielką liczbę nasion (mniej niż 30) w szklanym zlewce o pojemności 30, 50, 10 lub 150 mL. W tym protokole zastosowano nasiona pomidora, lucerny, Arabidopsis thaliana, grochu, fasoli, tytoniu, sałaty i marchwi.
      UWAGA: Aby ustalić, ile nasion można sterylizować jednocześnie, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się kontaminacji z jednego nasiona na drugie, przejdź do kroku 1.1.2.
    2. Zalej nasiona 80% etanolem i krótko zamieszaj. Pozostaw nasiona do namoczenia na 1 min.
    3. Odlej etanol i zalej nasiona roztworem zawierającym 50% objętościowo komercyjnego wybielacza (NaClO) oraz 0,1% Triton X-10 w wodzie z kranu. Pozostaw nasiona do namoczenia na 20 min.
      UWAGA: W przypadku dużych nasion, takich jak nasiona fasoli, konieczne może być wydłużenie czasu namaczania w celu całkowitego zwalczenia grzybów na powierzchni nasion.
    4. Odlej mieszaninę z wybielaczem i przemyj nasiona 3 razy sterylną wodą. Pozostaw nasiona w wodzie na 1 min podczas każdego płukania.
    5. Aby uzyskać siewki akseniczne, dodaj niewielką ilość sterylnej wody, od 5 do 25 mL, w zależności od wielkości nasion. Przelej nasiona wraz z wodą do sterylnej szalki Petriego przeznaczonej do kiełkowania nasion.
      UWAGA: Woda powinna pokrywać dno szalki, ale nie może całkowicie zakrywać nasion, aby wspomóc tworzenie się włośników korzeniowych. Termin akseniczne opisuje kulturę, w której obecny jest tylko jeden gatunek organizmu.
    6. Inkubuj w ciemności, aż siewki osiągną pożądaną wielkość od 1 cm do 10 cm (około 5 dni dla pomidora i A. thaliana oraz od 1 do 3 dni dla lucerny). W przypadku większych nasion użyj przykrytego sterylnego pojemnika o pojemności powyżej 10 mL, np. szklanego naczynia przykrytego folią.
  2. Określ częstotliwość kontaminacji konkretnej partii nasion mikroorganizmami, które pozostają żywe na powierzchni lub wewnątrz nasion po sterylizacji powierzchniowej.
    ​UWAGA: Jest to konieczne, ponieważ pojedyncze nasiona mogą przenosić mikroorganizmy pod łupiną, których nie można zabić poprzez sterylizację powierzchniową. Wykorzystaj częstotliwość występowania zanieczyszczonych nasion w partii, aby określić, ile nasion można sterylizować jednocześnie, unikając wysokiego ryzyka kontaminacji całej grupy nasion przez jedno nasiono z bakteriami lub grzybami, które przeżyły zabieg.
    1. Wykonaj kroki od 1.1.1 do 1.1.3.
    2. Umieść nasiona na szalce Petriego z agarem odżywczym. Umieść około 10-30 nasion w każdej szalce, rozmieszczając je w odstępach umożliwiających indywidualną ocenę. Uszczelnij szalki taśmą lub folią uszczelniającą.
    3. Inkubuj przez 3 - 5 dni w temperaturze 25 °C, codziennie oceniając nasiona pod kątem widocznego wzrostu mikroorganizmów.
  3. Przygotuj siewki hodowane w piasku. Siewki mogą być hodowane w piasku do wykorzystania w eksperymentach dotyczących adhezji bakteryjnej.
    1. Wykonaj kroki od 1.1.1 do 1.1.3.
    2. Sterylizuj piasek kwarcowy lub morski w autoklawie. Oba rodzaje zawierają pewną ilość materiału organicznego. Jeśli będzie to wpływać na eksperyment, przemyj piasek, zalewając go dwukrotną objętościowo ilością 0,1 M HCl. Mieszaj przez 10 min. Pozostaw piasek do osadzenia się i odlej ciecz. Przepłucz piasek 3 razy wodą, a następnie raz 80% etanolem, po czym wykonaj dwa dodatkowe płukania wodą, stosując ten sam protokół co dla 0,1 M HCl. Sterylizuj przemyty piasek w autoklawie.
    3. Sterylizuj pojemniki, zanurzając je w 50% wybielaczu przez 5 min, a następnie przemyj je 5 razy sterylną wodą metodą zanurzeniową. Pozostaw do wyschnięcia i uszczelnij dno folią uszczelniającą. Folia w formie dostarczonej przez producenta jest zazwyczaj wolna od mikroorganizmów po stronie wewnętrznej, która powinna być skierowana do wnętrza pojemnika.
    4. Wymieszaj sterylny piasek z wystarczającą ilością sterylnej wody, aby go zwilżyć do stopnia, w którym piasek będzie się lepił. Ilość wody zależy od stopnia wysuszenia piasku. Zazwyczaj wystarcza 10 - 35% objętości piasku. Wsyp wilgotny piasek do pojemnika, zapewniając odpowiednią głębokość dla wymaganej długości korzeni oraz wystarczającą przestrzeń nad piaskiem dla wzrostu pędu. Dokładne odległości zależą od gatunku i odmiany stosowanej rośliny.
    5. Zasadź nasiona.
      1. Zrób w piasku płytki otwór za pomocą sterylnej szklanej rurki, na tyle głęboki, aby umieścić nasionko poniżej powierzchni piasku (około 1 - 5 mm). Umieść nasionko w otworze. Przykryj je cienką warstwą piasku. Uszczelnij górę pojemnika folią uszczelniającą, aby zapobiec utracie wody i przedostaniu się dodatkowych drobnoustrojów.
      2. Hoduj rośliny w laboratorium pod lampą lub w szklarni w temperaturze i przy długości dnia odpowiedniej dla gatunku i odmiany rośliny. Dla pomidora, lucerny lub Arabidopsis thaliana stosuj temperaturę pokojową i 12-godzinne cykle światło/ciemność.
    6. Zasadź siewki w otworze w piasku (o średnicy 1 - 2 mm i głębokości wystarczającej do przykrycia korzenia piaskiem). Otwór wykonaj sterylną szklaną rurką. Ostrożnie wprowadź korzeń do otworu, w razie potrzeby używając sterylnego szydełka ze stali nierdzewnej, a następnie wypełnij boki otworu piaskiem.
  4. Alternatywnie hoduj rośliny aksenicznie na lub w agarze zawierającym mieszankę soli, np. sole MS. Bezpośrednio wykorzystuj pędy roślin aksenicznych hodowanych w agarze. Unikaj korzeni hodowanych w agarze, ponieważ agar przywiera zarówno do powierzchni rośliny, jak i do bakterii. Może to prowadzić do błędnego wrażenia adhezji bakteryjnej do powierzchni rośliny.

