Artykuł metodologiczny

Metodologia indukcji plwociny i przetwarzania laboratoryjnego

30.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56612

⸱

17 grudnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Respiratory Medicine, CHU Liege, GIGA I3 Research Group, University of Liege, 2Department of Clinical Pharmacy, CIRM (Center for Interdisciplinary Research on Medicines), University of Liege

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy technikę indukcji plwociny. Protokół ten wyjaśnia również przetwarzanie plwociny w celu przeprowadzenia różnicowej liczby komórek oraz pobrania supernatantu plwociny i komórek do dalszej analizy.

Streszczenie

Technika indukcji i przetwarzania plwociny jest uznaną nieinwazyjną metodą pozwalającą na pobieranie i analizę komórek z dróg oddechowych, co jest interesujące w różnych chorobach układu oddechowego, takich jak astma, przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), przewlekły kaszel lub idiopatyczne zwłóknienie płuc. Technika ta jest dobrze tolerowana, bezpieczna i nieinwazyjna, ale obecnie ogranicza się do usług badawczych i specjalistycznych ośrodków w praktyce klinicznej, ponieważ jest wymagająca technicznie, czasochłonna i wymaga przeszkolonego personelu. Wskaźnik powodzenia indukcji i analizy plwociny wynosi około 80%.

Tutaj opisujemy indukcję i laboratoryjne przetwarzanie próbek plwociny. Plwocina jest indukowana przez wdychanie hipertonicznego lub izotonicznego roztworu soli fizjologicznej z salbutamolem. Do przetwarzania używamy całej techniki plwociny. Ditiotreitol (DTT) jest stosowany w celu umożliwienia mukolizy próbek plwociny. Podstawowym celem przetwarzania plwociny jest uzyskanie różnicowej liczby komórek w celu zbadania typów komórek obecnych w świetle dróg oddechowych. Dodatkowe analizy mogą być również wykonywane na supernatance plwociny i komórkach plwociny, co może pozwolić na dalsze badania nad procesami zapalnymi i mechanizmami immunologicznymi. Przykłady obejmują badanie mediatorów w supernatancie plwociny i przeprowadzanie szerokiego spektrum analiz na komórkach plwociny, takich jak cytometria przepływowa, genomika lub proteomika.

Na koniec, przedstawiono reprezentatywne wyniki analizy plwociny u zdrowych osób z grupy kontrolnej, astmatyków i pacjentów z POChP.

Wprowadzenie

Do badania zapalenia dróg oddechowych stosuje się kilka metod: bezpośrednie pomiary (takie jak biopsje oskrzeli lub płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe) i pośrednie metody (takie jak ocena objawów, analiza próbki krwi i testy czynności płuc)1. Techniki bezpośrednie mają tę zaletę, że wiarygodnie oceniają stan zapalny dróg oddechowych, ale są inwazyjne i niewykonalne na dużą skalę ze względu na dyskomfort pacjenta i ponoszone ryzyko1. Jeśli chodzi o metody pośrednie, to słabo korelują one z bezpośrednią oceną stanu zapalnego dróg oddechowych1.

Pobieranie plwociny to kolejny sposób pobierania próbek komórek z dróg oddechowych i pozwala na bezpośrednią ocenę stanu zapalnego dróg oddechowych. Niemniej jednak, spontaniczne wytwarzanie plwociny może prowadzić do próbek o niskiej jakości i nie jest możliwe dla wszystkich pacjentów2. Problem ten został rozwiązany dzięki zastosowaniu ultradźwiękowo nebulizowanej hipertonicznej soli fizjologicznej do indukowania produkcji plwociny2. Metoda ta była początkowo stosowana u pacjentów zakażonych ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV) w diagnostyce zapalenia płuc wywołanego przez Pneumocystis carinii 3 i została dostosowana dla zdrowych ochotników i astmatyków w 1992 roku4. Indukcja plwociny jest również możliwa u pacjentów w cięższym stanie przy użyciu izotonicznego soli fizjologicznej5. Chociaż na ogół jest dobrze tolerowany, wdychanie soli fizjologicznej może powodować skurcz oskrzeli u pacjentów z nadreaktywnością dróg oddechowych5. Dlatego zaleca się podanie krótko działającego beta agonisty przed zabiegiem1. Co więcej, wykazaliśmy wcześniej, że dodanie salbutamolu do roztworu soli fizjologicznej w nebulizatorze ultradźwiękowym jeszcze bardziej zmniejszyło to ryzyko6. Zaletą indukcji plwociny jest to, że jest ona nieinwazyjna2 i bezpieczna, jeśli zostaną podjęte odpowiednie środki ostrożności5.

Do przetwarzania próbek plwociny, obecnie w literaturze stosowane są dwie metody: technika całego plwociny i wybór zatyczki7. W naszym laboratorium wykonywana jest cała technika plwociny. Podstawowym celem przetwarzania plwociny jest uzyskanie różnicowej liczby komórek w celu zbadania rodzaju stanu zapalnego występującego w świetle dróg oddechowych. Jednak wiele dodatkowych analiz jest również możliwych do dalszego zbadania procesów zapalnych i mechanizmów immunologicznych, albo poprzez badanie mediatorów w supernatantze plwociny8, albo poprzez przeprowadzenie szczegółowych badań na komórkach plwociny (np. Cytometria przepływowa9, Hodowle komórkowe10, genomics10, proteomics10, immunocytochemia7, in situ hybridization7, itd.)

