Artykuł metodologiczny

Ulepszone hodowle hydrożelowe 3D pierwotnych komórek glejowych do modelowania in vitro zapalenia układu nerwowego

15K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56615

⸱

8 grudnia 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychiatry, University of Alberta, 2Alberta Innovates-Health Solutions Interdisciplinary Team in Smart Neural Prostheses (Project SMART), University of Alberta, 3Department of Chemical and Materials Engineering, University of Alberta, 4Division of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Alberta, 5Centre for Neuroscience, University of Alberta

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół hodowli 3D komórek glejowych pochodzących z mózgu szczura, w tym astrocytów, mikrogleju i oligodendrocytów. Pokazujemy pierwotną hodowlę komórkową, syntezę hydrożelu metakrylowanego kwasu hialuronowego (HAMA), fotopolimeryzację HAMAfotopolimeryzację i enkapsulację komórek oraz przetwarzanie próbek do konfokalnego i skaningowego obrazowania mikroskopem elektronowym.

Streszczenie

W ośrodkowym układzie nerwowym, liczne ostre urazy i zaburzenia neurodegeneracyjne, a także wszczepione urządzenia lub biomateriały zaprojektowane w celu poprawy funkcji dają ten sam wynik: nadmierny stan zapalny prowadzi do glejozy, cytotoksyczności i/lub tworzenia blizny glejowej, które łącznie pogłębiają uraz lub uniemożliwiają zdrowy powrót do zdrowia. Z zamiarem stworzenia systemu do modelowania powstawania blizn glejowych i badania procesów zapalnych, wygenerowaliśmy rusztowanie komórkowe 3D zdolne do przechowywania pierwotnych hodowanych komórek glejowych: mikrogleju, który reguluje reakcję ciała obcego i inicjuje zdarzenie zapalne, astrocytów, które reagują, tworząc włóknistą bliznę oraz oligodendrocytów, które są zwykle podatne na uszkodzenia zapalne. Niniejsza praca przedstawia szczegółową metodę krok po kroku do wytwarzania, hodowli i charakterystyki mikroskopowej rusztowania hydrożelowego 3D na bazie kwasu hialuronowego z kapsułkowanymi komórkami glejowymi pochodzącymi z mózgu szczura. Ponadto zademonstrowano protokoły charakterystyki enkapsulacji komórek i rusztowania hydrożelowego za pomocą immunofluorescencji konfokalnej i skaningowej mikroskopii elektronowej, a także zdolność do modyfikacji rusztowania za pomocą substratów bioaktywnych, z włączeniem komercyjnej mieszaniny blaszki podstawowej w celu poprawy integracji komórek.

Wprowadzenie

Zapalenie ośrodkowego układu nerwowego (OUN) od dawna uważane jest za cechę charakterystyczną ostrego (np. udar niedokrwienny, urazowe uszkodzenie mózgu i rdzenia kręgowego) i przewlekłego (np. choroby Alzheimera, Parkinsona i Huntingtona) uszkodzenia OUN, ale coraz częściej jest uznawane za przyczynę zaburzeń neurodegeneracyjnych i neuropsychiatrycznych. Utrzymujący się lub nieodpowiedni stan zapalny może powodować uszkodzenie nerwów i demielinizację (np. stwardnienie rozsiane) oraz negatywnie wpływać na rozwój mózgu (np. schizofrenia, autyzm) i stany nastroju (np. depresja, lęk, choroba afektywna dwubiegunowa). Ponadto, nowatorskie strategie terapeutyczne wykorzystujące urządzenia wszczepialne (np. interfejsy mózg-komputer1,2,3, głęboka stymulacja mózgu4,5, mikrostymulacja śródrdzeniowa6,7,8,9, 10) generują przewidywalną reakcję zapalną na styku urządzenia z OUN, co skutkuje reakcją tkanki ochronnej, która może spowodować utratę skuteczności lub awarię urządzenia przez cały okres użytkowania implantu11. Zapalenie w OUN jest zwykle inicjowane przez mikroglej, który funkcjonuje jako rezydujące komórki odpornościowe OUN odpowiedzialne za nadzór tkanek i mobilizację odpowiedzi ciała obcego (reviewed12). W zależności od nasilenia urazu, mikroglej sygnalizuje i rekrutuje dodatkowe typy komórek do miejsca urazu. W szczególności mikroglej aktywuje astrocyty, które z kolei działają jako wtórne komórki zapalne i tworzą gęstą barierę ochronną, która zawiera miejsce uszkodzenia13,14. Mikroglej może również inicjować kaskadę aktywności w komórkach obwodowego układu odpornościowego, co może skutkować rozpadem bariery krew-mózg, aby umożliwić infiltrację immunologiczną (przejrzane w reference15).

W przypadku urządzeń wszczepianych do OUN, uszkodzenie tkanki wynikające z wprowadzenia urządzenia, jak również ciągła obecność obcego urządzenia, może zainicjować proces określany jako bliznowacenie glejowe. W tym procesie mikroglej migruje i namnaża się w miejscu urazu. Inicjują również uwalnianie czynników zapalnych w celu neutralizacji potencjalnych zagrożeń i rekrutacji dodatkowych komórek glejowych. Następnie aktywowane astrocyty stają się przerostowe i zaczynają otaczać wszczepione urządzenie, tworząc ciągłą barierę włóknistą16. Sygnalizacja zapalna służy również do promowania wycofywania procesów neuronalnych z okolic implantu i ostatecznie rekrutuje fibroblasty do wzmocnienia rozwijającej się blizny glejowej17. Oligodendrocyty, odpowiedzialne za osłonę neuronów mieliną w celu zwiększenia przewodnictwa, nie przeżywają tego procesu, a odległe komórki są oddzielane od implantu przez bliznę18. Bliznowacenie glejowe znacznie skraca funkcję i żywotność wszczepionych urządzeń, szczególnie w przypadku elektrod rejestrujących, i ostatecznie służy ograniczeniu funkcjonalności interfejsów neuronowych19.