2. Przygotowanie pozostałego materiału roślinnego

  1. Przed użyciem należy umyć wodą materiał roślinny wyhodowany w szklarni, aby zmniejszyć liczbę rodzimych drobnoustrojów. Na roślinach będą znajdować się bakterie i grzyby. Pierwotniaki będą obecne w glebie, na korzeniach i prawdopodobnie na liściach. Mycie wybielaczem lub etanolem zmieni powierzchnię rośliny i nie jest zalecane.
    1. Jeśli po myciu wodą nadal pozostaną znaczne ilości drobnoustrojów, należy potraktować rośliny rozcieńczonym płynnym mydłem do rąk lub rozcieńczonym nadtlenkiem wodoru (0,01%), aby usunąć lub zabić drobnoustroje. Jest to zazwyczaj mniej szkodliwe dla rośliny niż wybielacz lub etanol.
  2. Ponieważ materiał roślinny kupowany na lokalnym rynku jest trudny do dekontaminacji, należy wybrać materiał, który nie sprawia wrażenia, jakby był przechowywany przez długi czas. Należy unikać części materiału, które wydają się być brązowe lub uszkodzone.
    1. Należy umyć go wodą i przed użyciem wykonać świeże cięcia na końcach materiału, które zostały wcześniej przecięte, chyba że interesujące są oddziaływania testowanych bakterii z bakteriami (i eukariontami), które nagromadziły się w miejscach cięć. Nie należy myć wybielaczem ani etanolem, ponieważ zmienią one powierzchnię rośliny.
  3. Obróbka miejsc zranień. Miejsca zranień często umożliwiają bakteriom dostęp do wnętrza materiału roślinnego18.
    1. Aby zablokować lub ograniczyć przyleganie bakterii i ich przemieszczanie się przez miejsca zranień lub cięć powstałe podczas przygotowania materiału, należy zanurzyć ciętą krawędź w roztopionej parafinie lub pomalować to miejsce roztopioną parafiną za pomocą małego pędzla. Nie należy używać szpachelki ani żadnego ostrego narzędzia, ponieważ może to uszkodzić tkankę.
    2. Blizny na łodygach owoców, takich jak pomidory, należy uszczelnić parafiną. Niektóre bakterie przedostaną się do obszaru pod parafiną, ale ich liczba jest zazwyczaj niewielka.
    3. Jeśli interesuje badacza wnikanie bakterii w miejsca zranień, należy oszacować odległość, na jaką bakterie mogą się przemieścić wraz ze strumieniami wody lub drogą dyfuzji, obserwując ruch barwnika dodanego do roztworu. Bakterie ruchliwe należy znakować poprzez wprowadzenie do nich genu kodującego białko fluorescencyjne, takie jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), a następnie śledzić je za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opisanej w kroku 6.1.219.

3. Przygotowanie bakterii

  1. Hodowla bakterii. Należy zastosować pożywkę, która w najwyższym stopniu odpowiada warunkom, w jakich bakterie prawdopodobnie znajdowały się bezpośrednio przed kontaktem z rośliną w środowisku naturalnym poza laboratorium. Istotne są źródła węgla i azotu, a także obecność jonów, zwłaszcza kationów dwudodatnich (Ca, Mg, Fe, Mn i Zn) oraz fosforanów, a także pH pożywki.
    1. W przypadku A. tumefaciens oraz innych bakterii glebowych należy stosować minimalną pożywkę AB lub bulion Luria20. Dla E. coli, która może pochodzić z przewodu pokarmowego, należy stosować bulion Luria.
    2. Do pożywki należy dodać induktory, takie jak wysięki korzeniowe lub komercyjne ekstrakty roślinne (np. soytone) lub cukry, takie jak sacharoza lub ksyloza21. Jeśli substancje te są stosowane jako induktory, należy dodać je w niskim stężeniu, np. 0,01%. Jeśli są stosowane jako źródła węgla, należy dodać je w wyższym stężeniu, np. 0,1%.
  2. Przygotowanie inokulum bakteryjnego. Bakterie należy rozcieńczyć w wodzie sterylnej lub w pożywce, w której przeprowadzana będzie inkubacja, a następnie dodać je do materiału roślinnego. Odpowiednie rozcieńczenie omówiono w krokach 4.2 i 4.3.
    1. Aby usunąć pożywkę przed użyciem bakterii, należy odwirować zawiesinę bakteryjną przy 10,0 ×g przez 2 min, odlać nadsącz i resuspender bakterie poprzez wstrząsanie w vortexie w tej samej pożywce, która zostanie użyta do inkubacji z materiałem roślinnym. Metoda ta może usunąć lub zmniejszyć liczbę lub ilość materiału zewnątrzkomórkowego i przydatków, takich jak egzopolisacharydy, kapsuły, wici i/lub pili. Jeśli ważne jest, aby struktury powierzchniowe pozostały nienaruszone, należy po prostu rozcieńczyć bakterie przed inokulacją lub zastosować alternatywną metodę opisaną w kroku 3.2.2.
    2. Jako alternatywną metodę usuwania pożywki można zebrać bakterie na filtr nitrocelulozowy lub poliwęglanowy o wielkości porów 0,2 µm lub mniejszej. Bakterie należy przemyć pożywką inkubacyjną i resuspender poprzez delikatne wstrząsanie lub mieszanie filtra w vortexie w sterylnym pojemniku z pożywką.

4. Inokulacja bakterii

  1. Określ liczbę bakterii do inokulacji w zależności od metody pomiaru adhezji bakteryjnej oraz czasu inkubacji.
  2. W przypadku badań mikroskopowych przy czasie inkubacji krótszym niż 1 dzień, zastosuj stosunkowo dużą liczbę bakterii. Dodaj taką ilość kultury, aby uzyskać końcowe stężenie bakterii powyżej 106 bakterii na mL. W przypadku dłuższych czasów inkubacji zmniejsz wielkość inokulum bakteryjnego.
  3. W badaniach, w których adhezję bakteryjną mierzy się poprzez liczenie żywych komórek, dodaj taką ilość kultury, aby uzyskać końcowe stężenie bakterii od 103 do 106 bakterii na mL.
  4. Unikaj dodawania zbyt wielu bakterii, aby ich metabolizm nie zmienił pH lub stężenia tlenu w medium inkubacyjnym. Pomiar pH przeprowadź za pomocą papierka wskaźkowego lub elektrody pH. Stężenie tlenu zmierz przy użyciu elektrody tlenowej.
  5. W przypadku roślin hodowanych w piasku inokulację można przeprowadzić na trzy sposoby:
    1. Inokuluj nasiona przed sadzeniem, mocząc je przez 1 min w zawiesinie wodnej o stężeniu około 106 bakterii na mL.
    2. Inokuluj korzeń poprzez wykiełkowanie aksenicznych siewek zgodnie z opisem w sekcji 1, a gdy korzeń siewki osiągnie długość około 1 cm, zanurz go lub umieść całą siewkę w zawiesinie 106 bakterii na mL w wodzie na 1 min.
    3. Inokuluj piasek, mieszając bakterie z piaskiem przed sadzeniem, aby uzyskać końcowe stężenie około 103 bakterii na mL, lub podlewając siewkę zawiesiną 106 bakterii na mL po posadzeniu.

5. Inkubacja bakterii z materiałem roślinnym

  1. W przypadku inkubacji w mediach ciekłych, inkubuj bakterie wraz z materiałem roślinnym w sterylnej wodzie, sacharozie i solach mineralnych lub pożywce do kultur tkanek roślinnych (np. w 1:10 rozcieńczeniu soli MS)2,23.
    1. Użyj naczynia, do którego bakterie nie przylegają. Staraj się, aby powierzchnia rośliny była stale przykryta, poprzez zanurzenie lub delikatne mieszanie. Intensywne mieszanie może zapobiegać adhezji lub nawet usuwać bakterie z powierzchni rośliny.
    2. Obserwuj materiał roślinny pod mikroskopem świetlnym w różnych odstępach czasu, aby określić moment zakończenia inkubacji i wykonania pomiarów. Analiza kinetyki adhezji jest często wartościowa przy pobieraniu próbek co 1 do 4 h lub codziennie, w zależności od szybkości interakcji.
  2. Aby inkubować w piasku, zastosuj te same uwagi opisane dla inkubacji w medium ciekłym w punkcie 5.1.

