Ukierunkowane na miejsce unieruchomienie białka morfogenetycznego kości 2 na powierzchniach stałych za pomocą chemii kliknięć

Podsumowanie

Biomateriały domieszkowane białkiem morfogenetycznym kości 2 (BMP2) zostały użyte jako nowa strategia terapeutyczna do leczenia złamań kostnych bez zrostu. Aby przezwyciężyć skutki uboczne wynikające z niekontrolowanego uwalniania czynnika, proponujemy nową strategię bezpośredniego unieruchomienia czynnika, tworząc w ten sposób materiały o ulepszonych zdolnościach osteogennych.

Streszczenie

Różne strategie terapeutyczne w leczeniu niegojących się defektów kości długich były intensywnie badane. Obecnie stosowane terapie mają kilka ograniczeń, które doprowadziły do stosowania biomateriałów w połączeniu z osteogennymi czynnikami wzrostu, takimi jak białka morfogenetyczne kości (BMP). Powszechnie stosowane metody wchłaniania lub kapsułkowania wymagają ponadfizjologicznych ilości BMP2, co zwykle skutkuje tak zwanym początkowym efektem uwalniania, który wywołuje kilka poważnych niepożądanych skutków ubocznych. Możliwą strategią przezwyciężenia tych problemów byłoby kowalencyjne sprzężenie białka z rusztowaniem. Co więcej, sprzężenie powinno być przeprowadzane w sposób specyficzny dla danego miejsca, aby zagwarantować powtarzalny wynik produktu. W związku z tym stworzyliśmy wariant BMP2, w którym sztuczny aminokwas (propargylo-L-lizyna) został wprowadzony do dojrzałej części białka BMP2 poprzez ekspansję użycia kodonów (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk sprzężono z funkcjonalizowanymi kulkami za pomocą katalizowanej miedzią cykloaddycji azydkowo-alkinowej (CuAAC). Aktywność biologiczna sprzężonego BMP2-K3Plk została udowodniona in vitro, a aktywność osteogenna kulek funkcjonalizowanych BMP2-K3Plk została udowodniona w testach komórkowych. Funkcjonalizowane kulki w kontakcie z komórkami C2C12 były w stanie indukować ekspresję fosfatazy alkalicznej (ALP) w lokalnie ograniczonej odległości od kulki. W ten sposób dzięki tej technice można wytwarzać funkcjonalizowane rusztowania, które mogą wyzwalać różnicowanie komórek w kierunku linii osteogennej. Dodatkowo, niższe dawki BMP2 są wystarczające ze względu na kontrolowaną orientację sprzężonego BMP2 skierowanego do miejsca. Dzięki tej metodzie BMP są zawsze wystawione na działanie swoich receptorów na powierzchni komórki w odpowiedniej orientacji, co nie ma miejsca, jeśli czynniki są sprzężone za pomocą technik sprzęgania bez ukierunkowania na miejsce. Wynik produktu jest wysoce kontrolowany, a tym samym prowadzi do uzyskania materiałów o jednorodnych właściwościach, co poprawia ich przydatność do naprawy ubytków kostnych o krytycznych rozmiarach.

Wprowadzenie

Ostatecznym celem inżynierii tkanki kostnej i regeneracji kości jest przezwyciężenie wad i ograniczeń występujących podczas powszechnego leczenia złamań bez zrostu. Auto- lub allotransplantacje są obecnie stosowane głównie jako strategie terapeutyczne, mimo że obie mają kilka wad. Idealny przeszczep kostny powinien indukować osteogenezę poprzez osteoindukcję, a także osteokondukcję, prowadząc do osteointegracji przeszczepu z kością. W dzisiejszych czasach tylko autotransplantacja jest uważana za "złoty standard", ponieważ zapewnia wszystkie cechy idealnego przeszczepu kostnego. Niestety, wiąże się to również z ważnymi negatywnymi aspektami, takimi jak długi czas operacji i drugie miejsce urazu, które zwykle pociąga za sobą więcej powikłań (np. przewlekły ból, powstawanie krwiaków, infekcje, defekty kosmetyczne itp.). Z drugiej strony przeszczepy allogeniczne mają nieoptymalne cechy dla wszystkich ogólnych aspektów¹. W ciągu ostatnich kilku lat udoskonalono alternatywne technologie przeszczepów kostnych w celu wytworzenia rusztowań, które są osteoindukcyjne, osteokondukcyjne, biokompatybilne i bioresorbowalne. Ponieważ wiele biomateriałów nie wykazuje wszystkich tych cech osteogennych, różne czynniki wzrostu, głównie BMP2 i BMP7, zostały włączone w celu poprawy potencjału osteogennego danego rusztowania².