W celu zwiększenia biokompatybilności i aktywności interfejsów wszczepionych urządzeń w klasie CNS20,21,22,23. Dostępny jest obszerny przegląd biokompatybilnego projektu tych interfejsów neuronowych24. Najważniejsze strategie obejmują otoczenie elektrody kompatybilnymi powłokami, takimi jak glikol polieltylenowy (PEG), kwasy polimlekowo-koglikolowe (PLGA)25, lub wzmocnienie elektrody polimerami przewodzącymi, takimi jak poli(dioksytiofen etylenu) (PEDOT) i polipirol (PPy)26,27,28,29,30,31. Zastosowano również powłoki bioaktywne, aby zapewnić wskazówki dotyczące wzrostu tkanki nerwowej przy użyciu ligandów pochodzących z matryc zewnątrzkomórkowych, w tym kolagenów, fibronektyn i kwasów hialuronowych32,33,34,35,36,37. Bioaktywność tych powłok została dodatkowo zbadana za pomocą systemów uwalniania czynników wzrostu w celu emulacji naturalnych wydzielin komórkowych30,38,39,40,41,42,43,44,45, 46,47,48,49,50. Jednocześnie niektóre grupy badawcze zdecydowały się na przemodelowanie geometrii, elastyczności i składu elektrody, aby zmniejszyć mechaniczne niedopasowanie między urządzeniem a tkanką51,52,53,54,55,56,57. Reasumując, strategie te doprowadziły do wielu obiecujących ulepszeń w zakresie neuronowych urządzeń międzyfazowych, jednak długoterminowa kompatybilność jest ciągłym problemem, a postęp może być hamowany przez złożone i czasochłonne modele in vivo.

Podejścia oparte na modelach zwierzęcych mogą ograniczyć wydajność eksperymentalną i zwiększyć koszty testowania biokompatybilności elektrod. Metody in vitro wykorzystujące konwencjonalne techniki hodowli komórkowych oferują bardziej opłacalną alternatywę, ale nie oddają dużej złożoności interakcji między urządzeniem a tkanką58. W szczególności testowanie powłok powierzchniowych przy użyciu hodowli komórkowych 2D ogranicza modelowanie geometrii elektrod oraz wpływ niedopasowania mechanicznego i mikroruchu, które przyczyniają się do generowania odpowiedzi gospodarza przyczyniającej się do awarii urządzenia59,60.

Aby przezwyciężyć problemy związane z hodowlą komórek 2D, opracowano hydrożelowe hodowle komórek nerwowych do szerokiej gamy zastosowań, badania farmakologiczne61, aby ukierunkować różnicowanie komórek nerwowych62, aby zrozumieć szlaki chorób63,64lub warstwowe w jednoczesnej hodowli z innymi typami komórek w celu modelowania migracji komórek, neuroprotekcji lub modelowania mikrośrodowisk tkankowych61. Hydrożele są łatwo formowane w różnych rozmiarach i geometriach, mogą zawierać wiele rodzajów pierwotnych lub unieśmiertelnionych kultur komórkowych i są wysoce podatne na analizę za pomocą powszechnie stosowanych technik, takich jak konfokalna mikroskopia fluorescencyjna. Aby stworzyć model procesu bliznowacenia glejowego, niedawno opracowaliśmy i scharakteryzowaliśmy system hydrożelowy 3D na bazie kwasu hialuronowego do wysokoprzepustowego testowania odpowiedzi glejowej na wszczepione elektrody (Rysunek 1)65. System ten ma kilka wyraźnych zalet: 1) pierwotne komórki glejowe (mikroglej, astrocyty i oligodendrocyty) są zamknięte w matrycy 3D złożonej z polimerów kwasu hialuronowego, który jest endogennym składnikiem macierzy zewnątrzkomórkowej; 2) sztywność matrycy można "dostroić" w celu odtworzenia właściwości mechanicznych tkanki mózgu lub rdzenia kręgowego; oraz 3) komórki mogą być zamknięte w matrycy w szybkim podejściu laboratoryjnym przy użyciu fotopolimeryzacji z zielonym światłem, ograniczając toksyczność podczas enkapsulacji. System ten umożliwia kluczowe cechy biokompatybilności in vivo: urządzenia są wprowadzane do hydrożelu w sposób porównywalny do tkanki, a odpowiedź komórkowa na wszczepione urządzenia jest monitorowana pod kątem szerokiego zakresu parametrów65. Należą do nich mechaniczne niedopasowanie między urządzeniami a powłokami hydrożelowymi o różnych strukturach oraz impulsy stymulacji elektrycznej. System ten obejmuje również oligodendrocyty i pokrewne prekursory, które często są obecne i rekrutowane w bliznach glejowych. Ich uszkodzenie, śmierć i fagocytoza przez mikroglej silnie wskazują na uszkodzenie zapalne, a jako model zmniejszonego bliznowacenia lub regeneracji, mają zdolność wykazywania ponownej mielinizacji neuronów66.

Tutaj opisujemy metodę syntezy i tworzenia hybrydowych hydrożeli kwasu hialuronowego w połączeniu z dostępnymi na rynku preparatami błony podstawnej w celu poprawy integracji komórek. Ponadto zademonstrujemy włączenie pierwotnych hodowanych komórek glejowych (mikrogleju, astrocytów i oligodendrocytów) oraz analizę wzrostu kultur za pomocą immunocytochemii i mikroskopii konfokalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół pobierania tkanki mózgowej od pierwszego dnia u szczeniąt szczurów Sprague Dawley, które zostały poddane eutanazji przez dekapitację, został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Alberty.

1. Izolacja mikrogleju i astrocytów67,68

UWAGA: Wszystkie podłoża do izolacji i hodowli komórkowej są wstępnie podgrzewane do 37 °C w łaźni wodnej. Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) zawiera 1% penicyliny-streptomycyny (PS). Wszystkie zmodyfikowane podłoża Eagle's firmy Dulbecco z mieszanką składników odżywczych F12 Hama (DMEM/F12) są uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną (PS). Tylko mieszanki z trypsyną nie mają FBS. Wszystkie materiały w tym protokole są sterylne (filtr, alkohol, zakupione i autoklawowane), a każdy krok następujący po kroku 1.8 jest wykonywany w komorze bezpieczeństwa biologicznego z zachowaniem techniki aseptycznej.