6. Pomiar adhezji z wykorzystaniem mikroskopii

  1. Wykonaj pomiary mikroskopowe z wykorzystaniem optyki Nomarskiego lub kontrastu fazowego, aby ułatwić obserwację bakterii na powierzchniach. Można jednak użyć dowolnego mikroskopu w polu jasnym z powiększeniem 20X lub wyższym.
    1. Wykorzystaj obserwację mikroskopową, aby ustalić, czy bakterie są rozmieszczone losowo, czy znajdują się w konkretnych miejscach. Sprawdź również, czy są one związane pojedynczo, czy w skupiskach. Poszukaj obecności mikrokolonii sugerujących wzrost bakterii lub ich uwięzienie po adhezji. Sprawdź, czy bakterie wydają się tworzyć biofilm na powierzchni.
      UWAGA: Biofilm to duża liczba bakterii związanych z powierzchnią i otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową23,24,25. Struktura może być gładka i jednorodna lub posiadać bardziej złożoną architekturę. Metody badania biofilmów związanych z powierzchniami roślin zostały opisane w literaturze17.
    2. Użyj bakterii znakowanych markerem fluorescencyjnym. Jeśli obecne są inne bakterie, a bakterie będące przedmiotem zainteresowania są identyfikowane za pomocą znacznika fluorescencyjnego, takiego jak zielone białko fluorescencyjne, zastosuj mikroskopię fluorescencyjną, aby określić obecność znakowanych bakterii w skupiskach innych bakterii26. W przypadku GFP użyj filtra z wzbudzaniem 490 nm i emisją 520 nm.
      1. Upewnij się, że znacznik fluorescencyjny nie wpływa niekorzystnie na bakterie, obserwując adhezję do materiału aksenicznego równej mieszaniny bakterii typu dzikiego i znakowanych bakterii tego samego szczepu, stosując zarówno optykę Nomarskiego, jak i fluorescencyjną. Jeśli bakterie fluorescencyjne i ciemne są rozmieszane losowo i występują w równych liczbach, oznacza to, że znacznik nie zakłócił badania.
  2. Określ liczbę przytwierdzonych bakterii.
    ​UWAGA: Bardzo trudno jest określić liczbę przytwierdzonych bakterii pod mikroskopem. W przypadku wiązania do nieregularnych powierzchni roślinnych zazwyczaj nie jest możliwe uzyskanie pomiaru ilościowego. Do takich pomiarów można wykorzystać skaningową mikroskopię elektronową (nieomawianą w niniejszym artykule).
    1. Gdy bakterie są związane z gładką powierzchnią, taką jak włośnik korzenia, oblicz liczbę bakterii związanych z krawędzią włośnika na 1 mm długości włośnika. Podczas porównywania pomiarów należy zadbać o użycie włośników o zbliżonej wielkości i kształcie.
    2. Aby określić rozmiar obiektów w mikroskopie, użyj komercyjnego preparatu z naniesionymi pomiarowymi znacznikami. Obserwuj i fotografuj ten preparat przy tych samych ustawieniach, których użyto dla materiału badawczego, a następnie wykorzystaj otrzymane obrazy do określenia rozmiaru obiektów na fotomikrografiach.
  3. Przygotuj próbkę do mikroskopii.
    1. Przemyj próbkę. Przenieś próbkę do kropli wody lub pożywki inkubacyjnej na płytce mikroskopowej i obserwuj ją bezpośrednio.
      UWAGA: Ma to tę zaletę, że jeśli nie doszło do wzrostu bakterii lub faktycznej śmierci bakterii, mało prawdopodobne jest wystąpienie wielu wolnych bakterii. Brak wolnych bakterii należy traktować jako sygnał ostrzegawczy, że mogło dojść do śmierci bakterii lub ich związania z naczyniem, w którym prowadzono inkubację. Efekt przemywania próbki przedstawiono na Rysunku 1.
    2. Delikatnie przemyj próbkę w wodzie lub pożywce inkubacyjnej, umieszczając ją w fiolce z cieczą i delikatnie odwracając fiolkę. Następnie umieść próbkę na płytce mikroskopowej w świeżej cieczy do obserwacji.
    3. Zamknij próbkę w cieczy, używając zwykłego szkiełka nakrywkowego i płytki mikroskopowej.
      1. Jeśli próbka jest gruba i mogłaby spowodować wybrzuszenie pod szkiełkiem nakrywkowym, użyj dociskanego szkiełka nakrywkowego. Takie szkiełka mają pierścień z gumy lub tworzywa sztucznego wokół krawędzi. Umieść ciecz i próbkę w zagłębieniu szkiełka nakrywkowego, a następnie połóż na górze płytkę i delikatnie dociśnij, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe z płytką. Odwróć i zbadaj.
      2. Alternatywnie w podobny sposób użyj płytki do liczenia alg i szkiełka nakrywkowego. Należy pamiętać, że płytki o takiej głębokości zazwyczaj nie można badać za pomocą obiektywu o powiększeniu większym niż 20X.

Obrazy mikroskopowe przedstawiające analizę powierzchni włókien, z zaznaczonymi strzałkami różnymi teksturami.
Rycina 1Etapy przygotowania próbki do oznaczenia liczby związanych bakterii. *A. tumefaciens* wiązanie do włośników korzeniowych pomidora (A, B i C) oraz do nici nylonowych (D, E i F). W próbkach zamontowanych w wodzie bez przemywania widoczne są zarówno bakterie związane (czarne strzałki), jak i bakterie wolne (białe strzałki) (A i D). Po przemyciu bakterie związane pozostają, natomiast bakterie wolne nie są już obecne (B i E). Po sonikacji bakterie związane zostały usunięte z powierzchni próbki (C i F). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. W przypadku użycia bakterii fluorescencyjnych, należy zbadać próbkę pod mikroskopem po usunięciu piasku. Korzenie roślin uprawianych w piasku są zazwyczaj nieodpowiednie do mikroskopii, ponieważ cząstki piasku utrudniają obserwację bakterii.
    1. Wyjąć roślinę z pojemnika hodowlanego zgodnie z krokiem 7. Umieścić korzenie w pojemniku z wodą i delikatnie wymieszać, aby usunąć piasek, który osadzi się na dnie pojemnika.
    2. Wyjąć roślinę z wody płuczącej i przygotować preparat zgodnie z krokiem 6.3.3.