Technika indukcji i analizy plwociny jest obecnie ograniczona do usług badawczych i specjalistycznych ośrodków w praktyce klinicznej, ponieważ jest technicznie wymagająca, czasochłonna i wymaga przeszkolonego personelu1. Zapalenie dróg oddechowych można badać tą metodą pod kątem różnych chorób układu oddechowego, takich jak astma, przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), przewlekły kaszel lub idiopatyczne zwłóknienie płuc11.

Protokół

Wszystkie metody opisane w tej sekcji zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Szpitala Uniwersyteckiego w Liège i wszyscy zdrowi uczestnicy wyrazili pisemną zgodę na uczestnictwo.

1.Indukcja plwociny

  1. Spirometria przed i po leczeniu rozszerzającym oskrzela
    1. Wykonaj spirometrię (manewr natężonej objętości wydechowej w ciągu 1 sekundy [FEV1] i manewru namuszonej pojemności życiowej [FVC]) zgodnie ze standardowymi kryteriami American Thoracic Society (ATS)/European Respiratory Society (ERS)12.
    2. Podać 400 μg wziewnego salbutamolu z inhalatora z dozownikiem (MDI) przez urządzenie dystansowe.
      UWAGA: U dorosłych działania niepożądane wziewnego salbutamolu obejmują drżenie i tachykardię13.
    3. Powtórz spirometrię (manewr FEV1 i FVC) 15 minut później, zgodnie ze standardowymi kryteriami ATS/ERS12.
  2. Przygotowanie nebulizatora ultradźwiękowego
    UWAGA: Nebulizator musi być dokładnie oczyszczony i zdezynfekowany przed każdym użyciem, zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Napełnij komorę nebulizatora wodą destylowaną do zalecanego poziomu.
    2. Umieść czystą filiżankę w komorze nebulizatora.
    3. Przykryj kubek odpowiednią pokrywką.
    4. Napełnij kubek 50 ml hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej (5%) dla pacjenta z FEV1 po rozszerzeniu oskrzeli >65% przewidywanych lub 50 ml izotonicznego roztworu soli fizjologicznej (0,9%) dla pacjenta z FEV po rozszerzeniu oskrzeli 1≤65% przewidywanym.
    5. Dodać 1,75 ml roztworu siarczanu salbutamolu (5 mg/ml) do filiżanki.
    6. Podłącz rurki i zawory zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Nebulizacja i pobieranie plwociny
    UWAGA: Technikę należy wykonywać pod nadzorem lekarza.
    1. Wyjaśnij pacjentowi procedurę.
    2. Poproś pacjenta o użycie klipsa na nos.
    3. Włącz nebulizator i wybierz najniższy poziom ustawień aerozolu i wentylatora.
    4. Poproś pacjenta o wdychanie aerozolu przez ustnik z oddychaniem oddechowym przez 5 min.
      UWAGA: Ustawienia aerozolu i wentylatora mogą zostać zwiększone w zależności od tolerancji pacjenta.
      1. W przypadku nieznośnego kaszlu lub nudności przerwij procedurę i przejdź do kroku 1.3.5.
      2. W przypadku ucisku w klatce piersiowej lub dyskomfortu w oddychaniu przejdź do kroku 1.3.8.
    5. Wyłącz nebulizator.
    6. Poproś pacjenta, aby zdjął klips na nos, przepłukał usta wodą i dwukrotnie przepłukał gardło przed wyrzuceniem go do zlewu.
      UWAGA: Komórki śliny mogą zanieczyścić próbkę plwociny i doprowadzić do tego, że próbka stanie się bezużyteczna.
    7. Poproś pacjenta, aby odkrztusił plwocinę do plastikowego pojemnika.
    8. Wykonaj spirometrię (manewr wymuszonego wydechu), aby zmierzyć FEV1.
    9. Oceń spadek FEV1 w następujący sposób: (FEV1 mierzony w kroku 3,8 [ml]) - (FEV 1 po rozszerzeniu oskrzeli mierzony w kroku 1,3 [ml]) / (FEV 1 po rozszerzeniu oskrzela mierzony w kroku 1,3 [ml])*100.
      1. Jeśli FEV1 spadnie o 20% lub więcej w stosunku do wartości po rozszerzeniu oskrzeli, należy przerwać procedurę. Zmierz FEV1 ponownie 10 minut później. Jeśli FEV1 spadnie o 20% lub więcej, należy poprosić lekarza o podanie nebulizowanego bromku ipratropium (0,25 mg/2 ml) i pozostawać pod obserwacją lekarską. Przejdź do kroku 1.3.10.
      2. Jeśli FEV1 nie spadnie o 20% lub więcej od wartości po rozszerzeniu oskrzeli, powtórz kroki od 3,2 do 3,9 raz do trzech razy, aby osiągnąć całkowity czas nebulizacji od 10 do 20 minut
        UWAGA: Całkowity czas nebulizacji będzie zależał od jakości (obecność zatyczek lub lepkich części) i ilości próbki plwociny. Jeśli jakość i/lub ilość próbki jest niska po 10 minutach nebulizacji, procedurę należy przedłużyć, aby osiągnąć całkowity czas nebulizacji od 15 do 20 minut.
    10. Próbkę plwociny należy przechowywać w lodówce do czasu przetworzenia.