  1. Na mózg podgrzej wstępnie 15 ml HBSS i 12,5 ml DMEM/F12 do 37 °C w stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml i około 2 ml 0,25% trypsyny z 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Podgrzej dodatkowe 25 ml DMEM/F12. Podgrzej trypsynę około 10 minut przed użyciem, aby zapobiec utracie aktywności enzymatycznej.
  2. Wlej wystarczająco dużo ciepłego HBSS do sterylnych naczyń hodowlanych o średnicy 6 i 10 cm, aby pokryć powierzchnię. Przygotuj jedno naczynie o średnicy 10 cm na każde dwa mózgi oraz dodatkowe naczynie o średnicy 6 cm.
  3. Umieść do 2 mózgów w każdym naczyniu o długości10 cm2 (Rysunek 2A).
  4. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj zakrzywionych i prostych kleszczy, aby oddzielić korę wzdłuż linii środkowej i móżdżek od pnia mózgu. W ten sposób otrzymujemy trzy sekcje tkanki na mózg (Rysunek 2B).
  5. Oderwij cienką, półprzezroczystą warstwę (opony mózgowe) tkanki zawierającej naczynia krwionośne z każdego odcinka tkanki i wyrzuć, przenosząc pozostałą tkankę do oddzielnego naczynia hodowlanego. Chwyć kleszczem cienkie warstwy odsłonięte przez nacięcia tkanek i ostrożnie pociągnij, aż główne części będą "zwisać" z tkanki mózgowej. Na koniec usuń tę porcję, delikatnie szarpiąc. Zobacz Rysunek 2C-2E dla reprezentatywnych obrazów przed, w trakcie i po tym kroku.
  6. W komorze bezpieczeństwa biologicznego usuń pozostały HBSS z naczynia hodowlanego, ostrożnie zachowując tkankę. Tkankę należy zmacerować skalpelem i przenieść tkankę do wstępnie podgrzanej probówki o pojemności 15 ml z trypsyną.
  7. Inkubować tę probówkę przez 25 minut w kąpieli o temperaturze 37 °C w celu enzymatycznego trawienia tkanki.
  8. Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i wylać supernatant.
  9. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml dodaj 10 ml ciepłego DMEM/F12 w celu dezaktywacji trypsyny i rozcieraj roztwór 5 razy, aby rozbić tkankę.
  10. Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i wylać supernatant.
  11. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml zawiesić osad w 10 ml ciepłego DMEM/F12 i przenieść roztwór do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
  12. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o rozmiarze 18 rozcierać roztwór 3 razy.
  13. Rozprowadź ten roztwór w porcjach po 12,5 ml ciepłego DMEM/F12 na mózg.
  14. Odpipetować porcje 1 ml roztartego roztworu do płytki 12-dołkowej (1 na mózg).
  15. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych. Wymień nośnik po trzech dniach i odświeżaj nośnik co kolejne trzy dni. Po 2 tygodniach komórki można pobrać do eksperymentów.

2. Synteza makromerów69

  1. Odważyć 375 mg soli kwasu hialuronowego (HA) w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i dodać 37,5 ml wody destylowanej.
  2. Przepłukać roztwór wirownikiem przez 1 minutę i poddać mieszaninę sonikacji, aż stanie się jednorodna i straci swoją żelową lepkość. Ten proces może potrwać 6 godzin.
  3. Przenieść roztwór do zlewki o pojemności 100 ml z magnetycznym prętem mieszającym (38 mm) i energicznie wymieszać w temperaturze pokojowej.
  4. Ostrożnie miareczkować 5,0 M NaOH do mieszalnego HA i mierzyć za pomocą bibuły do pH, aż pH ustabilizuje się między 8 a 12.
  5. Zebrać 3 ml świeżego bezwodnika metakrylowego (MA, 94%), pokrytego azotem podczas przechowywania.
    UWAGA: MA jest wystawiona na działanie atmosfery przez długi czas (dni), straci swoją reaktywność.
    Uwaga: Całe użycie MA powinno odbywać się pod wyciągiem.
  6. Dodać 200 μl MA do roztworu kwasu hialuronowego do mieszania. Reakcja obniża pH roztworu poniżej 8.
  7. Powtarzać kroki od 2.4 do 2.6, aż 3 ml MA zostaną dodane do roztworu. Proces ten może potrwać do 1-2 godzin.
  8. Pozostawić reakcję na noc w temperaturze 4 °C, bez mieszania.
  9. Przenieść roztwór do 400 ml zimnego etanolu (EtOH) w zlewce o pojemności 500 ml i pozostawić na wytrącanie przez 24 - 72 godziny w temperaturze 4 °C.56
  10. Ostrożnie zdekantować większą część roztworu do oddzielnej zlewki w celu usunięcia i zebrać osad do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. W razie potrzeby można go rozprowadzić w 2-4 probówkach.
  11. Odwirować probówki o sile 200 x g w wirówce przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.
  12. Uzupełnić probówkę zimnym EtOH, mieszać roztwór z wirownikiem przez 1 minutę i powtórzyć krok 2.10-2.11.
  13. Dodać 25 ml sterylnej wody dejonizowanej, mieszać roztwór z wirownikiem przez 1 minutę, dokonywać sonikacji (>20 kHz) przez 1 godzinę i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
  14. Umieścić roztwór w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 15 minut lub do momentu zamrożenia lub błyskawicznego zamrożenia w ciekłym azocie.
    UWAGA: Podczas używania ciekłego azotu należy używać rękawic ochronnych, osłony twarzy i fartucha.
  15. Liofilizować probówkę (poniżej 0,1 mBar i -30 °C) przez 24 - 48 godzin, aż do wytworzenia proszku przypominającego śnieg.
  16. W tym momencie należy zbadać próbkę pod kątem czystości za pomocą 1H magnetycznego rezonansu jądrowego, w którym można potwierdzić ilość protonów metakrylanu (szczyty przy 6,1 i 5,6 ppm) w stosunku do protonów metylu (1,9 ppm) w szkielecie HA. Dopuszczalny jest minimalny stosunek 95% metakrylanu do protonów metylu. 69

