Wykrywanie i usuwanie zanieczyszczeń nukleazami podczas oczyszczania rekombinowanej prototypowej integrazy wirusa pienistego

Podsumowanie

Rekombinowany prototyp pienistego białka integrazy wirusa jest często zanieczyszczony nukleazą bakteryjną podczas oczyszczania. Metoda ta identyfikuje zanieczyszczenie nukleazą i usuwa je z końcowego przygotowania enzymu.

Streszczenie

Białko integrazy (IN) prototypu wirusa piankowatego (PFV) retrowirusa jest modelowym enzymem do badania mechanizmu integracji retrowirusowej. W porównaniu do IN z innych retrowirusów, PFV IN jest bardziej rozpuszczalny i bardziej podatny na manipulację eksperymentalną. Ponadto jest wrażliwy na klinicznie istotne inhibitory ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV-1) IN, co sugeruje, że mechanizm katalityczny PFV IN jest podobny do mechanizmu HIV-1 IN. IN katalizuje kowalencyjne łączenie komplementarnego DNA wirusa (cDNA) z docelowym DNA w procesie zwanym transferem nici. Ta reakcja przenoszenia nici wprowadza nacięcia do docelowego DNA. Analiza produktów reakcji integracji może być zakłócona przez obecność nukleaz, które podobnie nacinają DNA. Wykazano, że nukleaza bakteryjna oczyszcza się jednocześnie z rekombinowanym PFV IN ulegającym ekspresji w Escherichia coli (E. coli). Tutaj opisujemy metodę izolowania PFV IN od zanieczyszczającej nukleazy za pomocą chromatografii powinowactwa heparyny. Frakcje można łatwo przebadać pod kątem zanieczyszczenia nukleazą za pomocą superskręconego plazmidu i elektroforezy w żelu agarozowym. PFV IN i zanieczyszczająca nukleaza wykazują alternatywne powinowactwo do sefarozy heparyny, co pozwala na beznukleazowe przygotowanie rekombinowanego PFV IN, odpowiedniego do masowej analizy biochemicznej lub integracji pojedynczych cząsteczek.

Wprowadzenie

Badania biochemiczne i jednocząsteczkowe interakcji białek z DNA wymagają wyjątkowo czystych białek rekombinowanych. Zanieczyszczenie nukleaz przez bakterie może zaciemnić wyniki tych testów. Skażający nukleazę znaleziono w preparatach rekombinowanych białek, protokatechuaty-3,4-dioksygenazy wymiatającej tlen (PCD) i prototypowej integrazy (IN) wirusa piankowatego (PFV) wyizolowanej z Escherichia coli (E. coli)^1,2,3.

Testy integracji retrowirusowej polegają na konwersji superskręconego DNA na produkty nacięte lub liniowe jako miarę aktywności IN⁴. Podczas infekcji komórkowej IN łączy dwa końce wirusowego cDNA z chromatyną gospodarza⁵. Każda reakcja łączenia końców nazywana jest przenoszeniem nici. Testy aktywności rekombinowanego IN mogą łączyć dwa oligomery DNA naśladujące końcówki cDNA wirusa do docelowego DNA w skoordynowanej reakcji integracji^4,5,6,7,8. Alternatywnie, rekombinowany IN może łączyć tylko jeden koniec DNA w niefizjologicznie istotnej reakcji integracji połowy miejsca^9,10. Gdy celem integracji jest superskręcone plazmidowe DNA, skoordynowane produkty integracji są linearyzowanym DNA, a produkty integracji połowy miejsca są zrelaksowanymi kręgami. Te produkty reakcji są identyfikowane na podstawie ich względnej ruchliwości podczas elektroforezy w żelu agarozowym¹. Jeśli rekombinowany IN ma zanieczyszczającą nukleazę, pojawią się fałszywe rozluźnione kręgi lub prawdopodobnie zlinearyzowany plazmid, który myli wyniki eksperymentalne. Oligomery wirusowego DNA mogą być znakowane fluorescencyjnie w celu jednoznacznej identyfikacji produktów integracji, w przeciwieństwie do produktów nukleazy. Jednak IN bardzo faworyzuje cele superskręconego DNA; jakakolwiek utrata superskręconego plazmidu do zrelaksowanych okręgów lub liniowego DNA przez zanieczyszczenie nukleazy może zniekształcić wyniki i interpretację danych¹¹. Dlatego konieczne jest usunięcie nukleaz bakteryjnych z retrowirusowych preparatów IN.