2. Przetwarzanie plwociny

UWAGA: Przetwarzaj plwocinę w ciągu 3 godzin od pobrania, aby uzyskać optymalną żywotność komórek.

Uwaga: Noś fartuch laboratoryjny, rękawice ochronne i gogle.

  1. Przygotowania wstępne
    1. Stężony roztwór ditiotreitolu (środek mukolityczny) należy 10-krotnie rozcieńczyć sterylną wodą destylowaną, aby otrzymać 10 ml roztworu o stężeniu 6,5 mM, zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Aby zapobiec mieszaniu się stężonego roztworu ditiotreitolu z powietrzem otoczenia, należy pobrać roztwór z fiolki za pomocą sterylnej strzykawki i igły. Po otwarciu fiolkę ze stężonym roztworem należy przechowywać w temperaturze pokojowej i zużyć w ciągu 5 dni. Rozcieńczony roztwór przygotowuje się codziennie.
      UWAGA: Ze względu na ryzyko podrażnienia oczu i skóry należy nosić sprzęt ochronny (odzież, rękawice i okulary).
    2. Roztworu błękitu trypanowego (0,4%) należy 5-krotnie rozcieńczyć roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco, aby otrzymać 0,08% roztwór. Rozcieńczony roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej i zużyć w ciągu 2 tygodni.
      UWAGA: Ze względu na zagrożenia rakotwórcze należy nosić sprzęt ochronny (odzież, rękawice i okulary).
  2. Pobieranie supernatantu plwociny
    1. Przenieść całą plwocinę do plastikowej probówki o stożkowym dnie o pojemności 50 ml i zważyć próbkę.
    2. Dodać 3-krotną wagę roztworu DPBS.
    3. Powoli wirować próbkę przez 30 sekund.
    4. Wirować przy 800 x g i 4 °C przez 10 min.
    5. Przefiltrować próbkę przez 2 pojedyncze warstwy sterylnej gazy i zebrać supernatant w plastikowej probówce o stożkowym dnie o pojemności 50 ml.
    6. Porcję supernatantu rozmieścić w plastikowych probówkach o pojemności 2 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Próbki sklarowanego osadu są przydatne do oznaczania składników fazy płynnej plwociny.
  3. Mukoliza plwociny
    1. W razie potrzeby dodać DPBS do osadu komórkowego, aby osiągnąć całkowitą objętość zawiesiny komórek wynoszącą 5 ml.
    2. Rozcieńczyć zawiesinę komórek 1 objętością 6,5 mM ditiotreitolu. Użyj bujaka stołowego, aby kołysać zawiesiną ogniw przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
      1. Powtórz co najmniej 3 razy z DPBS.
    3. Odwirować rozcieńczoną zawiesinę komórkową w temperaturze 550 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut. Odrzucić sklarowany osad.
    4. Zawiesić osad komórkowy w około 1 ml DPBS.
  4. Ocena właściwości jakościowych próbki plwociny (stężenie komórek, zanieczyszczenie komórek płaskonabłonkowych i żywotność metodą wykluczenia błękitu trypanowego) za pomocą liczby hemocytometrów
    1. Oceń i zapisz dokładną objętość zawiesiny komórek.
    2. Dodać 50 μl zawiesiny komórkowej do 50 μl 0,08% roztworu błękitu trypanowego i homogenizować.
    3. Umieść próbkę pod szkiełkiem nakrywkowym hemocytometru (komora Thoma) i umieść ją pod mikroskopem optycznym (400X).
    4. Policz komórki płaskonabłonkowe, żywe komórki niepłaskonabłonkowe (komórki bezbarwne) i martwe komórki niepłaskonabłonkowe (komórki koloru niebieskiego).
      UWAGA: W przypadku zbyt małej lub zbyt dużej gęstości komórek, należy zagęścić lub rozcieńczyć zawiesinę komórek i powtórzyć kroki 2.4.1-2.4.3.
    5. Ocenić stężenie komórek w zawiesinie, procent komórek płaskonabłonkowych i procent żywotności komórek niepłaskonabłonkowych.
      UWAGA: Obliczyć całkowitą liczbę komórek niepłaskonabłonkowych/g plwociny: stężenie komórek w zawiesinie (krok 5.4) * objętość zawiesiny komórek (krok 4.8) * % komórek niepłaskonabłonkowych / masa próbki plwociny (krok 2.2.1).
  5. Przygotowanie barwionego szkiełka cytospinowego z zawiesiną komórek i przechowywaniem resztek komórek, jeśli jest to potrzebne
    UWAGA: Jeśli zawiesina komórek zawiera więcej niż 80% komórek płaskonabłonkowych, próbka jest uważana za niskiej jakości i nieodpowiednią do cytospin slide14. W takim przypadku przerwij przetwarzanie i uznaj tę próbkę za nieudaną.
    1. Rozcieńczyć podwielokrotność zawiesiny komórkowej za pomocą DPBS, aby uzyskać co najmniej 350 μl zawiesiny komórkowej przy 500 000 komórek/ml.
    2. Koncentrator komórek należy zmontować zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Wypełnić każdą z 3 komór koncentratora komórek 100 μl tej zawiesiny komórek.
    4. W cytowirówce wirować przez 2 minuty w temperaturze 150 x g i temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatanty.
    5. Zdemontuj koncentrator komórek zgodnie z instrukcjami producenta.
    6. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu.
      UWAGA: Na tym etapie pozostałe komórki mogą być przechowywane w odpowiednim buforze, jeśli jest to potrzebne do dalszych eksperymentów.
    7. Zabejcuj szkiełko dostępnym w handlu zestawem do barwienia (patrz Tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.
    8. Zamontuj szkiełko za pomocą odpowiedniego medium montażowego i szkiełka nakrywkowego.
    9. Umieść szkiełko pod mikroskopem optycznym (600X) z zanurzeniem w olejku.
    10. Policz co najmniej 500 komórek niepłaskonabłonkowych: neutrofile, eozynofile, makrofagi, limfocyty i komórki nabłonkowe.
      UWAGA: Różnicowe zliczanie komórek jest zwykle wykonywane tylko przez jednego lub dwóch dedykowanych i przeszkolonych obserwatorów, aby ograniczyć rozbieżności między obserwatorami.
    11. Rejestruj wartości bezwzględne i procentowe każdego typu komórki.