3. Tworzenie żelu i enkapsulacja 3D65

  1. Przygotowanie szkiełka nakrywkowego i formy
    1. Przygotować 50 ml roztworu wody destylowanej 2% metakrylanu 3-(trimetoksysililo)propylu w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
    2. Umieścić szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm w roztworze i kołysać przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Jednorazowo można dodać do 50 szkiełek nakrywkowych.
    3. Spłucz szkiełka nakrywkowe, zanurzając je kolejno w 3 zlewkach ze 100 ml wody dejonizowanej.
    4. Szkiełka nakrywkowe wysuszyć przez noc w próżni w temperaturze 40 °C za pomocą eksykatora i piekarnika.
    5. Szybko zanurz poszczególne szkiełka nakrywkowe w 70% EtOH za pomocą kleszczy.
    6. Bez suszenia wrzuć każde szkiełko nakrywkowe do dołka z 12-dołkową płytką.
    7. Umyj i odessaj każdą studzienkę sterylną wodą dejonizowaną (1 ml na studzienkę).
    8. Dodać 1 ml sterylnej poli-L-lizyny (PLL) 2 μg / ml (PLL) do każdego dołka i inkubować przez >2 godziny.
    9. Odessać roztwór PLL i pozostawić szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu.
    10. Zanurz formy polidimetylosiloksanu (PDMS) (patrz Rysunek 1) w 70% EtOH i umieść jedną na środku każdego szkiełka nakrywkowego i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu i stwórz uszczelnienie między formą a szkłem.
      1. Przygotuj formy PDMS, odlewając odczynniki premiksowe PDMS w stosunku 10:1 w naczyniu z polistyrenu o płaskim dnie. Ilość przygotowanego PDMS dobiera się w taki sposób, aby uzyskać arkusz o grubości około 1 mm. Aby uformować studzienki w PDMS, wytnij arkusze okrągłym dziurkaczem o średnicy wewnętrznej 10.
  2. Przygotowanie komórek
    UWAGA: Wszystkie kroki w protokole są wykonywane techniką sterylną w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) dostosowuje się do pH 7,4 dla wszystkich etapów.
    1. 24 godziny przed enkapsulacją komórek w HAMA, odświeżyć pożywkę dla 2-tygodniowych kultur podstawowych (od kroku 1.15) na płytkach 12-dołkowych. Dodaj 1 ml pożywki DMEM/F12 (10% FBS i 1% PS) na dołek.
    2. Na każdą 12-dołkową płytkę komórek przygotować 12,5 ml rozcieńczonej trypsyny (0,25% trypsyny-EDTA rozcieńczonej 30% pożywką DMEM/F12) i 25 ml DMEM/F12 (10% FBS i 1% PS) i ogrzać w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
    3. Zebrać kondycjonowaną pożywkę z płytek za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml (> 0,5 ml na dołek), dokładnie odessać pozostały płyn i zastąpić 1 ml na dołek rozcieńczonej trypsyny (0,075% trypsyny-EDTA) przez 20-30 minut w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ), aż warstwa komórek zlewająca się oderwie się od płytki.
    4. Odzyskaj zawieszony materiał komórkowy za pomocą pipety o pojemności 1 ml (wygląda jak pojedynczy pływający element) i zbierz w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Rozcieńczyć równoważną objętością DMEM/F12 (10% FBS i 1% PS) i odwirować przy 200 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, odrzucając supernatant.
    5. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml ciepłym DMEM/F12 (10% FBS i 1% PS), rozcierać komórki 5 razy za pomocą pipety 10 ml i wirować przy 200 x g przez 2 min.
    6. Zdekantować supernatant, ponownie zawiesić komórki w 5 ml ciepłego DMEM/F12 i przenieść komórki do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
    7. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o rozmiarze 18 należy 3 razy rozcierać roztwór komórek i przefiltrować zawiesinę przez sito komórkowe 40 μm do nowej stożkowej probówki wirówkowej.
    8. Zbierz 10 μl zawiesiny komórek, rozcieńcz 1:100 w ciepłym DMEM/F12 i policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek
    9. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C aż do etapu kapsułkowania.
  3. Hermetyzacja komórek
    UWAGA: Wszystkie kroki w protokole są wykonywane techniką sterylną w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    1. Na każdą 12-dołkową płytkę hydrożeli 3D należy podgrzać 12,5 ml DMEM/F12 i 12,5 ml kondycjonowanej pożywki DMEM/F12 zebranej podczas przygotowywania komórek.
    2. Zważyć ilość metakrylonowego kwasu hialuronowego (HAMA) wymaganą do uzyskania końcowego stężenia 0,5% wag./obj. Rozpuść tę HAMA w sterylnym, przefiltrowanym PBS w stężeniu (2% wag./obj.); stężenie 4 razy wyższe niż stężenie końcowe jest wykorzystywane do dodania komórek i innych odczynników. Jedna 12-dołkowa płytka hydrożeli wymaga ~350 μl PBS z 7 mg HAMA.
    3. Sonikować roztwory (>20 kHz) aż do całkowitego rozpuszczenia HAMA przez 60 minut.
    4. Przygotować indywidualne 10% roztwory zarówno trietanoloaminy (TEA), jak i 1-winylo-2-pirolidynonu (NVP) oraz 1 mM roztwór eozyny Y (EY) w 1 ml podwielokrotności sterylnego PBS o pH 7,4.
    5. Na jedną 12-dołkową płytkę przygotuj końcową mieszaninę 1,4 ml 1 x10 7 komórek, 0,5% wag./obj. HAMA (350 μl 2% wag./obj.), 0,1% TEA (14 μl 10%), 0,1% NVP (14 μl 10%) i 0,01 mM EY (14 μl 1 mM) i 20% mieszaniny blaszki podstawowej (280 μl bulionu). Pozostały wolumin to PBS.
    6. Delikatnie wymieszaj roztwór i odpipetuj 100 μl do każdej formy PDMS za pomocą końcówki o pojemności 1 ml.
    7. Wystaw próbki na działanie zielonego światła LED o wysokiej intensywności (~520 nm, 60 mW, w zamkniętym pudełku o wymiarach 20 cm x 20 cm x 20 cm) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Dodaj 1 ml na dołek ciepłego kondycjonowanego DMEM/F12 do płytki 12-dołkowej.
    9. Chwyć każde szkiełko nakrywkowe między kciukiem a palcem wskazującym, powoli oderwij formę PDMS zakrzywioną pęsetą, uważając, aby nie przesunąć żelu, i umieść go w studzience z kondycjonowanym podłożem.
    10. Dodaj dodatkowy 1 ml ciepłego DMEM/F12 do każdego dołka.
    11. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 tygodnie, odświeżając pożywkę komórkową co tydzień, pipetując 1 ml pożywki z każdej studzienki i zastępując 1 ml DMEM/F12.