7. Pomiar adhezji za pomocą liczenia żywych komórek

  1. Wyznacz liczbę żywych bakterii przytwierdzonych przy użyciu sonikatora.
    1. Usuń bakterie nieprzytwierdzone. Umieść próbkę w fiolce z wystarczającą ilością wody, buforu płuczącego lub pożywki inkubacyjnej, aby zakryć materiał roślinny, i kilkakrotnie odwróć fiolkę.
      1. Jeśli w początkowej inkubacji obecnych było więcej niż 103 wolnych bakterii na mL, przeprowadź sekwencyjne płukania w celu ich całkowitego usunięcia. Sprawdź w mikroskopie świetlnym (patrz krok 6.3), czy wolne bakterie są nadal obecne.
      2. Płucz do momentu znacznego zmniejszenia liczby wolnych bakterii, pamiętając jednak, że istnieje równowaga między bakteriami przytwierdzonymi a wolnymi, więc liczba wolnych bakterii może nigdy nie spaść do zera.
    2. Wyjmij próbkę z fiolki z cieczą płuczącą za pomocą pęsety lub szpachelki.
    3. Wyznacz liczbę bakterii przytwierdzonych w inkubacjach roślin w cieczy.
      1. Zawieś wypłukaną próbkę w fiolce i zakryj ją odmierzoną objętością wody, pożywki inkubacyjnej lub buforu płuczącego. Użyj takiej ilości cieczy, aby zakryć próbkę. Umieść fiolkę w kąpieli sonikacyjnej i sonikuj przez jedną min.
      2. Wyjmij próbkę i obejrzyj ją pod mikroskopem świetlnym, aby sprawdzić, czy bakterie przytwierdzone zostały usunięte z rośliny. Usunięcie bakterii z próbki za pomocą sonikacji przedstawiono na Rysunku 1. Jeśli nadal obecne są bakterie przytwierdzone, kontynuuj sonikację próbki do czasu, aż na powierzchni próbki nie pozostaną żadne przytwierdzone bakterie. Jeśli bakterii przytwierdzonych nie można usunąć poprzez sonikację, dodaj 1 - 10 mg/mL sterylnego piasku kwarcowego i powtórz sonikację oraz badanie mikroskopowe.
      3. Upewnij się, że procedura sonikacji, która okazała się najskuteczniejsza w kroku 7.1.3.2, nie obniża żywotności bakterii, zawieszając bakterie z hodowli płynnej w roztworze przeznaczonym do sonikacji (dodaj piasek kwarcowy, jeśli był on niezbędny). Wyznacz liczbę żywych komórek. Sonikuj bakterie i ponownie wyznacz liczbę żywych komórek.
        UWAGA: Jeśli nastąpi spadek liczby żywych komórek, zmodyfikuj procedurę, zmieniając skład cieczy i/lub czas sonikacji, aż zabieg nie będzie miał wpływu na liczbę żywych komórek.
      4. Upewnij się, że bufor rozcieńczający używany do oznaczania liczby żywych komórek nie wpływa na żywotność bakterii inkubowanych w zastosowanych warunkach, porównując liczbę żywych komórek wyznaczoną przy użyciu różnych buforów rozcieńczających i/lub wody.
  2. Wyznacz liczbę żywych bakterii przytwierdzonych przy użyciu homogenizacji.
    1. Umieść próbkę w sterylnym moździerzu, blenderze lub innym urządzeniu do homogenizacji. Zakryj ją odmierzoną objętością sterylnej wody, pożywki inkubacyjnej lub buforu płuczącego27. Użyj objętości wystarczającej do zakrycia próbki. W przypadku blendera użyj 10 mL.
    2. Rozcieraj próbkę aż do pełnej homogenizacji. Po homogenizacji sprawdź pH, aby upewnić się, że kwas uwolniony z tkanki roślinnej nie spowodował gwałtownego spadku pH poniżej 7. Jeśli pH spadło, użyj w cieczy homogenizującej buforu, np. buforu fosforanowego, aby utrzymać pH.
    3. Wyznacz liczbę żywych komórek.
  3. Użyj bakterii oznaczonych opornością na antybiotyki.
    1. W sytuacjach, gdy obecny jest więcej niż jeden typ bakterii, oznacz szczepy bakteryjne wykorzystując spontaniczną oporność na antybiotyki (typowo ryfampicynę i kwas nalidiksowy).
      1. Wyznacz stężenie antybiotyku do zastosowania. Jeśli dostępne są hodowle innych organizmów, których spodziewamy się w inkubacji, wysiej te hodowle, wyhodowane w warunkach planowanej inkubacji z roślinami, na płytki zawierające szereg stężeń wybranego antybiotyku. Wyznacz najniższe stężenie, które nie pozwala na wzrost któremuś z tych organizmów. Jest to najniższe stężenie antybiotyku, na które bakterie testowe będą musiały być oporne.
      2. Uzyskaj spontaniczne mutanty oporne na antybiotyki. Hoduj kulturę bakterii w pożywce bogatej do późnej fazy logarytmicznej lub fazy stacjonarnej. Wysiej 0,1 mL nierozcieńczonej hodowli na płytkę zawierającą pożądany antybiotyk w odpowiednim stężeniu. Stężenia do zastosowania wyznacz zgodnie z opisem w kroku 7.3.1.1. Zachowaj i oczyść bakterie, które urosły, a tym samym są oporne na antybiotyk.
      3. Upewnij się, że oporność na antybiotyk nie ogranicza wzrostu bakterii, wykonując krzywą wzrostu w pożywce płynnej dla szczepu rodzicielskiego i szczepów opornych na antybiotyk. Jeśli to możliwe, wykaż, że bakterie oporne na antybiotyk wykazują ten sam poziom kolonizacji aksenicznego materiału roślinnego co szczep rodzicielski.
  4. Wyznacz liczbę żywych bakterii przytwierdzonych do roślin uprawianych w piasku.
    1. Wyjmij roślinę z pojemnika i piasku. Aby wyjąć rośliny z pojemników, najpierw usuń materiał uszczelniający z góry i dołu pojemnika. Umieść pojemnik nad kawałkiem sterylnego papieru i delikatnie usuń cały piasek lub glebę wraz z rośliną jako jeden duży stożkowaty cylinder, lekko uderzając pojemnikiem o powierzchnię, aby poluzować materiał.
      1. W razie potrzeby użyj szpachelki lub pręta, aby poluzować materiał przy krawędziach, wprowadzając je przez dno pojemnika.
    2. Gdy cylinder z piasku lub gleby zawierający roślinę znajdzie się na papierze, rozdziel go wzdłuż środka, aby odsłonić korzeń rośliny. Jeśli jest to pożądane, pobierz próbki piasku zarówno z okolic krawędzi pojemnika, jak i z okolic korzenia. Może to być przydatne do określenia rozprzestrzeniania się (a także akumulacji i wzrostu) bakterii.
    3. Zmierz długość korzenia. Wyjmij korzeń i usuń piasek oraz bakterie luźno przytwierdzone do korzenia (materiał ryzosfery), zanurzając korzeń w odmierzonej objętości wody lub buforu i delikatnie nim wstrząsając. Wyznacz liczbę żywych komórek bakterii w otrzymanej zawiesinie poprzez wysiew na odpowiednią pożywkę, np. agar Luria. Reprezentuje to liczbę bakterii luźno związanych z korzeniem.
  5. Usuń silnie przytwierdzone bakterie za pomocą sonikacji i wyznacz ich liczbę zgodnie z opisem w kroku 7.1.
  6. Alternatywnie, aby określić lokalizację silnie przytwierdzonych bakterii na korzeniu, umieść wypłukany korzeń na powierzchni płytki Petri zawierającej agar odżywczy lub inną odpowiednią pożywkę. Obserwuj lokalizację kolonii bakteryjnych na korzeniu przez następne 3 dni, używając mikroskopu stereoskopowego lub lupy.
  7. Wyraź wyniki jako liczbę bakterii na roślinę, na cm2 powierzchni, na cm długości korzenia lub na gram świeżej masy tkanki. Wykonaj wielokrotne powtórzenia tego samego dnia, a także powtórzenia w różne dni, używając różnych kultur bakteryjnych i różnych partii materiału roślinnego.