Wyniki

Hemocytometr
Typowy obraz przedstawiono na Rysunku 1, który został zobrazowany za pomocą mikroskopu z wykorzystaniem hemocytometru. Komórki płaskie są łatwo identyfikowalne, ponieważ są znacznie większe od komórek niepłaskich. Te komórki płaskie to komórki nabłonkowe pochodzące z jamy ustnej. Oba typy komórek ulegają barwieniu błękitem trypanowym (Trypan Blue) w przypadku śmierci. Należy zachować ostrożność, aby nie wliczać drożdżaków, bakterii i zanieczyszczeń.

Siatka do liczenia komórek w hemocytometrze, obraz mikroskopowy, analiza rozkładu komórek.
Rysunek 1: Zdjęcie z hemocytometru przedstawiające (A) żywą komórkę niepłaską, (B) martwą komórkę niepłaską oraz (C) komórkę płaską. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Preparat z wirowania w komorze Cytospin: Rysunek 2 przedstawia reprezentacyjny obraz preparatu z wirowania w komorze Cytospin uzyskanego po opracowaniu plwociny. Różne typy komórek (neutrofile, eozynofile, makrofagi, limfocyty i komórki nabłonka) można rozróżnić na podstawie ich morfologii i zabarwienia. W niektórych przypadkach istotne może być zanieczyszczenie komórkami nabłonka płaskiego; jeśli odsetek komórek nabłonka płaskiego przekracza 80%, próbkę uznaje się za nieudaną (Rysunek 3).

Preparat cytologiczny, komórki pod mikroskopem; identyfikacja struktur komórkowych do analizy diagnostycznej.
Rysunek 2: Zdjęcie preparatu z cytocentryfugi przedstawiające (A) neutrofil, (B) makrofag, (C) eozynofil, (D) limfocyt oraz (E) komórkę nabłonkową. Pasek skali = 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopowy obraz barwionych komórek; jądro, cytoplazma; analiza struktury komórkowej; badanie histologiczne.
Rysunek 3: Przykład preparatu cytospin o niskiej jakości z >80% komórek płaskich. Pasek skali = 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Współczynnik sukcesu
W naszym oddziale współczynnik sukcesu procedury (łączący skuteczną indukcję i czytelny preparat cytospin), oparty na próbie 1 129 pacjentów (osób zdrowych, chorych na astmę lub POChS), wynosi 82% (924/1 129). W podanalizie według rodzaju pacjentów współczynnik sukcesu wynosi 75% (57/76) u osób zdrowych, 82% (827/1 004) u osób z astmą oraz 82% (40/49) u pacjentów z POChS.

Wyniki u zdrowych ochotników
W analizie retrospektywnej serii 289 zdrowych ochotników z naszego oddziału mediana (rozstęp międzykwartylowy) masy plwociny wyniosła 3.72 g (rozstęp międzykwartylowy 2.46 g – 5.54 g), a mediana całkowitej liczby komórek niepłaskich/g plwociny wyniosła 0.59 x 106 (rozstęp międzykwartylowy 0.37 x 106 – 1.29 x 106).