4. Mikroskopia

  1. Immunocytochemia
    UWAGA: Do zobrazowania tych próbek użyto odwróconego mikroskopu konfokalnego, a do przetworzenia i wyświetlenia obrazów użyto ImageJ. Mikroglej, astrocyty, oligodendrocyty i jądra zostaną znakowane po 3 tygodniach w hodowli HAMA.
    1. Rozgrzej 10% formalinę buforowaną PBS (pH 7,0) w kąpieli o temperaturze 37 °C.
      Uwaga: Chociaż formalina może być używana na zewnątrz dygestorium, materiał ten reaguje z tkanką i należy zawsze obchodzić się z nim ostrożnie i w rękawiczkach. Należy go utylizować oddzielnie.
    2. Ostrożnie odessać pożywkę z płytek i odpipetować 1 ml 10% formaliny do każdej studzienki.
    3. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w 5% stężeniu CO2 przez 20 minut.
    4. Odessać płyn z każdej płytki, odpipetować 2 ml PBS (pH 7,4) do każdej studzienki i inkubować przez 15 minut.
    5. Powtórz krok 4.1.4 dwukrotnie.
    6. Odessać płyn z płytek, dodać 1 ml na studzienkę PBS z 10% normalną surowicą końską (NHS) i 0,5% trytonem X-100 i delikatnie kołysać z minimalną prędkością) przez 1 godzinę.
    7. Powtórz krok 4.1.4 trzy razy.
    8. Odessać ciecz i dodać 1 ml na studzienkę następującej mieszaniny w PBS: królicza zjonizowana cząsteczka adaptera wiążącego wapń (Iba1) 1:1,000, białko fibrylarne gleju kurczaka (GFAP) 1:5,000, mysia 2',3'-cykliczny nucelotyd 3'-fosodiesteraza (CNPaza) 1:1,000, 1% NHS i 0,1% środek powierzchniowo czynny perforujący komórki. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc, kołysząc płytką tak delikatnie, jak to możliwe.
    9. Powtórzyć krok 4.1.4 trzy razy, przerywając 1 godzinę inkubacji.
    10. Odessać ciecz i dodać 1 ml na studzienkę następującej mieszaniny w PBS: 647 nm wzbudzone przeciwciało anty-królicze osła 1:200, 546 nm wzbudzone przeciwciało przeciwko kurczakom kozie 1:200, 488 nm wzbudzone przeciwciało przeciwko myszom osła 1:200, 1% NHS, 1:1,000 niebieskie zabarwienie jądrowe. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, delikatnie kołysząc płytką.
    11. Powtórz krok 4 trzy razy, wykonując 1 godzinę inkubacji pomiędzy nimi.
    12. Aby zachować hydrożele, należy odessać bufor i zanurzyć je w 0,5 ml pożywki do montażu komórek na 1 minutę. Odpipetować pożywkę montażową i delikatnie nałożyć szkiełko nakrywkowe na żel, tworząc warstwę między szkłem. Dodać niewielką ilość podłoża mocującego na odsłoniętą stronę szkiełek nakrywkowych, aby zapobiec wysychaniu hydrożelu.
      UWAGA: W celu rozwiązywania problemów żele można zobrazować w kroku 4.1.11. aby zobaczyć prawidłowe oznakowanie przed dalszym przetwarzaniem.
  2. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)
    UWAGA: Aby uwidocznić hydrożel, użyto skaningowego mikroskopu elektronowego do zobrazowania tych próbek.
    1. Podgrzej wstępnie mieszaninę utrwalającą 2,5% aldehydu glutarowego i 2% paraformaldehydu w PBS (0,1 M) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
      Uwaga: Odczynniki te są wysoce reaktywne z tkankami i należy obchodzić się z nimi ostrożnie i w rękawiczkach. Należy z nimi obchodzić się w miarę możliwości pod wyciągiem i utylizować oddzielnie.
    2. Odessać pożywkę z płytek do hodowli komórkowych i dodać 1 ml wstępnie podgrzanej mieszaniny utrwalającej.
    3. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w 5% stężeniu CO2 przez 20 minut.
    4. Umieść talerze w temperaturze 4 °C (lodówka/chłodziarka) na noc.
    5. Odessać roztwór utrwalający ze studzienek i dodać 1 ml PBS.
    6. Odessać płyn z każdej płytki, dodać 2 ml PBS do każdej studzienki i inkubować przez 15 minut.
    7. Powtórz krok 4.2.6 jeszcze dwa razy.
    8. Odessać PBS i dodać 1 ml 1% tetratlenku osmu buforowanego w PBS do każdej studzienki.
      UWAGA: Dopóki próbki nie zostaną wysuszone, ten etap i wszystkie kolejne etapy są wykonywane w dygestorium.
    9. Pozwól na utrwalenie przez 30 minut. Opary osmu z cieczy mogą utrwalić inne próbki na tej samej płytce; dlatego przed tym krokiem należy odpowiednio podzielić próbki.
      UWAGA: Czterotlenek osmu jest wysoce reaktywny z tkankami i lotny. Jest niebezpieczny i należy się z nim obchodzić w dygestorium w rękawiczkach. On i wszelkie natychmiastowe umyte należy wyrzucić oddzielnie.
    10. Powtórz krok 4.2.6 trzy razy.
    11. Zassać płyn i dodać mieszaniny odwadniające z poniższej listy, w kolejności, i inkubować (w temperaturze pokojowej) przez wskazany czas. Zacznij od stopniowego dodawania etanolu (EtOH), a następnie heksametylodilazanu (HMDS). Patrz Tabela 2 dla każdego przyrostu.
      UWAGA: Podczas dodawania HMDS szkiełka nakrywkowe mogą mocno przylegać do plastiku i stać się bardzo trudne do usunięcia. Można temu zapobiec, umieszczając małą plastikową platformę pod szkiełkiem po pierwszym zastosowaniu HMDS. Po drugiej inkubacji EtOH próbkę można wyjąć i schłodzić w ciekłym azocie przez kilka sekund w celu zamrożenia i złamania próbki.