PFV IN ma inne powinowactwo do sefarozy heparyny w porównaniu do nukleazy bakteryjnej¹. PFV IN i nukleazę można oddzielić przez elucję o liniowym gradiencie od sefarozy heparyny. Nukleaza nie jest łatwo wykrywana przez absorbancję ultrafioletu (UV) przy piku 280 nm lub przez analityczną elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE). Zamiast tego nukleaza jest wykrywana przez test aktywności nukleazy wykorzystujący konwersję superskręconego plazmidu do zrelaksowanych okręgów lub produktów liniowych. Każda frakcja po chromatografii sefarozy heparyny jest badana pod kątem aktywności nukleazy. PFV IN i zanieczyszczenie nukleazą nie mają różnicy w powinowactwie do żywicy anionowej Mono-Q. Istnieje niewielka różnica w powinowactwie do żywicy kationowej Mono-S. Jednak rozdzielczość Mono-S nukleazy bakteryjnej i PFV IN nie pozwoliłaby na skuteczną separację białek. Ostatecznie, oczyszczanie powinowactwa sefarozy heparyny zapewnia najlepszą separację nukleazy bakteryjnej od PFV IN i ma tę zaletę, że ma nieograniczoną objętość ładunku.

Testy na aktywność nukleazy mogą być dostosowane do innych białek. Białko będące przedmiotem zainteresowania będzie prawdopodobnie miało alternatywne charakterystyki powinowactwa niż PFV IN; Różnica w charakterystyce wiązania białka będącego przedmiotem zainteresowania i zanieczyszczenia nukleazą musi być określona empirycznie. Ta metodologia identyfikacji zanieczyszczenia nukleazami może być dostosowana do innych żywic, w tym żywic kationowych Mono-S lub żywic anionowymiennych Mono-Q. Żywice powinowactwa i wymiany jonowej mogą stanowić niezawodną metodę izolowania rekombinowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania od zanieczyszczających nukleaz bez ograniczeń dotyczących objętości białka podczas chromatografii.