U tych zdrowych ochotników udział komórek płaskich jest niski i wynosi 19% (10%-34%), a żywotność jest wysoka i wynosi 66% (54-78%). W odniesieniu do procentowego udziału poszczególnych typów komórek, wyniki przedstawiono w Rysunku 4A. Można zauważyć, że odsetek makrofagów (49% [31-68%]) jest wyższy niż odsetek neutrofili (34% [14%-60%]), podczas gdy odsetki limfocytów (2% [1-3%]), eosinofili (0% [0%-0%]) i komórek nabłonkowych (4% [2-11%]) są niskie. Wyniki te są podobne, gdy dane są wyrażone w wartościach bezwzględnych (Rysunek 4B).

Wykresy słupkowe składu komórkowego przedstawiające procentowy udział komórek płaskich, żywotność oraz komórek odpornościowych.
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki różnicowego liczenia komórek zaobserwowane u zdrowych ochotników, przedstawione jako (A) wartości procentowe lub (B) wartości bezwzględne. Wyniki przedstawiono jako medianę (rozstęp międzykwartylny). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Ważne jest również uwzględnienie wieku pacjentów. Rzeczywiście, występuje silna korelacja między wiekiem pacjenta a proporcją neutrofili w próbkach plwociny (Rycina 5). Podobnie, przy klasyfikacji pacjentów według 10-letnich grup wiekowych (Rycina 6), zaobserwowano istotny wzrost procentowej zawartości neutrofili wraz z wiekiem grupy. Z tego powodu zmienna ta musi być brana pod uwagę przy porównywaniu wyników z różnych kohort, a przy dobieraniu badanych należy zachować szczególną ostrożność.

Wykres rozrzutu, wiek a neutrofile, regresja liniowa: korelacja dodatnia (r=0.45, p<0.0001).
Rycina 5: Korelacja między wiekiem a procentową zawartością neutrofili w plwocinie. Korelację obliczono za pomocą testu Spearmana. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Wykres słupkowy porównujący procentową zawartość neutrofili w poszczególnych kategoriach wiekowych, wykazujący istotność statystyczną.
Rycina 6: Zmiany procentowej zawartości neutrofili w zależności od kategorii wiekowej.Wartość p dla testu ANOVA wyniosła <0.0001 dla porównania procentowej zawartości neutrofili między grupami wiekowymi. Porównania wielokrotne przeprowadzono za pomocą testu porównań wielokrotnych Dunna. Wartości p przedstawiono w następujący sposób: * p <0.05, ** p <0.01 oraz *** p <0.001. Wyniki przedstawiono jako medianę (rozstęp międzykwartylowy). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki u pacjentów cierpiących na choroby układu oddechowego
Technika indukowania plwociny jest powszechnie stosowana do oceny profilu komórek zapalnych u pacjentów z astmą. Technikę tę można zastosować również u pacjentów cierpiących na POChP, inną zapalną chorobę układu oddechowego. Porównując osoby zdrowe, pacjentów z astmą oraz pacjentów z POChP (trzy grupy dopasowane pod względem wieku, płci i nawyków tytoniowych), zaobserwowano, że profil komórek zapalnych jest znacząco różny pomiędzy tymi kohortami (Rysunek 7). W rzeczywistości pacjenci z astmą charakteryzują się zazwyczaj podwyższonym poziomem eozynofili w plwocinie, podczas gdy proporcja neutrofili w plwocinie jest zazwyczaj wyższa u pacjentów z POChP w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych, co wiąże się z ciężkością choroby.

Wykres słupkowy rozkładu typów komórek; neutrofile, makrofagi, eosinofile w astmie, POChP, u osób zdrowych.
Rycina 7: Profil komórek zapalnych w plwocinie u osób zdrowych (n = 45), pacjentów z astmą (n = 108) oraz pacjentów z POChP (n = 54). Trzy grupy zostały dopasowane pod względem płci, wieku i nawyków tytoniowych. Wartości p dla testu ANOVA wyniosły odpowiednio <0,05, <0,0001 i <0,0001 dla porównania neutrofili, eosinofili i makrofagów pomiędzy grupami. Porównania wielokrotne wykonano za pomocą testu Dunn'a. Wartości p przedstawiono w następujący sposób: * p <0,05 oraz *** p <0,001. Wyniki przedstawiono jako medianę (rozstęp międzykwartylowy). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Metoda indukowanej plwociny jest przydatnym narzędziem do badania przedziału dróg oddechowych. Istnieje kilka możliwych zastosowań tej techniki. Po pierwsze, może poszerzyć wiedzę na temat komórek odpornościowych i mechanizmów związanych z różnymi chorobami układu oddechowego. Na przykład technika ta pozwoliła na zbadanie stanu zapalnego dróg oddechowych w dużych kohortach pacjentów i wykazano, że około połowa pacjentów z astmą charakteryzuje się nieprawidłowym eozynofilowym zapaleniem dróg oddechowych 15,16,17, podczas gdy pacjenci z POChP zwykle wykazują podwyższoną liczbę neutrofili w plwocinie 18. Technika ta przyczyniła się również do lepszego scharakteryzowania zapalenia dróg oddechowych u pacjentów z idiopatycznym zwłóknieniem płuc oraz do wskazania mediatorów, które mogą przyczyniać się do tej choroby19. Po drugie, technika indukowanej plwociny może być przydatna do przewidywania odpowiedzi na leczenie. Na przykład wykazano, że obecność nieprawidłowego odsetka eozynofili w plwocinie jest predykcyjnym markerem odpowiedzi na kortykosteroidy11,18. W astmie i POChP wykazano, że dostosowanie dawki kortykosteroidów w celu normalizacji odsetka eozynofili w plwocinie jest skuteczniejsze w zmniejszaniu liczby zaostrzeń niż dostosowywanie leczenia zgodnie z aktualnymi wytycznymi klinicznymi 11,20,21. Po trzecie, analiza plwociny może pomóc w opracowaniu terapii celowanych. Na przykład obecność nieprawidłowej liczby neutrofili plwociny w POChP i u niektórych pacjentów z astmą doprowadziła do opracowania terapii przeciwneutrofilowych11. Po czwarte, technika ta może odgrywać rolę w diagnozie. Na przykład obecność eozynofilii plwociny jest niezbędna do postawienia diagnozy nieastmatycznego eozynofilowego zapalenia oskrzeli11.