8. Określanie, czy wpływ warunków inkubacji na adhezję wynika z odpowiedzi bakterii czy rośliny

  1. Użyj martwego lub zabitego materiału roślinnego.
    1. Poddaj materiał roślinny działaniu różnych chemikaliów, utrwalaczy lub innych zabiegów, takich jak obróbka termiczna, w celu jego zabicia. Po zastosowaniu któregokolwiek z tych zabiegów dokładnie wypłucz materiał roślinny w wodzie i pożywce inkubacyjnej. Następnie zaszczep bakterie. Pozwoli to zachować powierzchnię rośliny, ale uczyni ją metabolicznie nieaktywną, dzięki czemu nie będzie ona mogła reagować na bakterie.
    2. Zmierz adhezję bakteryjną zgodnie z opisem w krokach 6 i/lub 7. Wyznacz również liczbę żywych komórek dodanych do inkubacji z materiałem roślinnym na początku procesu oraz liczbę żywych komórek obecnych po zakończeniu inkubacji, aby upewnić się, że podczas inkubacji nie wystąpiły żadne toksyczne substancje chemiczne.
  2. Użyj materiału nieożywionego.
    1. Wykorzystaj przyleganie bakterii do materiału nieożywionego, aby ustalić, czy efekt obserwowany przy adhezji bakterii do materiału roślinnego wynika z oddziaływania na roślinę czy na bakterie. Wybierz materiał nieożywiony, do którego bakterie się wiążą i który jest podobny pod względem kształtu i rozmiaru do badanego materiału roślinnego. Możliwości obejmują wszystkie rodzaje papierów filtracyjnych (celulozowe, nitrocelulozowe, z włókna szklanego, poliwęglanowe itp.), nici (nylonowe, bawełniane, poliestrowe, z wełny szklanej itp.), szkieł lub plastikowych szkiełek podstawowych, kupony ze stali nierdzewnej oraz membrany dializacyjne.
    2. Dokładnie wypłucz materiał nieożywiony w wodzie oraz w pożywce, w której prowadzona będzie inkubacja, a następnie wysterylizuj go przed użyciem. Większość materiałów wymienionych w kroku 8.2.1 jest odporna na sterylizację w autoklawie.
    3. Inkubuj materiał nieożywiony w wybranych warunkach i oceń wynik zgodnie z opisem w krokach 6 i 7. Przykład użycia nici nylonowych w celu wykazania, że zmniejszone wiązanie A. tumefaciens do włośników korzeniowych przy wysokich stężeniach wapnia wynika (przynajmniej częściowo) z wpływu wapnia na bakterie, przedstawiono na Rysunku 428.

Wyniki

A. tumefaciens kolonizuje powierzchnie korzeni. Aby określić, czy produkcja celulozy przez bakterie odgrywa rolę w kolonizacji korzeni, zbadano wpływ mutacji bakteryjnych uniemożliwiających syntezę celulozy16. Zastosowano techniki opisane w krokach 1.3 i 7.1. Nasiona pomidora poddano sterylizacji powierzchniowej i kiełkowano w wodzie sterylnej. Gdy korzenie osiągnęły długość około 2 cm, zanurzano je w zawiesinie zawierającej 105 bakterii na mL, a następnie sadzono w pasteryzowanym podłożu w pojemnikach. Rośliny uprawiano przez 14 dni w temperaturze 25 °C w cyklu 12 godzin światła i 12 godzin ciemności. Po upływie określonych czasów rośliny wyjmowano z pojemników. Korzenie przemywano i poddawano sonikacji w sonikatorze wanny w celu usunięcia przytwierdzonych bakterii. Liczbę bakterii oznaczano metodą liczby żywych komórek. Rycina 2 przedstawia wpływ dwóch różnych mutacji pozbawionych zdolności wytwarzania celulozy na zdolność bakterii do kolonizacji korzeni pomidora. Mimo że odchylenia standardowe niektórych pomiarów sięgały nawet 0,9 log10 (powszechny problem przy tym typie pomiarów), zmniejszenie przyłączania się mutantów pozbawionych celulozy jest wyraźnie widoczne, co pozwala wnioskować, że produkcja celulozy przez bakterie wspomaga je w kolonizacji korzeni pomidora.

Wykres tendencji wzrostu; logarytm średniej vs. dzień; szczepy C58; analiza danych; wyniki badań biologicznych.
Rycina 2: Kolonizacja korzeni przez typ dziki oraz mutanty pozbawione celulozy u A. tumefaciens. Log10  całkowitej liczby bakterii na centymetr długości korzenia wyizolowanych z korzeni pomidora zainokulowanych typem dzikim A. tumefaciens szczepem C58 oraz mutantami pozbawionymi celulozy C58:1 i C58:A60. Wykazane liczby są średnimi z co najmniej czterech niezależnych eksperymentów. Słupki oznaczają odchylenia standardowe średnich. Inokulację korzeni przeprowadzono poprzez zanurzenie ich na jedną minutę w zawiesinie zawierającej 105 bakterii na mL. Rośliny hodowano w pojemnikach, a słabo przylegające bakterie usuwano poprzez płukanie korzeni w buforze płuczącym w fiolce szklanej. Silnie przylegające bakterie usuwano za pomocą sonikatora kąpielowego, a uzyskaną zawiesinę posiewano w celu określenia liczby żywych komórek16. Rycina została zmodyfikowana na podstawie danych Matthysse i McMahan. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Zbadano rolę egzopolisacharydów w przyłączaniu się E. coli oraz innych bakterii do kiełków lucerny. Niektóre przypadki występowania biegunek spowodowanych przez E. coli O157:H7 zostały powiązane z zanieczyszczonymi kiełkami lucerny. Przyłączanie się bakterii typu dzikiego oraz mutantów niezdolnych do wytwarzania różnych egzopolisacharydów mierzono za pomocą metod opisanych w krokach 1.1, 5.1 i 7.2. Kiełki lucerny sterylizowano na powierzchni i kiełkowano przez jeden dzień w wodzie sterylnej w temperaturze 25 °C w ciemności. Cztery kiełki z przylegającymi łupinami nasion umieszczono w sterylnych szklankach plastikowych zawierających 5 mL wody. Dodano bakterie hodowane w bulionie Lurii do końcowego stężenia około 5 x 103 na mL. Zainfekowane kiełki inkubowano przez 3 dni w temperaturze 25 °C w ciemności. Kiełki przemywano dwukrotnie 5 mL sterylnej wody w probówce przez intensywne odwracanie, a następnie homogenizowano w buforze do mycia za pomocą napędzanego silnikiem homogenizatora teflonowego szklanego. Wcześniejsze eksperymenty z wykorzystaniem bakterii oznaczonych plazmidem zawierającym gen GFP nie wykazały obecności bakterii wewnętrznych, podczas gdy bakterie powierzchniowe były łatwo obserwowalne. Wyniki przedstawiono w Tabeli 1. Zbadano dwa szczepy E. coli O157:H7. U obu szczepów produkcja poli-β-1,6-glukuronianu (PGA) wydawała się wnosić największy wkład w przyłączanie się patogennych E. coli do powierzchni roślin. Kwas kolowy również odgrywał istotną rolę w przyłączaniu. Choć zmniejszenie przyłączania się u mutantów pozbawionych celulozy było istotne, nie było ono tak duże jak w przypadku dwóch innych polisacharydów.