Protokół

1. Indukuj ekspresję PFV IN u E. coli

1. Dodaj 1 μl plazmidu ekspresyjnego PFV IN (10 ng / μL) do 20 μl E. coli BL21 (DE3) pLysS (20 μl podwielokrotność dostępnych na rynku komórek ma >2 x 10⁶ CFU / μg plazmidu) w probówce 1,5 ml. Delikatnie wymieszaj, stukając palcem lub przesuwając tubkę. Inkubować na lodzie 5 min.
   1. Szok cieplny dokładnie przez 30 s w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C, a następnie natychmiastowy powrót do lodu na 2 minuty.
   2. Dodaj 80 μl super optymalnego bulionu o temperaturze pokojowej z pożywką do tłumienia katabolitu (SOC). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 225 obrotach na minutę (obr./min).
   3. Płytka 25 μl mieszaniny na szalce Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm zawierająca 25 ml agaru Luria bulionu (LB) (1 l agaru LB: 10 g bakto-tryptonu, 10 g NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego, 15 g agaru) i 100 μg/ml ampicyliny (100 mg/ml roztworu podstawowego).
   4. Pozostałe 75 μl przekształconych komórek należy umieścić na drugiej identycznej płytce. Inkubować płytki z opuszczonymi pokrywkami przez noc w temperaturze 37 °C.
2. Pobrać płytki z przekształconą bakterią E. coli. Użyj pojedynczej kolonii do zaszczepienia 3 ml LB (1 l LB: 10 g bakto-tryptonu, 10 g NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego) uzupełnionych 100 μg/ml ampicyliny w 14-mililitrowej probówce do hodowli polipropylenu z okrągłym dnem. Inkubować przez ~8 h w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem 225 obr./min.
   1. Dodać 3 ml kultury do 50 ml LB uzupełnionej 100 μg/ml ampicyliny i 34 μg/ml chloramfenikolu (34 mg/ml roztworu podstawowego) do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Inkubować kulturę przez noc w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 225 obr./min.
   2. Przenieść 53 ml kultury do 1 l LB, 100 μg/ml ampicyliny i 34 μg/ml chloramfenikolu w 4 l kolbie Erlenmeyera. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem 225 obr./min.
   3. Okresowo mierzyć gęstość optyczną kultury przy długości fali zewnętrznej 600 nm (OD₆₀₀). Początkowo sprawdzaj kulturę OD₆₀₀ co godzinę. Gdy kultura osiągnie pożądany OD₆₀₀, sprawdzaj co 15 minut, aby nie zarosnąć. Rozwijaj kulturę do OD₆₀₀ między 0,9 a 1,0. Przenieść kolbę do łaźni lodowej i zawirować, aby obniżyć temperaturę kultury.
3. Przenieś 1 ml kultury do probówki o pojemności 1,5 ml w celu późniejszej analizy poprzez denaturację analizy SDS-PAGE.
   1. Granulować komórki w probówce o pojemności 1,5 ml przez wirowanie przez 1 minutę w mikrofugach o sile 14 000 x g w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 150 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez pipetowanie. PBS może być z CaCl₂ i MgCl₂ lub bez nich.
   2. Dodać 150 μl 2x bufor do próbek SDS-PAGE (150 mM Tris-HCl, pH 6,8, 1,2% SDS, 30% glicerol, 15% β-merkaptoetanol (βME), 0,0018% błękit bromofenolowy) i dokładnie wymieszać pipetą lub wirem. Gotować przez 3 minuty. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. Do hodowli bakteryjnej dodać końcowe stężenie 0,25 mM izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG, 0,25 M roztwór podstawowy) i 50 μM ZnCl₂ (50 mM roztwór podstawowy). IPTG indukuje ekspresję genu PFV IN z promotora T7, a ZnCl₂ jest dodawany jako suplement do prawidłowego fałdowania aminokońcowej domeny palca cynkowego w PFV IN. Inkubować kulturę w temperaturze 25 °C, wytrząsając przy 225 obr./min przez 4 godziny. Natychmiast przenieść kolbę do łaźni lodowej. Zaoszczędź 1 ml kultury do analizy SDS-PAGE zgodnie z tym samym protokołem, co powyżej w 1.3.