Oprócz uzyskania różnicowej liczby komórek, technika indukowania plwociny pozwala również na wykonanie wielu dodatkowych analiz, poprzez badanie supernatantu plwociny lub komórek plwociny. Przykłady z supernatantem plwociny obejmują analizę mediatorów 8,19,22 i ocenę aktywności chemotaktycznej próbki pod kątem eozynofili 22. Z komórek plwociny RNA można wyekstrahować i wykorzystać do analiz ekspresji mikroRNA lub genów 19,23 . Komórki plwociny można również analizować za pomocą cytometrii przepływowej 9,23, która umożliwia m.in. immunofenotypowanie i sortowanie komórek. Ponadto komórki plwociny mogą być hodowane10, a ich produkcja mediatorów może być mierzona in vitro24. Warto zauważyć, że w tym przypadku zawartość mediatora różni się od tego, co można znaleźć w supernatancie plwociny. Rzeczywiście, na mediatory w supernatancie plwociny mogą wpływać wydzieliny z komórek rezydujących w drogach oddechowych i wysięk z osocza, w przeciwieństwie do modelu hodowli komórek plwociny24. Wreszcie, immunocytochemię i hybrydyzację in situ można również przeprowadzić przy użyciu komórek plwociny7.

Technika indukowanej plwociny ma pewne ograniczenia. Indukcja musi być wykonana pod nadzorem lekarza. Istotne jest również, aby operator udzielał pacjentom dokładnych instrukcji. Inne ograniczenia obejmują współpracę i stan zdrowia pacjentów, ponieważ konieczne są wysiłki oddechowe. Jeśli chodzi o wykonalność tej techniki u dzieci, kilka badań wykazało, że była ona skuteczna i bezpieczna u dzieci w wieku powyżej 6 lat25. Brakuje danych dotyczących dzieci w wieku <6 lat25, ale jest prawdopodobne, że indukcja plwociny jest trudna do przeprowadzenia u tych dzieci14. Technika ta jest obecnie ograniczona do usług badawczych i specjalistycznych ośrodków, ponieważ jest wymagająca technicznie, czasochłonna i wymaga przeszkolonego personelu1. Innym ograniczeniem jest to, że technika indukcji i analizy plwociny nie zawsze jest skuteczna, co oznacza, że nie zawsze uzyskuje się czytelną cytospinę26. Jednak wskaźnik sukcesu wynosi zwykle około 80% w różnych kohortach pacjentów 4,26,27,28,29. Wreszcie, należy zachować ostrożność podczas porównywania różnych kohort pacjentów pod kątem dopasowania wieku, ponieważ wykazano, że wpływa to na liczbę komórek plwociny30,31. Podobnie, inne parametry, takie jak płeć i nawyki tytoniowe, muszą być dopasowane, ponieważ mogą one również zakłócać liczbę komórek plwociny29,32. Gdy dopasowanie pacjentów nie jest możliwe, innym sposobem uwzględnienia wieku, płci lub palenia tytoniu jest dostosowanie analizy statystycznej do tych cech.

W porównaniu z innymi technikami, które umożliwiają pobieranie komórek z dróg oddechowych, takimi jak biopsje i płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, metoda indukowanej plwociny ma tę zaletę, że jest prosta, dobrze tolerowana, bezpieczna, powtarzalna, opłacalna i nieinwazyjna. Zalety te pozwalają na wykonywanie techniki indukowanej plwociny na dużą skalę i wielokrotnie w czasie, co czyni ją alternatywą z wyboru dla pobierania próbek z dróg oddechowych. Bronchosorpcja jest kolejną techniką pozwalającą na pobranie płynu z błony śluzowej w celu oceny mediatorów dróg oddechowych33. Chociaż technika ta (wymagająca bronchoskopii) jest bardziej inwazyjna niż plwocina indukowana, ma zalety polegającą na unikaniu zanieczyszczenia śliną i uzyskiwaniu wyższych stężeń mediatorów niż w przypadku płukania oskrzelowo-pęcherzykowego33.

