Rekombinowany prototyp pienistego białka integrazy wirusa jest często zanieczyszczony nukleazą bakteryjną podczas oczyszczania. Metoda ta identyfikuje zanieczyszczenie nukleazą i usuwa je z końcowego przygotowania enzymu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie i usuwanie zanieczyszczeń nukleazami podczas oczyszczania rekombinowanej prototypowej integrazy wirusa pienistego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Białko integrazy (IN) prototypu wirusa piankowatego (PFV) retrowirusa jest modelowym enzymem do badania mechanizmu integracji retrowirusowej. W porównaniu do IN z innych retrowirusów, PFV IN jest bardziej rozpuszczalny i bardziej podatny na manipulację eksperymentalną. Ponadto jest wrażliwy na klinicznie istotne inhibitory ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV-1) IN, co sugeruje, że mechanizm katalityczny PFV IN jest podobny do mechanizmu HIV-1 IN. IN katalizuje kowalencyjne łączenie komplementarnego DNA wirusa (cDNA) z docelowym DNA w procesie zwanym transferem nici. Ta reakcja przenoszenia nici wprowadza nacięcia do docelowego DNA. Analiza produktów reakcji integracji może być zakłócona przez obecność nukleaz, które podobnie nacinają DNA. Wykazano, że nukleaza bakteryjna oczyszcza się jednocześnie z rekombinowanym PFV IN ulegającym ekspresji w Escherichia coli (E. coli). Tutaj opisujemy metodę izolowania PFV IN od zanieczyszczającej nukleazy za pomocą chromatografii powinowactwa heparyny. Frakcje można łatwo przebadać pod kątem zanieczyszczenia nukleazą za pomocą superskręconego plazmidu i elektroforezy w żelu agarozowym. PFV IN i zanieczyszczająca nukleaza wykazują alternatywne powinowactwo do sefarozy heparyny, co pozwala na beznukleazowe przygotowanie rekombinowanego PFV IN, odpowiedniego do masowej analizy biochemicznej lub integracji pojedynczych cząsteczek.
Wprowadzenie
Badania biochemiczne i jednocząsteczkowe interakcji białek z DNA wymagają wyjątkowo czystych białek rekombinowanych. Zanieczyszczenie nukleaz przez bakterie może zaciemnić wyniki tych testów. Skażający nukleazę znaleziono w preparatach rekombinowanych białek, protokatechuaty-3,4-dioksygenazy wymiatającej tlen (PCD) i prototypowej integrazy (IN) wirusa piankowatego (PFV) wyizolowanej z Escherichia coli (E. coli)1,2,3.
Testy integracji retrowirusowej polegają na konwersji superskręconego DNA na produkty nacięte lub liniowe jako miar....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Indukuj ekspresję PFV IN u E. coli
- Dodaj 1 μl plazmidu ekspresyjnego PFV IN (10 ng / μL) do 20 μl E. coli BL21 (DE3) pLysS (20 μl podwielokrotność dostępnych na rynku komórek ma >2 x 106 CFU / μg plazmidu) w probówce 1,5 ml. Delikatnie wymieszaj, stukając palcem lub przesuwając tubkę. Inkubować na lodzie 5 min.
- Szok cieplny dokładnie przez 30 s w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C, a następnie natychmiastowy powrót do lodu na 2 minuty.
- Dodaj 80 μl super optymalnego bulionu o temperaturze pokojowej z pożywką do tłumienia katabolitu (SOC). Inkubować przez 1 godzinę w temp....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rekombinowana integraza PFV (PFV IN) jest często zanieczyszczona nukleazą bakteryjną1. Biochemiczne testy integracji opierają się na ilościowym oznaczeniu konwersji superkolowanego DNA plazmidowego w koliste formy zrelaksowane oraz produkty liniowe. Obecność zanieczyszczającej nukleazy może prowadzić do błędnych wyników ilościowych w tych testach. Ekspresja PFV IN z tagiem heksahistydynowym jest indukowana w E. coli (Rycina 1) i wstępnie oczyszczana za pomocą.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Rekombinowane białka, które oddziałują z DNA, takie jak białka naprawcze DNA, zmiatacze tlenu do zastosowań w mikroskopii jednocząsteczkowej lub integrazy retrowirusowe, powinny być wolne od zanieczyszczających nukleaz bakteryjnych 2,3. Zanieczyszczenia te mogą zmylić interpretację wyników podczas masowych testów biochemicznych lub jednocząsteczkowych.
Odkryliśmy, że nukleaza bakteryjna często oczyszcza się z PFV IN. Jednak PFV IN wyka.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez NIH AI099854 i AI126742 do KEY.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| BL21/DE3 Rosetta E. coli | EMD Millipore | 70956-4 | |
| LB bulion | EMD biosciences | 1.10285.0500 | |
| Ampicylina | Amresco | 0339 | |
| Chloramfenikol | Amresco | 0230 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| IPTG | Denville Scientific | CI8280 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| PMSF | Amresco | 0754 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I0250 | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Agaroza | Denville Scientific | CA3510 | |
| Bromek etydyny | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glicerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Heparyna Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0998-01 | |
| HRV14 Proteaza 3C | Chemikalia EMD | 71493-3 |
Bibliografia
- Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