5. Przenieś kulturę bakteryjną do butelek wirówkowych o odpowiedniej wielkości. Na przykład kulturę o pojemności 1 l można przenieść do czterech sterylnych jednorazowych butelek polipropylenowych o pojemności 250 ml ze stożkowym dnem. Wirować butelki w wirówce stołowej z chłodzeniem o sile 3000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odlać supernatanty przez nalanie.
   1. Zawiesić wszystkie granulki z 1 l kultury bakteryjnej w całkowitej objętości 25 ml (6,25 ml na butelkę) zimnego PBS (z lub bez CaCl₂ i MgCl₂) przez pipetowanie. Połączyć i przenieść zawiesiny bakteryjne do jednej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować w wirówce z chłodzeniem przy 3 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant przez nalewanie lub pipetowanie.
6. Zawiesić osad bakteryjny w 10 ml buforu do sporządzania zawiesiny (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl i inhibitor proteazy 500 μM fenylometylosulfanu (PMSF)) przez pipetowanie. Zatrzaskowo zamroź osad, umieszczając probówkę w kolbie Dewara z ciekłym azotem wystarczającym do zanurzenia probówki o pojemności 50 ml. Ostrożnie wyjąć probówkę z ciekłego azotu i przechowywać w temperaturze -80 °C.
   Uwaga: Granulki bakteryjne mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w temperaturze -80 °C. Nie zaobserwowaliśmy utraty aktywnego białka po przechowywaniu w temperaturze -80 °C przez dwa lata.
7. Analizuj próbki przed indukcją i po indukcji dla żeli SDS-PAGE o szerokości 8,3 cm, wysokości 7,3 cm i grubości 0,75 mm z 1,5 ml 6% poliakryloamidu (125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 6% akrylamidu, 0,1% SDS, 0,1% nadsiarczanu amonu, 0,001% TEMED) i 3,5 ml 10% warstwy rozdzielczej poliakrylamidu (375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10% akrylamidu, 0,1% SDS, 0,1% nadsiarczanu amonu, 0,001% TEMED)¹².
   1. Po nalaniu żelu do układania w stos włóż grzebień z 10 dołkami. Gdy żel spolimeryzuje, zmontuj aparat PAGE i dodaj wystarczającą ilość buforu do biegania SDS-PAGE (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 0,1% SDS).
   2. Załadować 10 μl każdej próbki i 4 μl wstępnie wybarwionych wzorców białkowych. Biegać z napięciem 16,5 V/cm, aż czoło barwnika dotrze do dna żelu, około 60 minut.
   3. Zdemontuj płytki żelowe i przenieś żel do plastikowej wanny. Dodaj roztwór barwiący Coomassie Brilliant Blue (0,1% błękitu brylantowego Coomassie R-250, 40% metanolu, 10% kwasu octowego), aby obficie pokryć żel i barwić przez 20 minut w temperaturze otoczenia.
   4. Usuń roztwór barwiący, wlewając go i zastąp roztworem odbarwiającym (40% metanolu, 10% kwasu octowego), aż pasma będą łatwo widoczne. Usuń roztwór odbarwiający, wlewając go i zastąp wodą dejonizowaną. PFV IN powinien być łatwo zidentyfikowany w próbce po indukcji. PFV IN ze znacznikiem heksahistydyny ma masę cząsteczkową 47374 Da.
   5. Jeśli PFV IN nie jest widoczny, powtórz indukcję, zaczynając od innej kolonii z jednej z płytek transformacyjnych.