Jako podstawowe kryterium, takie systemy dostarczania czynnika wzrostu powinny zapewniać kontrolowane uwalnianie dawki w czasie, aby ułatwić podstawowe zdarzenia, takie jak rekrutacja i przyłączanie komórek, wrastanie komórek i angiogeneza. Jednak BMP, jak również inne osteogenne czynniki wzrostu, były powszechnie unieruchamiane niekowalencyjnie³. Techniki uwięzienia i adsorpcji wymagają użycia ponadfizjologicznych ilości białka ze względu na początkowe uwolnienie impulsowe, co prowadzi do poważnych niekorzystnych warunków in vivo, zwykle wpływając na otaczające tkanki poprzez indukowanie przerostu kości, osteolizy, obrzęku i stanu zapalnego⁴. W ten sposób zatrzymanie czynników wzrostu w miejscu porodu przez dłuższy czas można osiągnąć za pomocą metod immobilizacji kowalencyjnej. Chemicznie modyfikowane BMP2 (sukcynyla⁵, acetylowane⁶ lub biotynylowane⁷), zmodyfikowane heterodimery⁸, lub oligopeptydy pochodzące z BMP2⁹ zostały zaprojektowane i wykorzystane w celu przezwyciężenia ograniczeń związanych z wchłanianiem. Jednak aktywność biologiczna tych konstruktów nie jest przewidywalna, ponieważ układ potencjalnie hamuje wiązanie unieruchomionego liganda z receptorami komórkowymi. Jak wykazano wcześniej, ważne jest, aby wszystkie cztery łańcuchy receptorowe biorące udział w tworzeniu aktywowanych kompleksów ligand-receptor oddziaływały z unieruchomionym BMP2, aby w pełni aktywować wszystkie kaskady sygnalizacyjne w dół¹⁰.

Aby przezwyciężyć problemy związane z niejednorodnym wynikiem produktu z ograniczeniami w zakresie bioaktywności, stabilności i biodostępności unieruchomionego czynnika, zaprojektowaliśmy wariant BMP zdolny do kowalencyjnego wiązania rusztowań w sposób skierowany na miejsce. Ten wariant, określany jako BMP2-K3Plk, zawiera sztuczny aminokwas, który został wprowadzony przez genetyczną ekspansję kodonu¹¹. Wariant ten został z powodzeniem powiązany z rusztowaniami przy użyciu strategii sprzężenia kowalencyjnego przy jednoczesnym zachowaniu jego aktywności biologicznej.