Wpływ mutacji w genach odpowiedzialnych za produkcję egzopolisacharydów na wiązanie się E. coli O157:H7 z kiełkami i otwartymi łupinami nasion
Odmiana bakteriiMutacja lub genotyp (istotny fenotyp)Log10 liczba bakterii związanych na kiełek lub łupinę nasion
Kiełki lucernybOtwarte łupiny nasion
86-24Brak (typ dziki)4,7 ± 0,65,6 ± 0,2
8624NyhjN (minus celuloza)2,9 ± 0,7c3,5 ± 0,6c
8624CwcaD (minus kwas kolowy)1,8 ± 0,7c2,4 ± 0,5c
8624PpgaC (minus PGA)<1,0c1,0 ± 1,0c
DEC4ABrak (typ dziki)5,6 ± 0,26,1 ± 0,3
DEC4ANyhjN (minus celuloza)4,8 ± 0,8d4,1 ± 0,8d
DEC4ACwcaD (minus kwas kolowy)3,9 ± 0,5c4,8 ± 0,8d
DEC4APpgaC (minus PGA)<1,0c1,2 ± 0,7c
a średnia ± odchylenie standardowe co najmniej trzech pomiarów liczby (log10) bakterii związanych po 3 dniach.
b Kiełki były płukane przed pomiarem.
c Istotna różnica względem typu dzikiego: P <0,01.
d Istotna różnica względem typu dzikiego: P <0,05.
Tabela została zmodyfikowana na podstawie pracy Matthysse, Deora, Mishra i Torres10.

Tabela 1: Wpływ mutacji w genach odpowiedzialnych za produkcję egzopolisacharydów na przyłączanie się szczepów E. coli O157:H7 do kiełków. Aby określić rolę różnych egzopolisacharydów i lipopolisacharydu w przyłączaniu się patogennych szczepów E. coli O157:H7 do kiełków lucerny, zbadano przyłączanie się zestawu mutantów do kiełków oraz otwartych łupin nasion metodami opisanymi w kroku 6. Wyniki wykazały, że poli-ß-1,6-N-acetylo-D-glukozaamina (PGA) wydaje się być niezbędna do przyłączania się do kiełków, a zarówno celuloza, jak i kwas kolaniczny są wymagane do maksymalnego przywiązania się E. coli O157. Tabela została zmodyfikowana na podstawie danych Matthysse, Deora, Mishra i Torres10.

Aby określić, czy produkcja PGA jest wystarczająca, by spowodować przyłączanie bakterii do powierzchni roślin, wprowadzono plazmid (pMM11) zawierający sklonowany operon kodujący geny niezbędne do produkcji PGA do dwóch różnych bakterii, które normalnie nie potrafią przyłączać się do korzeni pomidora10. A. tumefaciens A1045 to mutant dzikiego szczepu C58, który nie wytwarza cyklicznego-β-1,2-glukanu i nie przyłącza się do powierzchni roślin29. Sinorhizobium meliloti 1021, który tworzy brodawki korzeniowe na lucerni, nie przyłącza się do roślin niemotylkowych, w tym do pomidora12. Techniki opisane w krokach 1.1, 5.1, 6.3 i 7.1 zastosowano w celu ustalenia, czy zdolność do wytwarzania PGA ogólnie zwiększa przyłączanie bakterii do powierzchni korzeni. Nasiona pomidora poddano sterylizacji powierzchniowej i kiełkowano w wodzie sterylnej. Korzenie pokrojono na odcinki długości 1 cm i umieszczono w wodzie sterylnej, a następnie zaszczepiono bakteriami. Ponieważ obie te bakterie rosną w różnym tempie, przyłączanie mierzono w różnych czasach, aby w przybliżeniu wyrównać ilość wzrostu bakterii. Obecność plazmidu pMM11 spowodowała podobny, istotny wzrost liczby przyłączonych bakterii obu gatunków (Tabela 2)10. Istotny wzrost przyłączania zaobserwowano również w mikroskopie świetlnym, jednak sposób przyłączania był zupełnie inny dla obu gatunków (Rycina 3). A. tumefaciens A1045 przyłączał się pojedynczo do powierzchni korzenia. S. meliloti przyłączał się w dużych skupiskach, z których tylko nieliczne bakterie były bezpośrednio połączone z korzeniem, podczas gdy większość bakterii przylegała do innych bakterii. Ten przykład pokazuje, że analiza wyłącznie liczby przyłączonych bakterii bez uwzględnienia obserwacji mikroskopowych może prowadzić do mylącego obrazu wyników eksperymentu. Choć obie metody (liczenie żywych komórek i obserwacje mikroskopowe) wskazują, że plazmid pMM11 zwiększa przyłączanie bakterii do korzeni pomidora, rodzaj tego przyłączania wynikający z produkcji PGA był różny dla obu gatunków bakterii10.

Wpływ plazmidu pMM11 na przyłączanie bakterii do korzeni pomidora
Szczep bakteriiPlazmidLiczba bakterii przyłączonych na mm długości korzenia
A. tumefaciens A1045abrak0,25 x 103 ± 0,25 x 103
pBBR1mcs (wektor)0,25 x 103 ± 0,25 x 103
pMM11 (synteza PGA)10 x 103 ± 0,25 x 103
S. meliloti 1021bbraknie wykryto
pBBR1mcs (wektor)nie wykryto
pMM11 (synteza PGA)50 x 103 ± 5 x 103
a Przyłączanie bakterii mierzono po 2 godzinach
b Przyłączanie bakterii mierzono po 18 godzinach
Tabela została zmodyfikowana z pracy Matthysse, Deora, Mishra i Torres10.

Tabela 2: Wpływ plazmidu zawierającego geny syntezy PGA na przyłączanie się A. tumefaciens A1045 oraz S. meliloti 1021 do odcinków korzeni pomidora. Aby zbadać zdolność poli-ß-1,6-N-acetylo-D-glukozyloaminy (PGA) do promowania przyłączania bakterii do korzeni roślin, analizowano wpływ plazmidu nadającego zdolność do wytwarzania PGA (pMM11) na przyłączanie się dwóch szczepów bakterii związanych z roślinami do korzeni pomidora. Żaden ze szczepów nie wykazywał istotnego przyłączania się do korzeni pomidora w przypadku braku plazmidu ani w obecności plazmidu pozbawionego genów kodujących syntezę PGA (pBBR1mcs). Wprowadzenie plazmidu zawierającego geny syntezy PGA zwiększyło przyłączanie się obu typów bakterii. Ponieważ A. tumefaciens rośnie szybciej niż S. meliloti, przyłączanie mierzono po 2 godzinach inkubacji dla A. tumefaciens i po 18 godzinach dla S. meliloti. Zastosowane techniki opisano w kroku 7. Tabela została zmodyfikowana na podstawie pracy Matthysse, Deora, Mishra i Torres10.

Obrazy mikrostruktury komórkowej; analiza mikroskopowa włókien włosowych w skali 10 µm, pokazująca szczegóły strukturalne.
Rycina 3: Wpływ plazmidu pMM11 zawierającego geny biosyntezy PGA na wiązanie się A. tumefaciens A1045 oraz S. meliloti 1021 do włosków korzeni pomidora. Wiązanie z włoskami korzeni pomidora: A) A. tumefaciens A1045, B) A. tumefaciens A1045 pMM11, C) S. meliloti 1021 oraz D) S. meliloti 1021 pMM11. Chociaż wzrost wiązania obu gatunków bakterii jest mniej więcej podobny, szczegóły tego wiązania obserwowane w mikroskopie świetlnym są dość różne. Zastosowane techniki opisano w kroku 6. Obraz zmodyfikowano na podstawie pracy Matthysse, Deora, Mishra i Torres10. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego obrazu.