Krytyczne kroki wymagają uwagi w protokole. Po pierwsze, należy zachować ostrożność w odniesieniu do stężenia soli fizjologicznej i czasu indukcji, ponieważ te dwa parametry mogą mieć wpływ na wyniki i dlatego muszą być standaryzowane34,35. Po drugie, mukoliza z naziemną telewizją cyfrową jest ważnym etapem przetwarzania. W porównaniu z PBS, wykazano, że DTT lepiej rozprasza komórki plwociny7, co poprawia jakość szkiełka cytopsyny i jest niezbędne do uzyskania powtarzalnej liczby komórek2. Jednak czynnik mukolityczny może zakłócać pomiar składników biochemicznych. Eksperymenty z dopingiem powinny być następnie przeprowadzane podczas pomiaru nowego związku biochemicznego36. Wreszcie, kolejnym krytycznym etapem procedury jest etap liczenia komórek, który musi być wykonany przez przeszkolonego technika, aby zapewnić wiarygodne i możliwe do interpretacji wyniki.

Alternatywna metoda wykorzystująca czopy plwociny (lepkie lub gęstsze części) zamiast całej plwociny jest również opisana w literaturze7. Obie techniki mają zalety i wady. Cała technika plwociny pozwala na szybsze przetwarzanie7, ale często jest zanieczyszczona śliną, która rozcieńcza próbkę i może obniżyć jakość cytospinów 2,7. Dzięki technice doboru zatyczek zmniejsza się zanieczyszczenie śliny, co oznacza, że próbki są często lepszej jakości do dozowania mediatorów fazy płynnej i do szkiełek cytospinowych7. Przetwarzanie jest jednak dłuższe7 i wybrane wtyki mogą nie być reprezentatywne dla całej próbki37. Warto również zauważyć, że nie wszystkie próbki zawierają wtyczki, co może być ograniczające. Obie metody są zwalidowane i odtwarzalne, a obecnie nie ma dowodów na to, że różnicowa liczba komórek uzyskana za pomocą obu tych metod jest różna14,38.

W przyszłości indukowana plwocina może być wykorzystywana jako narzędzie kliniczne do dostarczania biomarkerów do badania, diagnozowania i leczenia wszelkiego rodzaju zapalnych chorób układu oddechowego.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Szpital Uniwersytecki w Liège (CHU Liege). Za produkcję wideo dziękujemy firmie "Instants productions". Składamy również wyrazy uznania Cedricowi François, pacjentowi, który wystąpił w filmie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Spirometr - SpirobankMIR Francja
Salbutamol MDI - VentolinGLAXOSMITHKLINECNK: 0135-913Zobacz lek dostępny w kraju
NebulizatorUltraNeb DeVilbiss Healthcare USAUltraNeb U3000
Devilbiss UltraNeb Kubki jednorazowe i PokrywkiDeVilbiss Healthcare USA100HD-647
Filtr bakteryjny DeVilbiss do nebulizatorów UltraNebDeVilbiss Healthcare USA1001005879
Zawory jednokierunkoweHudson RCI USA41664
Zawory jednokierunkoweHudson RCI USA41665
Łącznik T w aerozolu Hudson RCI USA41077
Obwód wentylacyjny jednogałęziowy falistyInt'Air Medical FranceTA30A
NaCl 5 % //Wyprodukowany przez naszą aptekę szpitalną
Mini-Plasco NaCl 0,9%B.Braun Medical  Diegem Belgium
Siarczan salbutamolu 5 mg/ml - VentolinGLAXOSMITHKLINECNK: 0094-987Zobacz lek dostępny w kraju
Bromek ipratropium 0,25 mg/2 ml - AtroventBoehringer Ingelheim NiemcyCNK: 1543-305Zobacz lek dostępny w kraju
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami DulbeccoLONZA BelgiaBE17512F
Odczynnik do splutolizynyCalbiochem56000
Błękit trypanowy 0,4% roztwór 100 mlLONZA Bio Whittaker Belgia17-942E
Hemocytometr - komora ThomaLabor Optik Lancing UK1500000
Zestaw do barwienia HemacolorMerck Belgia1116610001Produkt alternatywny  : Zestaw do barwienia Diff Quik
  Diagnostyka Medion 
Medium montażowe - EntellanMerck Belgia107960
Statspin Cytofuge 12 Beckman Coulter BelgiaX00-003066-001