Protokół

1. Produkcja wariantu BMP2 BMP2-K3Plk

1. Klonowanie BMP2-K3Plk metodą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce przy użyciu PCR¹²
   1. Amplifikować ludzki dojrzały BMP2 (hmBMP2) z wektora p25N-hmBMP2 (patrz Tabela materiałów) za pomocą startera do przodu (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') i startera wstecznego (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') wprowadzając bursztynowy kodon stop (TAG) w pozycji pierwszej lizyny dojrzałej części BMP2. Przeprowadź reakcję PCR, używając 33,5 μl_H2O, 10 μL mieszaniny reakcyjnej PCR, 1,5 μL 10 μM roztworu podstawowego dNTP, 1,5 μL startera doprowadzającego (10 pmol/μL), 1,5 μL startera odwrotnego (10 pmol/μL), 1 μL p25N-hmBMP2 (10 ng/μL) i 1 μL polimerazy DNA (patrz tabela materiałów) w termocyklerze (denaturacja w temperaturze 95 °C przez 5 min, 30 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 1 minutę, wyżarzania w temperaturze 60 °C przez 1 minutę, wydłużenia w temperaturze 72 °C przez 1 minutę i końcowego przedłużenia w temperaturze 72 °C przez 10 minut).
   2. Oczyść produkt PCR za pomocą dostępnego w handlu zestawu zgodnie z zaleceniami producenta (patrz Tabela materiałów).
   3. Produkt PCR z enzymem restrykcyjnym NdeI trawić w temperaturze 37 °C przez 45 minut, używając 16 μl_H2O, 3 μl buforu wytrawiającego, 10 μl DNA (20 ng/μl) i 1 μl enzymu restrykcyjnego. Enzym należy dezaktywować termicznie w temperaturze 65 °C przez 5 minut. Produkt PCR należy roztrawić enzymem restrykcyjnym BamHI w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przy użyciu 16 μl_H2O, 3 μl buforu wytrawiającego, 10 μl DNA (20 ng/μl) i 1 μl enzymu restrykcyjnego. Enzym dezaktywowany termicznie w temperaturze 80 °C przez 5 min.
   4. Trawić wektor pET11a-pyrtRNA za pomocą NdeI w temperaturze 37 °C przez 2 godziny i 45 minut, używając 16 μl_H2O, 3 μl buforu wytrawiającego, 10 μl DNA (20 ng/μl) i 1 μl enzymu restrykcyjnego. Podgrzewać w temperaturze 65 °C przez 5 min. Trawić wektor pET11a-pyrtRNA za pomocą BamHI w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przy użyciu 16 μl_H2O, 3 μl buforu wytrawiającego, 10 μl DNA (20 ng/μl) i 1 μl enzymu restrykcyjnego. Dezaktywacja termiczna w temperaturze 80 °C przez 5 min.
   5. Oddzielić strawiony wektor od niestrawionego wektora i pozostałości po trawieniu za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (0,8% agarozy, 60 min przy 100 V). Zwiąż strawioną wstawkę BMP2-K3TAG z przetrawionym szkieletem pET11a-pyrtRNA w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 godziny przy użyciu 100 ng szkieletu pET11a-pyrtRNA i 34,5 ng wkładki BMP2-K3TAG (stosunek molowy 1:3). Mieszanina reakcyjna zawiera szkielet DNA i insert, 2 μl buforu ligazy, 1 μl ligazy DNA i_H2Odo całkowitej objętości 20 μL.
   6. Wykonaj kotransformację syntezy pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk i pSRF-duet-pyrtRNAsynth w bakteriach BL21(DE3):
      1. Dodać 50 ng każdego plazmidu do bakterii, umieścić mieszaninę na lodzie na 30 minut, szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 50 s, umieścić na lodzie na 5 minut, dodać 500 μl bulionu lizogenicznego (LB) do mieszaniny i wstrząsać z prędkością 300 obr./min przez 60 min.
      2. Rozprowadzić 100 μl mieszaniny bakteryjnej na wstępnie podgrzanych płytkach kanamycyny (50 μg/ml)/ampicyliny (100 μg/ml) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
2. Ekspresja i oczyszczanie BMP2-K3Plk^13,14
   1. Rozmnażać pojedynczą kolonię przez noc w 50 ml pożywki LB z 50 μg/ml kanamycyny i 100 μg/ml ampicyliny w temperaturze 37 °C.
   2. Rozcieńczyć kultury na noc w stosunku 1:20 w 800 ml pożywki Terrific Bulth (TB) uzupełnionej 50 μg/ml kanamycyny i 100 μg/ml ampicyliny i rosnąć w temperaturze 37 °C, aż do osiągnięcia OD₆₀₀ 0,7. Dodać propargylo-L-lizynę do końcowego stężenia 10 mM. Pobrać 100 μl próbki z hodowli przed indukcją izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG).
   3. Indukować ekspresję genów przez dodanie IPTG do końcowego stężenia 1 mM. Hodować kulturę w temperaturze 37 °C przez 16 godzin w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 180 obr./min. Pobrać 100 μl próbki z hodowli.