2. Chromatografia powinowactwa do niklu

1. Rozmrozić jedną osadkę bakteryjną na lodzie.
   Uwaga: Zajmie to dużo czasu (około 2 - 3 godzin). Gdy osad rozmrozi się do zawiesiny komórkowej, dodaj dodatkowe 500 μM PMSF (100 mM roztworu podstawowego).
2. Probówkę o pojemności 50 ml z zawiesiną bakteryjną należy przechowywać na lodzie. Sonikuj bakterie przy amplitudzie 30% przez 30 s (1 s wł., 1 s wyłącz) na osad pochodzący z 1 l kultury za pomocą sonikatora z biotubą o średnicy 0,5 cala ze stożkową mikrokońcówką o średnicy 0,125 cala, częstotliwości 20 kHz i maksymalnej mocy 400 W.
3. Przenieść próbkę komórki do zimnej probówki ultrawirówkowej. Używaj zestawów butelek z poliwęglanu (średnica 25 mm, wysokość 89 mm) kompatybilnych z wirnikiem o stałym kącie nachylenia typu 60 Ti. Można stosować alternatywne rury i wirniki, jeśli osiągana jest ta sama siła grawitacji. Wirować 120 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C. Powinna być oczywista kulka. Supernatant może mieć barwę żółtą.
4. Przenieść supernatant przez nalewanie lub pipetowanie do zimnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Zwróć uwagę na głośność; Objętość ta powinna być w przybliżeniu równa objętości bufora do sporządzania zawiesiny użytej przed zamrożeniem błyskawicznym. Jeśli supernatant jest lepki, może być zanieczyszczony bakteryjnym DNA, które może zatkać kolumnę chromatograficzną. W takim przypadku powtórz ultrawirowanie, aby osadzać DNA bakterii.
5. Przygotuj 500 ml buforu A (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) i 500 ml buforu B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM imidazolu).
   Uwaga: Zgodnie z tym protokołem system szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC), wszystkie i próbkę należy przechowywać w temperaturze 4 °C w chłodni.
   1. Sterylne filtracyjne A i B z jednorazowymi jednostkami filtrującymi 0,2 μm. W zależności od systemu FPLC umyj pompę A i pompę B odpowiednio z buforem A i buforem B. Przepuść 90% buforu A i 10% buforu B przez system, aż ustabilizują się odczyty przewodności i UV. Maksymalne natężenie przepływu będzie zależeć od instrumentu; stosować natężenie przepływu 5 ml/min przy maksymalnym ciśnieniu granicznym 1,0 MPa.
6. Przygotować kolumnę FPLC o długości 110 mm i średnicy 5 mm z 1,5 ml żywicy naładowanej niklem (maksymalna zdolność wiązania 50 mg/ml, maksymalne ciśnienie 1 MPa). Kolumna może być przygotowana dzień przed oczyszczeniem i przechowywana w temperaturze 4 °C.
7. Podłącz kolumnę do przyrządu FPLC. Zrównoważyć kolumnę z 20 ml 90% buforu A i 10% buforu B (20 mM imidazolu) przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min przy maksymalnym ciśnieniu granicznym 0,5 MPa. Przyrząd powinien zbierać w czasie rzeczywistym dane dotyczące przewodności i absorbancji UV przy 280 nm (A₂₈₀). Odczyty przewodności i UV powinny się ustabilizować. Jeśli te odczyty nie ustabilizowały się, kontynuuj przepływ przez kolumnę, aż będą stabilne.
8. Załaduj próbkę białka (~10 ml na granulkę) do kolumny z natężeniem przepływu 0,15 ml/min przy maksymalnym ciśnieniu granicznym 0,5 MPa. Natężenie przepływu i ciśnienie w kolumnie pozostają takie same przez cały czas oczyszczania. Zebrać przepływ w probówce o pojemności 50 ml.
   1. Przemyć kolumnę 20 ml 90% buforu A i 10% buforu B. Zebrać płukanie w probówce o pojemności 50 ml. Eluować białka za pomocą 20 ml gradientu liniowego od 10% do 100% buforu B (20 mM do 200 mM imidazolu).
   2. Na koniec przemyć kolumnę 5 ml 100% buforu B (200 mM imidazolu). Zbierz gradient i końcowe pranie we frakcjach 0,27 ml.
9. Połączyć 15 μl buforu próbki 2x SDS-PAGE z 15 μl frakcji przepływu, przemywania i piku A₂₈₀. Gotuj próbki przez 3 minuty.
   1. Przygotuj dwa 10% żele SDS-PAGE, jak opisano wcześniej w kroku 1.6, z wyjątkiem 15 grzebieni studzienkowych. Załadować 10 μl każdej próbki do żeli i 4 μl wstępnie wybarwionych wzorców białkowych. Uruchom, wybarwij i przeanalizuj żele zgodnie z opisem w kroku 1.6.
   2. Połącz frakcje, które wydają się zawierać prawie czysty PFV IN na podstawie oględzin. Odmierz objętość przez pipetowanie, zwykle 8 - 10 ml.
   3. Za pomocą spektrofotometru zmierz A₂₈₀ połączonych frakcji i oblicz całkowitą ilość białka PFV IN; nasza typowa wydajność to ~ 10 mg na L indukowanej hodowli. Współczynnik ekstynkcji PFV IN ze znacznikiem heksahistydyny wynosi 59360 ^{cm-1 M-1}.
10. Aby usunąć znacznik heksahistydyny, należy uzupełnić PFV IN 10 mM ditiotreitolem (DTT, 1 M roztwór podstawowy) i 0,1 mM EDTA, pH 8,0 (0,5 M roztwór podstawowy). Dodać 15 μg proteazy 3C ludzkiego rinowirusa (HRV) na mg PFV IN. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Rozszczepienie zmniejsza masę cząsteczkową PFV IN z 47374 Da do 44394 Da i może być zweryfikowane przez 10% analizę SDS-PAGE.