    12. Ostrożnie wyjmij wysuszone próbki i zamontuj je na króćcach skaningowego mikroskopu elektronowego za pomocą dwustronnej taśmy przewodzącej.
    13. Napylać próbki minimalną ilością złota. Umieść próbki w uchwycie i uruchom maszynę na 2 minuty przy natężeniu 15 mA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Modelowanie odpowiedzi gospodarza w tkance nerwowej oraz blizny glejowej w wysokoprzepustowym systemie in vitro wymaga zastosowania trójwymiarowego rusztowania komórkowego z materiału macierzy, który jest biokompatybilny, nie wywołuje efektu cytotoksycznego podczas formowania in situ i może być modyfikowany komponentami bioaktywnymi w celu ukierunkowania korzystnej odpowiedzi. W tym celu stworzyliśmy system trójwymiarowego rusztowania komórkowego opartego na kwasie hialu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby osiągnąć cel, jakim jest wygenerowanie systemu hodowli 3D do modelowania bioreaktywności gleju i procesu bliznowacenia gleju, opracowaliśmy system, który może wspierać pierwotne hodowle mikrogleju, astrocytów i oligodendrocytów oraz umożliwia solidną charakterystykę morfologii komórki i interakcji komórka-komórka. Z przedstawionych mikrofotografii wynika, że morfologia każdego typu komórki była wyraźnie różna w przypadku platform mieszanin blaszek 2D, 3D-HAMA i 3D HAMA-Basal. W systemie 2D morfologia była wyraźnie od...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni za wsparcie finansowe od NSERC, CFI, AIHS, Alberta Health Services i Davey Endowment for Brain Research.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1. Materiały do syntezy i fotopolimeryzacji HAMA
Kwas hialuronowy (HA)Sigma-Aldrich53747-10GStreptococcus equi, MW: 1,5 - 1,8 X 10^6
Bezwodnik metakrylowy (MA)Sigma-Aldrich275585-100ML
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma-Aldrich221465-25G
Etanol (EtOH)Alkohole handlowe Inc.
Bezwodne tabletki soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (pH 7,4)Fisher Scientific18912014
Trietanoloamina (HERBATA)Sigma-Aldrich90279-100ML
1-winylo-2pirolidynon (NVP)Sigma-AldrichV3409-5G
EosinY (EY)Sigma-AldrichE6003-25G
Polidimetylosiloksan (PDMS) Sylgard 184 Silikon Zestaw elastomerówDow Corning
3-(trimetoksysililo)metakrylan propyluSigma-Aldrich440159-100ML
Zlewka (100 ml)Zlewka Corning1000-100
(500 ml)Papier pH Corning1000-600
(Labstick)Sigma-Aldrich9580
Nazwa< strong>Firma<strong>Numer katalogowyKomentarze
2. Materiały do izolacji komórek glejowych i hodowli komórkowych
P1-2 Szczenięta szczurów Sprague DawleyRiverCD Szczep szczura Sprague Dawley kod szczepu 001
Nożyczki do dyspreparacji - smukłe ostrza (małe)Fine Science Tools14081-09
Nożyczki chirurgiczne - Toughcut (duże)Fine Science Tools14130-17
Cienkie kleszcze (Dumont #5)Fine Science Tools11521-10
Zakrzywione kleszcze drobnoziarniste (Dumont #7)Narzędzia do nauki o sztuce11271-30
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)Gibco14170-112
Zmodyfikowana pożywka Eagle's Dulbecco i mieszanka składników odżywczych szynki F-12 (DMEM/F12)Gibco11320-033
Penicylina-streptomycyna (PS)Gibco15140-122
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco12483-020
0,25% Kwas trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Gibco25200-072
Poli-L-lizyna (PLL)Sigma-AldrichP-6282
50 ml stożkowa probówka wirówkowaFisher Scientific05-539-13
15 ml stożkowa probówka wirówkowaFisher Scientific05-539-5
12-dołkowe płytki poddane działaniu kultur tkankowych (Cellstar)Greiner Bio-One665 108
10 mlFisher Scientific13-676-10F
25 ml pipeta serologicznaFisher Scientific12-676-10K
Petriego (60 mm X 15 mm)Fisher ScientificFB0875713A
szalka Petriego ( 100 mm X 15 mm)
(18 mm)Fisher Scientific12-545-100 18CIR
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
3. Materiały do mikroskopii (konfokalna i skaningowa mikroskopia elektronowa)
Mysz monoklonalna anty-CNPazaabcamab6319
Królik anty-Iba1Wako Laboratory Chemicals019-17741
Kurczak anty-GFAPabcamab4674
Hoechst 33342Fisher Scientific62249
Fluoromount-GFisher Scientific00-4958-02
FormalinaSigma AldrichHT501128-4LBuforowany (10%)
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
Surowica dla koniGibco16050-122
ParaformaldehydElecton Microscopy Sciences157-8Buforowany (8%)
GuteraldehydElecton Microscopy Sciences16019Buforowany (8%)
Czterotlenek osmuElecton Microscopy Sciences19152Buforowany (2%)
Heksametylodilazan (HMDS)Electon Microscopy Sciences16700
Etanol (EtOH)Electon Microscopy Sciences15055Szkiełko mikroskopu bezwodnego
(25 X 75 X 1 mm)VWR International48311-703
Charles Pipeta serologiczna szalka Szkiełko nakrywkowe do mikroskopu Fisher Scientific FB0875712