Czasami możliwe jest wykorzystanie wiązania do powierzchni niemieszczących się w kategorii biologicznych, aby ułatwić odróżnienie wkładu bakterii i rośliny w konkretną interakcję. Wykazano, że jednobiegunowy polisacharyd (UPP) A. tumefaciens może pośredniczyć w wiązaniu bakterii do różnorodnych powierzchni zarówno biologicznych, jak i niemieszczących się w kategorii biologicznych30. Obserwowano, że wapń hamuje wiązanie A. tumefaciens do powierzchni roślinnych za pośrednictwem UPP28. Aby określić, czy hamowanie wiązania bakterii do powierzchni roślinnych przez jony wapnia wynika ze skutku działania na bakterie czy na powierzchnię rośliny, zbadano wiązanie bakterii do nici nylonowych. Zastosowano techniki opisane w kroku 8.2. Nasiona pomidora poddano sterylizacji powierzchniowej i wykiełkowano w wodzie, jak opisano w kroku 1. Bakterie hodowano w pożywce minimalnej z sacharozą i dodano do korzeni pomidora lub nici nylonowych w końcowym stężeniu około 105/mL, jak opisano w kroku 5.1. Wpływ dodanego CaCl2 na wiązanie bakterii do korzeni pomidora i nici nylonowych obserwowano pod mikroskopem. Rycina 4 pokazuje podobne hamowanie wiązania przez wapń przy użyciu obu powierzchni, co sugeruje, że działanie wapnia dotyczy przede wszystkim bakterii10.

Obraz mikroskopowy strzępek grzybów, skala 10 µm, analiza strukturalna, badanie morfologii komórek.
Rycina 4: Wpływ wapnia na wiązanie się A. tumefaciens z włoskami korzeniowymi pomidora oraz nitkami poliamidowymi. A. tumefaciens hodowano z korzeniami pomidora (A i B) lub z nitkami poliamidowymi (C i D) przez 24 godziny w roztworze zawierającym sól MS rozcieńczoną 1:10 oraz minimalne medium AB rozcieńczone 1:20 z dodatkiem 0,4% sacharozy (A i C) albo w roztworze zawierającym sól MS rozcieńczoną 1:10 oraz minimalne medium AB rozcieńczone 1:20 z dodatkiem 0,4% sacharozy i 60 mM CaCl2 (B i D)31. Dodane CaCl2 hamowało wiązanie bakterii zarówno z korzeniami, jak i z nitkami poliamidowymi, co sugeruje, że inhibicja była przede wszystkim spowodowana wpływem na bakterie, a nie na powierzchnię rośliny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ważne jest, aby zdawać sobie sprawę ze wszystkich powierzchni, do których mogą przylegać bakterie podczas eksperymentu. W związku z tym bakterie, które są zdolne do wiązania się ze szkłem, mogą być niedoszacowane, jeśli liczenie żywotnych komórek odbywa się za pomocą szklanych probówek i pipet. Jeśli rośliny są uprawiane w agarze lub glebie, a część agaru lub gleby pozostaje na roślinach, bakterie mogą wiązać się z przylegającym materiałem, a nie z roślinami. Z drugiej strony, mycie powierzchni rośliny, szczególnie w przypadku korzeni, może usunąć naturalne powłoki powierzchniowe, takie jak śluz, a tym samym zmienić wyniki testów przylegania.

Ważne jest, aby mieć pewność, że bakterie dodane do mieszaniny inkubacyjnej pozostaną żywe podczas eksperymentu. W związku z tym należy rutynowo przeprowadzać zliczanie żywotnych komórek zarówno wolnych, jak i przyłączonych bakterii. Niektóre terapie lub mutacje bakteryjne mogą zmniejszać tempo wzrostu bakterii lub faktycznie powodować śmierć części populacji bakterii. Żywe i martwe bakterie mogą nie być rozróżnialne w mikroskopie, chyba że zostaną użyte specjalne barwniki. Istnieje przydatny zestaw barwników dla żywych/martwych bakterii, który zależy od wykluczenia barwników z żywych bakterii. Jeśli jednak obecna jest mieszana populacja gatunków bakterii, liczba żywotnych komórek gatunków będących przedmiotem zainteresowania będzie prawdopodobnie najłatwiejszą metodą określenia, czy inkubacja doprowadziła do śmierci bakterii.

Skład podłoża wpłynie na przetrwanie i wzrost bakterii. Wysięk korzeniowy i materiały uwolnione z ran i miejsc skaleczeń zapewnią podłoże do wspierania umiarkowanego wzrostu bakterii. Fosforany, azot i żelazo wydają się być ograniczające w tych warunkach. Kationy dwuwartościowe, takie jak wapń i magnez, mogą wpływać na adhezję. W niektórych przypadkach źródło węgla może wpływać na przyczepność. Znaczenie ma również pH. Ogólnie rzecz biorąc, pH ryzosfery wynosi od 5,5 do 6,5.

Należy zachować ostrożność w stosowaniu bakterii charakteryzujących się opornością na antybiotyki. Najczęściej stosowanymi antybiotykami są ryfampicyna i kwas nalidyksowy. Oporność na te antybiotyki jest na ogół spowodowana mutacjami w genach chromosomowych (odpowiednio polimeraza RNA i gyraza), a zatem nie może być łatwo przeniesiona na inny szczep podczas inkubacji. Ten rodzaj oporności nie powoduje również degradacji ani modyfikacji antybiotyku. Znakowanie bakterii markerem genowym plazmidowym nie jest zalecane, chyba że plazmid nie może zostać przeniesiony na żadną inną bakterię. Oporność na antybiotyki nie może być spowodowana degradacją lub modyfikacją chemiczną antybiotyku, ponieważ bakterie wrażliwe na antybiotyki będą mogły rozwijać się na płytkach z antybiotykiem, jeśli znajdą się w pobliżu opornych bakterii.

Metody opisane w tym artykule są przydatne w przypadku małych prób i/lub eksperymentów, w których próbki muszą być zawarte (na przykład eksperymenty z udziałem ludzkich patogenów). W przypadku dużych rozmiarów próbek (powyżej 100 g materiału lub więcej niż 50 roślin) potrzebne byłyby inne metody lub drastyczna modyfikacja tych metod 10,19,32,19,33,34,35,36. Obecność dużej liczby mikroorganizmów innych niż badane gatunki również może stwarzać poważne problemy. Możliwe rozwiązania obejmują wykorzystanie bakterii oznaczonych opornością na białka fluorescencyjne lub antybiotyki, jak opisano w krokach 6.1.2 i 7.3. Jednakże, gdy interesujące nas bakterie są rzadkimi osobnikami w dużej populacji innych mikroorganizmów, markery te mogą nie być wystarczające, aby umożliwić jednoznaczną ocenę liczby badanych bakterii.

Wszystkie opisane tutaj metody są metodami laboratoryjnymi. Do badań szklarniowych potrzebne byłyby drobne modyfikacje. Bardziej znaczące modyfikacje będą prawdopodobnie wymagane w przypadku badań terenowych, w których drapieżnictwo pierwotniaków, owadów i innych zwierząt oraz zmienność klimatu komplikują zapewnienie określonych warunków dla doświadczeń. W przyszłości metody te mogą zostać rozszerzone o interakcje dwóch lub więcej mikroorganizmów na powierzchni rośliny.