3. Chromatografia powinowactwa heparyny

1. Przygotuj 250 ml buforu C (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF) i 250 ml buforu D (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl).
   Uwaga: W tym protokole system FPLC, i próbka są przechowywane w chłodni w temperaturze 4 °C.
   1. Sterylne filtracyjne C i D z jednorazowymi jednostkami filtrującymi 0,2 μm. W zależności od systemu FPLC umyć pompę A i pompę B odpowiednio buforem C i buforem D. Przepuść 80% buforu C i 20% buforu D przez system, aż odczyty przewodności i UV ustabilizują się. Maksymalne natężenie przepływu będzie zależeć od instrumentu; rutynowo stosujemy natężenie przepływu 5 ml/min z maksymalnym limitem ciśnienia 1,0 MPa.
2. Przygotować kolumnę FPLC o długości 80 mm i średnicy 5 mm z 1 ml heparynowej żywicy sefarozowej (maksymalna zdolność wiązania 2,0 mg bydlęcej antytrombiny III na ml żywicy; maksymalne ciśnienie 1,4 MPa). Kolumnę można przygotować dzień przed oczyszczaniem i przechowywać w temperaturze 4 °C. Podłączyć kolumnę do przyrządu FPLC.
   1. Zrównoważyć kolumnę z 20 ml 80% buforu C i 20% buforu D (200 mM NaCl) przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min przy maksymalnym ciśnieniu granicznym 1 MPa. Przyrząd powinien zbierać w czasie rzeczywistym dane dotyczące przewodności i absorbancji UV przy 280 nm (A₂₈₀). Odczyty przewodności i UV powinny się ustabilizować. Jeśli te odczyty nie ustabilizowały się, kontynuuj przepływ przez kolumnę, aż będą stabilne.
3. Zmniejszyć stężenie NaCl w próbce PFV IN do 200 mM, dodając 1,5 objętości buforu C. Na przykład dodaj 15 ml buforu C do 10 ml PFV IN. Nasza całkowita objętość to zazwyczaj ~25 mL.
4. Załadować rozcieńczoną próbkę PFV IN do kolumny sefarozy heparyny przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min przy maksymalnym ciśnieniu granicznym 1,0 MPa. Natężenie przepływu i ciśnienie w kolumnie pozostają takie same przez cały czas oczyszczania. Zebrać przepływ w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
   1. Przemyć kolumnę 20 ml 80% buforu C i 20% buforu D (200 mM NaCl), zbierając popłuczynę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Eluować kolumnę za pomocą 30 ml gradientu liniowego od 20% do 100% buforu D (200 mM do 1 M NaCl).
   2. Przemyć kolumnę 5 ml 100% buforu D. Zebrać gradient i końcowe płukanie we frakcjach 0,37 ml.
5. Analizuj obciążenie, przepływ, mycie i frakcje o 8% SDS-PAGE zgodnie z opisem w 2.9. PFV IN po rozszczepieniu znacznika heksahistydyny ma masę cząsteczkową 44394 Da, a współczynnik ekstynkcji pozostaje 59360 ^{cm-1 M-1} bez znacznika heksahistydyny. Przechowywać wszystkie frakcje w temperaturze 4 °C do czasu zakończenia testu nukleazy.