Bibliografia

  1. Shih, J. J., Krusienski, D. J., Wolpaw, J. R. Brain-Computer Interfaces in Medicine. Mayo Clin. Proc. 87, 268-279 (2012).
  2. Kennedy, P. R., Bakay, R. A. Restoration of neural output from a paralyzed patient by a direct brain connection. Neuroreport. 9, 1707-1711 (1998).
  3. Kennedy, P. R., Bakay, R. A., Moore, M. M., Adams, K., Goldwaithe, J. Direct control of a computer from the human central nervous system. IEEE Trans. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 8, 198-202 (2000).
  4. Mayberg, H. S., et al. Deep Brain Stimulation for Treatment-Resistant Depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
  5. Dougherty, D. D., et al. A Randomized Sham-Controlled Trial of Deep Brain Stimulation of the Ventral Capsule/Ventral Striatum for Chronic Treatment-Resistant Depression. Biol. Psychiatry. 78, 240-248 (2015).
  6. Bamford, J. A., Marc Lebel, R., Parseyan, K., Mushahwar, V. K. The Fabrication, Implantation, and Stability of Intraspinal Microwire Arrays in the Spinal Cord of Cat and Rat. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 25, 287-296 (2017).
  7. Holinski, B. J., et al. Intraspinal microstimulation produces over-ground walking in anesthetized cats. J. Neural Eng. 13, 056016(2016).
  8. Toossi, A., Everaert, D. G., Azar, A., Dennison, C. R., Mushahwar, V. K. Mechanically Stable Intraspinal Microstimulation Implants for Human Translation. Ann. Biomed. Eng. 45, 681-694 (2017).
  9. Saigal, R., Renzi, C., Mushahwar, V. K. Intraspinal microstimulation generates functional movements after spinal-cord injury. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 12, 430-440 (2004).
  10. Lau, B., Guevremont, L., Mushahwar, V. K. Strategies for generating prolonged functional standing using intramuscular stimulation or intraspinal microstimulation. IEEE Trans. Neural Syst. Rehabil. Eng. Publ. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 15, 273-285 (2007).
  11. Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J. Neurosci. Methods. 148, 1-18 (2005).
  12. Sierra, A., et al. Surveillance, phagocytosis, and inflammation: how never-resting microglia influence adult hippocampal neurogenesis. Neural Plast. 2014, 610343(2014).
  13. Holm, T. H., Draeby, D., Owens, T. Microglia are required for astroglial Toll-like receptor 4 response and for optimal TLR2 and TLR3 response. Glia. 60, 630-638 (2012).
  14. Gao, Z., et al. Reciprocal modulation between microglia and astrocyte in reactive gliosis following the CNS injury. Mol. Neurobiol. 48, 690-701 (2013).
  15. Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J. Biochem. (Tokyo). 159, 491-496 (2016).
  16. Griffith, R. W., Humphrey, D. R. Long-term gliosis around chronically implanted platinum electrodes in the Rhesus macaque motor cortex. Neurosci. Lett. 406, 81-86 (2006).
  17. Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Exp. Neurol. 195, 115-126 (2005).
  18. Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
  19. Szarowski, D. H., et al. Brain responses to micro-machined silicon devices. Brain Res. 983, 23-35 (2003).
  20. Park, D. -W., et al. Graphene-based carbon-layered electrode array technology for neural imaging and optogenetic applications. Nat. Commun. 5, 5258(2014).
  21. McAllister, J. P., et al. Biocompatibility of Penetrating Recording Electrode Arrays Implanted Chronically in the Feline Visual Cortex. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1528(2005).
  22. Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. J. Neurochem. 109, 117-125 (2009).
  23. Chung, H., et al. In vivo Biocompatibility and Stability of Polyimide Microelectrode Array for Retinal Stimulation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 5072(2003).
  24. Aregueta-Robles, U. A., Woolley, A. J., Poole-Warren, L. A., Lovell, N. H., Green, R. A. Organic electrode coatings for next-generation neural interfaces. Front. Neuroengineering. 7, (2014).
  25. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24, 4337-4351 (2003).
  26. Yang, J., et al. Ordered surfactant-templated poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) conducting polymer on microfabricated neural probes. Acta Biomater. 1, 125-136 (2005).
  27. Ludwig, K. A., et al. Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) polymer coatings facilitate smaller neural recording electrodes. J. Neural Eng. 8, 014001(2011).
  28. Kim, D. -H., Abidian, M., Martin, D. C. Conducting polymers grown in hydrogel scaffolds coated on neural prosthetic devices. J. Biomed. Mater. Res. A. 71, 577-585 (2004).
  29. George, P. M., et al. Fabrication and biocompatibility of polypyrrole implants suitable for neural prosthetics. Biomaterials. 26, 3511-3519 (2005).
  30. Stauffer, W. R., Cui, X. T. Polypyrrole doped with 2 peptide sequences from laminin. Biomaterials. 27, 2405-2413 (2006).
  31. Green, R. A., Lovell, N. H., Wallace, G. G., Poole-Warren, L. A. Conducting polymers for neural interfaces: challenges in developing an effective long-term implant. Biomaterials. 29, 3393-3399 (2008).
  32. Gumbiner, B. M. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis. Cell. 84, 345-357 (1996).
  33. Chan, G., Mooney, D. J. New materials for tissue engineering: towards greater control over the biological response. Trends Biotechnol. 26, 382-392 (2008).
  34. Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Impact of co-incorporating laminin peptide dopants and neurotrophic growth factors on conducting polymer properties. Acta Biomater. 6, 63-71 (2010).
  35. Green, R. A., Lovell, N. H., Poole-Warren, L. A. Cell attachment functionality of bioactive conducting polymers for neural interfaces. Biomaterials. 30, 3637-3644 (2009).
  36. Koss, K. M., Unsworth, L. D. Neural tissue engineering: Bioresponsive nanoscaffolds using engineered self-assembling peptides. Acta Biomater. 44, 2-15 (2016).
  37. Koss, K. M., et al. Brain biocompatibility and microglia response towards engineered self-assembling (RADA)4 nanoscaffolds. Acta Biomater. 35, 127-137 (2016).