Bibliografia

  1. Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice. European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).
  2. Pavord, I. D., Pizzichini, M. M., Pizzichini, E., Hargreave, F. E. The use of induced sputum to investigate airway inflammation. Thorax. 52 (6), 498-501 (1997).
  3. Leigh, T. R., et al. Sputum induction for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia. The Lancet. 334 (8656), 205-206 (1989).
  4. Pin, I., et al. Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma. Thorax. 47 (1), 25-29 (1992).
  5. Pizzichini, M. M. M., Leigh, R., Djukanović, R., Sterk, P. J. Safety of sputum induction. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 9s-18s (2002).
  6. Delvaux, M., et al. Nebulised salbutamol administered during sputum induction improves bronchoprotection in patients with asthma. Thorax. 59 (2), 111-115 (2004).
  7. Efthimiadis, A., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 19s-23s (2002).
  8. Kelly, M., et al. Analysis of fluid-phase mediators. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 24s-39s (2002).
  9. Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
  10. Vignola, A. M., et al. Future directions. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 51s-55s (2002).
  11. Brightling, C. E. Clinical applications of induced sputum. Chest. 129 (5), 1344-1348 (2006).
  12. Miller, M. R. Standardisation of spirometry. European Respiratory Journal. 26 (2), 319-338 (2005).
  13. Global Initiative for Asthma (GINA) Global Strategy for Asthma Management and Prevention. , http://www.ginasthma.org/ (2017).
  14. Szefler, S. J., et al. Asthma outcomes: biomarkers. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3 Suppl), S9-S23 (2012).
  15. Douwes, J., Gibson, P., Pekkanen, J., Pearce, N. Non-eosinophilic asthma: importance and possible mechanisms. Thorax. 57 (7), 643-648 (2002).
  16. Schleich, F. N., et al. Importance of concomitant local and systemic eosinophilia in uncontrolled asthma. The European Respiratory Journal. 44 (1), 97-108 (2014).
  17. Demarche, S., et al. Detailed analysis of sputum and systemic inflammation in asthma phenotypes: are paucigranulocytic asthmatics really non-inflammatory? BMC pulmonary medicine. 16, 46(2016).
  18. Pavord, I. D., et al. Clinical applications of assessment of airway inflammation using induced sputum. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 40s(2002).
  19. Guiot, J., Henket, M., Corhay, J. L., Moermans, C., Louis, R. Sputum biomarkers in IPF: Evidence for raised gene expression and protein level of IGFBP-2, IL-8 and MMP-7. PLOS ONE. 12 (2), e0171344(2017).
  20. Green, R. H., et al. Asthma exacerbations and sputum eosinophil counts: a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9347), 1715-1721 (2002).
  21. Siva, R., et al. Eosinophilic airway inflammation and exacerbations of COPD: a randomised controlled trial. European Respiratory Journal. 29 (5), 906-913 (2007).
  22. Louis, R., et al. Cell infiltration, ICAM-1 expression, and eosinophil chemotactic activity in asthmatic sputum. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 466-472 (1997).
  23. Maes, T., et al. Asthma inflammatory phenotypes show differential microRNA expression in sputum. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1433-1446 (2016).
  24. Moermans, C., et al. Local and systemic cellular inflammation and cytokine release in chronic obstructive pulmonary disease. Cytokine. 56 (2), 298-304 (2011).
  25. Gibson, P. G., et al. Sputum induction in children. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 44s-46s (2002).
  26. Reddel, H. K., et al. An Official American Thoracic Society/European Respiratory Society Statement: Asthma Control and Exacerbations: Standardizing Endpoints for Clinical Asthma Trials and Clinical Practice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 180 (1), 59-99 (2009).
  27. Duncan, C. J. A., Lawrie, A., Blaylock, M. G., Douglas, J. G., Walsh, G. M. Reduced eosinophil apoptosis in induced sputum correlates with asthma severity. The European Respiratory Journal. 22 (3), 484-490 (2003).
  28. Demarche, S. F., et al. Asthma Control and Sputum Eosinophils: A Longitudinal Study in Daily Practice. The Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 5 (5), 1335-1343 (2017).
  29. Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2 Pt 1), 475-478 (2000).
  30. Brooks, C. R., Gibson, P. G., Douwes, J., Dalen, C. J. V., Simpson, J. L. Relationship between airway neutrophilia and ageing in asthmatics and non-asthmatics: Airway neutrophilia and ageing. Respirology. 18 (5), 857-865 (2013).
  31. Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
  32. Chalmers, G. W., et al. Smoking and airway inflammation in patients with mild asthma. Chest. 120 (6), 1917-1922 (2001).
  33. Hansel, T. T., et al. A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma: Increased Interferons (IFN-γ and IFN-λ) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13). EBioMedicine. 19, 128-138 (2017).
  34. Popov, T. A., et al. Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis). European Respiratory Journal. 8 (4), 559-565 (1995).
  35. Holz, O., et al. Changes in sputum composition between two inductions performed on consecutive days. Thorax. 53 (2), 83-86 (1998).
  36. Louis, R., et al. The effect of processing on inflammatory markers in induced sputum. European Respiratory Journal. 13 (3), 660-667 (1999).
  37. Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects. American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
  38. Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination. The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obr bka plwocinys l fizjologiczna hipertonicznas l fizjologiczna izotonicznaditiotreitolb kit trypanowycytometria przep ywowakomora licznikowapreparat do cytocentryfugacjir nicowe liczenie kom rek

Powiązane artykuły