Oświadczenia

Autorka oświadcza, że nie ma konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autor dziękuje Susan Whitfield za przygotowanie figur oraz Camille Martin i Hillary Samagaio za pomoc przy niektórych eksperymentach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pomocny jest mikroskop świetlnydowolnykontrast fazowy N/A lub optyka Nomarski, do badań z użyciem markerów fluorescencyjnych wymagany jest mikroskop fluorescencyjny.
Nasiona dowolne Niezanotuj numer partii nasion i odmianę
wybielaczdowolnydo kąpieli N/A
dowolna firma zajmująca się zaopatrzeniem naukowymNie dotyczy
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
agar odżywczy Difco 001-01-8
sojtonDifco 24360
Piasekmorski Fisher ScientificS25
piasek  Uchwyty Sigma-AldrichS9887
Stuewe & Synowie, Inc.Szyszki Ray-Leachdostępnych jest wiele różnych rozmiarów, aby dopasować się do rodzaju rośliny, którą chcesz uprawiać
parafilmdowolna firma naukowa zajmująca się zaopatrzeniem/A
Sigma-AldrichM5524
dowolnaN/A
dowolna firma naukowaNiegranulowania większości bakterii tylko mała wirówka o maksymalnej sile 10 000 XG jest potrzebny
mieszalnik wirowydowolny mikrometr firmy
ACCU-SCOPE AkcesoriaA3145
Cela licząca krokwi SedgwickHauser ScientificHS3800
sonda-klips prasowo-uszczelniająca komora inkubatynowaSigma-AldrichZ359483
ryfampicynaSigma-AldrichR3501
kwas naladiksowySigma-Aldrichn8878
Żywa/martwa plamaBiosondy molekularne In VitrogenL7007
, dotyczy sonograf , Sole MS N Parrafina wirówka dotyczy do naukowej

Bibliografia

  1. Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. J. Appl. Microbiol. 104, 613-626 (2008).
  2. Beuchat, L. R. Ecological factors influencing survival and growth of human pathogens on raw fruit and vegetables. Microbes Infect. 4, 413-423 (2002).
  3. Berger, C. N., et al. Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens. Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).
  4. Lugtenberg, B. J., Chin, A. W. T., Bloemberg, G. V. Microbe-plant interactions: principles and mechanisms. Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 373-383 (2002).
  5. Preston, G. M., Haubold, B., Rainey, P. B. Bacterial genomics and adaptation to life on plants: implications for the evolution of pathogenicity and symbiosis. Curr. Opin. Microbiol. 1, 589-597 (1998).
  6. Compant, S., Duffy, B., Nowak, J., Clement, C., Barka, E. A. Use of Plant Growth-Promoting Bacteria for Biocontrol of Plant Diseases: Principles, Mechanisms of Action, and Future Prospects. Appl. Environ. Microbiol. 71, 4951-4959 (2005).
  7. Mathews, S. L., Smith, R. B., Matthysse, A. G. A comparison of the retention of pathogenic Escherichia coli. O157 by sprouts, leaves and fruits. Microb. Biotechnol. 7, 570-579 (2014).
  8. Fuqua, C., Matthysse, A. G. Methods for studying bacterial biofilms associated with plants. Methods Enzymol. 337, 3-18 (2001).
  9. Torres, A. G., Jeter, C., Langley, W., Matthysse, A. G. Differential binding of Escherchia coli.O157:H7 to alfalfa, human epithelial cells, and plastic is mediated by a variety of surface structures. Appl. Environ. Microbiol. 71, 8008-8015 (2005).
  10. Matthysse, A. G., Deora, R., Mishra, M., Torres, A. G. Polysaccharides cellulose, poly-beta-1,6-n-acetyl-D-glucosamine, and colanic acid are required for optimal binding of Escherichia coli O157:H7 strains to alfalfa sprouts and K-12 strains to plastic but not for binding to epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2384-2390 (2008).
  11. Matthysse, A. G., et al. The effect of cellulose overproduction on binding and biofilm formation on roots by Agrobacterium tumefaciens. Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1002-1010 (2005).
  12. Matthysse, A. G., Kijne, J. W. Attachment of Rhizobiaceae to plant cells. The Rhizobiaceae. Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. , Kluwer Academic Press. 235-249 (1998).
  13. Matthysse, A. G. Conditioned medium promotes the attachment of Agrobacterium tumefaciens.strain NT1 to carrot cells. Protoplasma. 183, 131-136 (1994).
  14. Matthysse, A. G., McMahan, S. The effect of the Agrobacterium tumefaciens. attR mutation on attachment and root colonization differs between legumes and other dicots. Appl. Environ. Microbiol. 67, 1070-1075 (2001).
  15. Jeter, C., Matthysse, A. G. Characterization of the binding of diarrheagenic strains of E. coli.to plant surfaces and the role of curli in the interaction of the bacteria with alfalfa sprouts. Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1235-1242 (2005).
  16. Matthysse, A. G., McMahan, S. Root colonization by Agrobacterium tumefaciens is reduced in cel, attB, attD, and attR mutants. Appl. Environ. Microbiol. 64, 2341-2345 (1998).
  17. Morton, E. R., Fuqua, C. Phenotypic analyses of Agrobacterium. Curr. Protoc. Microbiol. , Chapter 3 (2012).
  18. Brandl, M. T. Plant lesions promote the rapid multiplication of Escherichia coli O157:H7 on postharvest lettuce. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5285-5289 (2008).
  19. Franz, E., et al. Quantification of contamination of lettuce by GFP-expressing Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica serovar Typhimurium. Food Microbiol. 24, 106-112 (2007).
  20. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Curr. Protoc. Microbiol. , Chapter 1 (2012).
  21. Lugtenberg, B. J., Kravchenko, L. V., Simons, M. Tomato seed and root exudate sugars: composition, utilization by Pseudomonas biocontrol strains and role in rhizosphere colonization. Environ. Microbiol. 1, 439-446 (1999).
  22. Murashige, T., Skoog, F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum. 15, 473-497 (1962).
  23. Danhorn, T., Fuqua, C. Biofilm formation by plant-associated bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 61, 401-422 (2007).
  24. Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
  25. O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).
  26. Charkowski, A. O., Barak, J. D., Sarreal, C. Z., Mandrell, R. E. Differences in growth of Salmonella enterica and Escherichia coli O157:H7 on alfalfa sprouts. Appl. Environ. Microbiol. 68, 3114-3120 (2002).
  27. Loper, J., Suslow, T., Schroth, M. Lognormal distribution of bacterial populations in the rhizosphere. Phytopathology. 74, 1454-1460 (1984).
  28. Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front Plant Sci. 5, 252(2014).
  29. Douglas, C. J., Halperin, W., Nester, E. W. Agrobacterium tumefaciens mutants affected in attachment to plant cells. J. Bacteriol. 152, 1265-1275 (1982).
  30. Tomlinson, A. D., Fuqua, C. Mechanisms and regulation of polar surface attachment in Agrobacterium tumefaciens. Curr. Opin. Microbiol. 12, 708-714 (2009).
  31. Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front Plant Sci. 5, (2014).
  32. Wright, K. M., et al. The endophytic lifestyle of Escherichia coli O157:H7: quantification and internal localization in roots. Phytopathology. 103, 333-340 (2013).
  33. Berger, C. N., et al. Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens. Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).
  34. Erickson, M. C., et al. Internalization and Fate of Escherichia coli O157:H7 in Leafy Green Phyllosphere Tissue Using Various Spray Conditions. J. Food Prot. 77, 713-721 (2014).
  35. McKellar, R. C., et al. Evaluation of different approaches for modeling Escherichia coli O157:H7 survival on field lettuce. Int. J. Food Microbiol. 184, 75-85 (2014).
  36. Wu, F. M., et al. Factors influencing the detection and enumeration of Escherichia coli O157:H7 on alfalfa seeds. Int. J. Food Microbiol. 71, 93-99 (2001).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Wiązanie bakteriiobserwacja mikroskopowaliczenie żywych komórekprzygotowanie siewekmetoda wzrostu w piaskuprzygotowanie próbekobróbka sonikacyjnamutanty celulozoweprodukcja PGA
Przyleganie bakterii do powierzchni roślin mierzone w laboratorium
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.