  38. Evans, A. J., et al. Promoting neurite outgrowth from spiral ganglion neuron explants using polypyrrole/BDNF-coated electrodes. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 241-250 (2009).
  39. Yu, X., Bellamkonda, R. V. Tissue-engineered scaffolds are effective alternatives to autografts for bridging peripheral nerve gaps. Tissue Eng. 9, 421-430 (2003).
  40. Houweling, D. A., Lankhorst, A. J., Gispen, W. H., Bär, P. R., Joosten, E. A. Collagen containing neurotrophin-3 (NT-3) attracts regrowing injured corticospinal axons in the adult rat spinal cord and promotes partial functional recovery. Exp. Neurol. 153, 49-59 (1998).
  41. Wells, M. R., et al. Gel matrix vehicles for growth factor application in nerve gap injuries repaired with tubes: a comparison of biomatrix, collagen, and methylcellulose. Exp. Neurol. 146, 395-402 (1997).
  42. Barras, F. M., Pasche, P., Bouche, N., Aebischer, P., Zurn, A. D. Glial cell line-derived neurotrophic factor released by synthetic guidance channels promotes facial nerve regeneration in the rat. J. Neurosci. Res. 70, 746-755 (2002).
  43. Fine, E. G., Decosterd, I., Papaloïzos, M., Zurn, A. D., Aebischer, P. GDNF and NGF released by synthetic guidance channels support sciatic nerve regeneration across a long gap. Eur. J. Neurosci. 15, 589-601 (2002).
  44. Burdick, J. A., Ward, M., Liang, E., Young, M. J., Langer, R. Stimulation of neurite outgrowth by neurotrophins delivered from degradable hydrogels. Biomaterials. 27, 452-459 (2006).
  45. Piantino, J., Burdick, J. A., Goldberg, D., Langer, R., Benowitz, L. I. An injectable, biodegradable hydrogel for trophic factor delivery enhances axonal rewiring and improves performance after spinal cord injury. Exp. Neurol. 201, 359-367 (2006).
  46. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27, 497-504 (2006).
  47. Taylor, S. J., Sakiyama-Elbert, S. E. Effect of controlled delivery of neurotrophin-3 from fibrin on spinal cord injury in a long term model. J. Control. Release Off. J. Control. Release Soc. 116, 204-210 (2006).
  48. Jhaveri, S. J., et al. Release of nerve growth factor from HEMA hydrogel-coated substrates and its effect on the differentiation of neural cells. Biomacromolecules. 10, 174-183 (2009).
  49. Lee, A. C., et al. Controlled release of nerve growth factor enhances sciatic nerve regeneration. Exp. Neurol. 184, 295-303 (2003).
  50. Matsumoto, K., et al. Neurite outgrowths of neurons with neurotrophin-coated carbon nanotubes. J. Biosci. Bioeng. 103, 216-220 (2007).
  51. Khaled, I., et al. A Flexible Base Electrode Array for Intraspinal Microstimulation. IEEE Trans. Biomed. Eng. 60, 2904(2013).
  52. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed. Microdevices. 16, 43-53 (2014).
  53. Hsu, H. -L., et al. Flexible UV-ozone-modified carbon nanotube electrodes for neuronal recording. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 2177-2181 (2010).
  54. Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med. Biol. Eng. Comput. 48, 945-954 (2010).
  55. Lin, C. -M., Lee, Y. -T., Yeh, S. -R., Fang, W. Flexible carbon nanotubes electrode for neural recording. Biosens. Bioelectron. 24, 2791-2797 (2009).
  56. Richter, A., et al. A simple implantation method for flexible, multisite microelectrodes into rat brains. Front. Neuroengineering. 6, 6(2013).
  57. Rousche, P. J., et al. Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability. IEEE Trans. Biomed. Eng. 48, 361-371 (2001).
  58. Polikov, V. S., Block, M. L., Fellous, J. -M., Hong, J. -S., Reichert, W. M. In vitro model of glial scarring around neuroelectrodes chronically implanted in the CNS. Biomaterials. 27, 5368-5376 (2006).
  59. Sohal, H. S., Clowry, G. J., Jackson, A., O'Neill, A., Baker, S. N. Mechanical Flexibility Reduces the Foreign Body Response to Long-Term Implanted Microelectrodes in Rabbit Cortex. PloS One. 11, e0165606(2016).
  60. Moshayedi, P., et al. The relationship between glial cell mechanosensitivity and foreign body reactions in the central nervous system. Biomaterials. 35, 3919-3925 (2014).
  61. Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog. Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
  62. Pöttler, M., Zierler, S., Kerschbaum, H. H. An artificial three-dimensional matrix promotes ramification in the microglial cell-line, BV-2. Neurosci. Lett. 410, 137-140 (2006).
  63. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 0, 42-51 (2014).
  64. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12, 207-218 (2014).
  65. Jeffery, A. F., Churchward, M. A., Mushahwar, V. K., Todd, K. G., Elias, A. L. Hyaluronic acid-based 3D culture model for in vitro testing of electrode biocompatibility. Biomacromolecules. 15, 2157-2165 (2014).
  66. Fitch, M. T., Silver, J. CNS Injury, Glial Scars, and Inflammation. Exp. Neurol. 209, 294-301 (2008).
  67. Churchward, M. A., Todd, K. G. Statin treatment affects cytokine release and phagocytic activity in primary cultured microglia through two separable mechanisms. Mol. Brain. 7, 85(2014).
  68. Lai, A. Y., Todd, K. G. Differential regulation of trophic and proinflammatory microglial effectors is dependent on severity of neuronal injury. Glia. 56, 259-270 (2008).
  69. Hachet, E., Van Den Berghe, H., Bayma, E., Block, M. R., Auzély-Velty, R. Design of biomimetic cell-interactive substrates using hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13, 1818-1827 (2012).
  70. Eslami, M., Javadi, G., Agdami, N., Shokrgozar, M. A. Expression of COLLAGEN 1 and ELASTIN Genes in Mitral Valvular Interstitial Cells within Microfiber Reinforced Hydrogel. Cell J (Yakhteh). , (2015).
  71. Shaltouki, A., Peng, J., Liu, Q., Rao, M. S., Zeng, X. Efficient Generation of Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells in Defined Conditions. STEM CELLS. 31, 941-952 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tr jwymiarowa hodowla w hydro elumodel neurostanu zapalnegorusztowanie z kwasu hialuronowegokonfokalna immunofluorescencjaskaningowa mikroskopia elektronowainkorporacja pod o a bioaktywnegomieszanina b ony podstawnejkom rki pochodz ce z m zgu szczuratworzenie blizny glejowej

Powiązane artykuły