4. Test nukleazy

1. Zidentyfikuj frakcje sefarozy heparyny, które wydają się zawierać prawie czysty PFV IN. Połączyć 3 μl frakcji heparyny i 50 ng 3 kb superskręconego plazmidowego DNA w buforze reakcyjnym (10 mM HEPES, pH 7,5, 110 mM NaCl, 5 mM_MgSO4, 4 μM ZnCl₂, 10 mM DTT) z końcową objętością 15 μL. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 min. Uwzględnij kontrolę ujemną bez PFV IN.
   1. Zatrzymać reakcję za pomocą 1 mg/ml proteinazy K (20 mg/ml roztworu podstawowego) i 0,5% SDS (10% roztworu podstawowego). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do późniejszej analizy.
2. Przygotować 125 ml żelu agarozy o zawartości 1% wagowo-objętościowej (w/v) w 1x bufor TAE (40 mM tris-acetat, 1 mM EDTA) z 0,1 μg/ml bromku etydyny (10 mg/ml roztworu podstawowego)¹³. Rozpuść roztwór agarozy i wlej do tacki do odlewania żelu o wymiarach 15 cm x 10 cm. Włóż grzebień z 15 dołkami z dołkami o szerokości 5 mm i grubości 0,75 mm. Cienkie studzienki zapewniają lepszą rozdzielczość pasma w porównaniu do studzienek o grubości 1,5 mm. Pozwól żelowi zestalić się w temperaturze otoczenia.
   1. Zanurz żel w 1x TAE z 0,1 μg/ml bromku etydyny. Dodaj 3,5 μl 6-krotnego barwnika ładującego (50% glicerolu, 0,15% barwnika pomarańczowego G) do reakcji testu nukleazy. Załaduj całą objętość do żelu. Uruchom żel przy stałym napięciu, 10 woltów na cm (100 V) w temperaturze otoczenia przez 1 godzinę lub do momentu, gdy czoło barwnika Orange G dotrze do końca żelu.
3. Natychmiast zobrazuj żel agarozowy za pomocą skanera fluorescencyjnego ustawionego na wykrywanie bromku etydyny. Liniowe DNA powinno działać zgodnie z rozmiarem 3 kb, superskręcone DNA powinno działać szybciej (~2 kb), a zrelaksowane okrągłe DNA powinno działać wolniej (~3,5 kb).
   1. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, oblicz objętość pikseli superskręconego, liniowego i zrelaksowanego plazmidu kołowego na każdym pasie. Wywołaj sumę objętości pikseli dla tych trzech form DNA wartością "całkowitego DNA" i użyj jej do obliczenia procentu okręgów liniowych i zrelaksowanych. Na przykład objętość pikseli zrelaksowanych okręgów dzieli się przez całkowitą wartość piksela DNA na tym pasie, pomnóż tę liczbę przez 100, aby określić procent. Frakcje zawierające zanieczyszczającą nukleazę wykazują wyższy procent okręgów liniowych i zrelaksowanych w porównaniu z kontrolą negatywną.
4. Połącz frakcje sefarozy heparyny, które nie wykazują zanieczyszczającej aktywności nukleazy. Dializować w rurkach dializacyjnych o masie cząsteczkowej 10 mm 6 - 8 kDa (MWCO) w temperaturze 4 °C przez noc w stosunku do 1 l 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 50 μM ZnCl₂, 10 mM DTT, 20% glicerolu.
5. Odzyskaj wolną od nukleaz próbkę PFV IN z rurki dializowej. Zmierzyć A₂₈₀ i obliczyć końcowe stężenie białka. Podwielokrotność i szybkie zamrożenie w ciekłym azocie. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.

Wyniki

Rekombinowana integraza PFV (PFV IN) jest często zanieczyszczona nukleazą bakteryjną¹. Biochemiczne testy integracji opierają się na ilościowym oznaczeniu konwersji superkolowanego DNA plazmidowego w koliste formy zrelaksowane oraz produkty liniowe. Obecność zanieczyszczającej nukleazy może prowadzić do błędnych wyników ilościowych w tych testach. Ekspresja PFV IN z tagiem heksahistydynowym jest indukowana w E. coli (Rycina 1) i wstępnie oczyszczana za pomocą...

Dyskusja

Rekombinowane białka, które oddziałują z DNA, takie jak białka naprawcze DNA, zmiatacze tlenu do zastosowań w mikroskopii jednocząsteczkowej lub integrazy retrowirusowe, powinny być wolne od zanieczyszczających nukleaz bakteryjnych ^2,3. Zanieczyszczenia te mogą zmylić interpretację wyników podczas masowych testów biochemicznych lub jednocząsteczkowych.

Odkryliśmy, że nukleaza bakteryjna często oczyszcza się z PFV IN. Jednak PFV IN wyka...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BL21/DE3 Rosetta E. coli	EMD Millipore	70956-4
LB bulion	EMD biosciences	1.10285.0500
Ampicylina	Amresco	0339
Chloramfenikol	Amresco	0230
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
IPTG	Denville Scientific	CI8280
ZnCl2	Sigma-Aldrich	208086
Tris Ultra Pure	Gojira Fine Chemicals	UTS1003
NaCl	P212121	RP-S23020
PMSF	Amresco	0754
Imidazol	Sigma-Aldrich	I0250
DTT	P212121	SV-DTT
UltraPure EDTA	Invitrogen/Gibco	15575
MgSO4	Amresco	0662
Agaroza	Denville Scientific	CA3510
Bromek etydyny	Thermo Fisher Scientific	BP1302
Glicerol	Fisher Scientific	G37-20
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Heparyna Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0998-01
HRV14 Proteaza 3C	Chemikalia EMD	71493-3