   4. Odwirować całą kulturę przy 9000 x g przez 30 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny w 30 ml buforu TBSE (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)) z 1:1000 (v/v) 2-merkaptoetanolem (świeżo dodanym).
      Uwaga: Przenoś 2-merkaptoetanol pod wyciągiem. Unikać kontaktu ze skórą i oczami. Unikać wdychania oparów lub mgły. Wykonać wszystkie etapy ponownego zawieszania za pomocą zawierających 2-merkaptoetanol pod wyciągiem.
   5. Zważyć pustą zlewkę wirówkową i przenieść zawieszony osad do pustej zlewki. Wirować przy 6 360 x g przez 20 min. Odrzucić supernatant i zważyć zlewkę razem z osadem. Odejmij masę pustej zlewki, aby obliczyć wagę granulki.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Zawiesić granulat w temperaturze -20 °C w krótkim okresie lub w temperaturze -80 °C w długim okresie. Po wznowieniu protokołu rozmrozić granulkę w RT.
   6. Zawiesić osad w buforze STE (10 mM Tris pH 8,0; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA, 375 mM sacharozy; 1:1000 (v/v) 2-merkaptoetanol (świeżo dodany)). Użyj 200 ml buforu STE na każde 10 g osadu.
   7. Sonizacja zawieszenia na lodzie (10 min z impulsem 40 s, hamowanie 20 s i 30% amplituda). Wirować przy 6 360 x g przez 20 min. Odrzucić sklarowany osad i zważyć osad. Powtórz kroki sonikacji i wirowania 4 razy.
   8. Zawiesić osad w 100 ml buforu TBS (10 mM Tris, 150 mM NaCl). Wirować przy 6 360 x g przez 20 min. Odrzucić supernatant i zważyć osad.
   9. Zawiesić osad w buforze nukleazy (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl₂) ze świeżo dodaną nukleazą o stężeniu 80 U/ml (np. benzonazą) przy użyciu 10 ml / g osadu. Zawiesinę inkubować przez noc w temperaturze pokojowej na płycie mieszającej (30 obr./min).
   10. Dodać bufor Triton (60 mM EDTA, 1,5 M NaCl, 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)fenylo-polietylenoglikol) do zawiesiny. Objętość buforu Triton, który ma zostać dodany, odpowiada części zawiesiny o objętości 0,5. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej (bez mieszania). Wirować przy 6 360 x g przez 20 min. Odrzucić sklarowany osad i zważyć osad.
   11. Zawiesić osad w buforze TE (100 mM Tris, 20 mM EDTA) za pomocą 8 ml/g osadu. Wirować przy 6 360 x g przez 20 min. Odrzucić sklarowany osad i zważyć osad.
   12. Zawiesić osad, dodając 4 ml / g 25 mM NaAc pH 5,0 i 5 ml / g 6 M GuCl z 1 mM ditiotreitolem (DTT) (świeżo dodanym). Inkubować zawiesinę przez noc w temperaturze 4 °C na płytce mieszającej (30 obr./min).
   13. Wirować przy 75 500 x g przez 20 min. Supernatant zawiera teraz niesfałdowane monomeryczne białko BMP2. Zebrać supernatant i zagęścić ten ekstrakt do 20 OD/ml za pomocą membrany o masie cząsteczkowej 3 kDa (MWCO) w komórce zagęszczającej (patrz tabela materiałów).
   14. Dodać skoncentrowane monomery w pojedynczych kroplach do buforu Renaturation (2 M LiCl, 50 mM Tris, 25 mM CHAPS, 5 mM EDTA, 1 mM dwusiarczku glutationu (GSSG), 2 mM glutationu (GSH)) mieszając (30 obr./min). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 120 godzin w ciemności.
       UWAGA: W tym okresie inkubacji następuje ponowne składanie. Rozwiązanie, począwszy od tego etapu, zawiera złożony dimeryk BMP2-K3Plk.
   15. Dostosować pH roztworu do 3,0 za pomocą stężonego HCl. Dializować roztwór w stosunku do 1 mM HCl. Zagęścić dializowany roztwór za pomocą membrany odcięcia masy cząsteczkowej 10 kDa (MWCO) w komórce zagęszczającej.
   16. Zrównoważyć roztwór, dodając bufor A (20 mM NaAc, 30% izopropanolu). Dodać objętość buforu A odpowiadającą 30% objętości roztworu. Odwirować roztwór o stężeniu 4700 x g przez 15 minut.
   17. Zrównoważyć kolumnę do wymiany jonowej w systemie szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC)¹⁵ ze 150 ml buforu A. Załadować roztwór białka na zrównoważoną kolumnę. Frakcje elutyczne należy eluować za pomocą gradientu liniowego buforu B (20 mM NaAc, 30% izopropanolu, 2 M NaCl) za pomocą 100 ml buforu B. Zebrać 2 ml frakcji.
       UWAGA: Skoncentruj białko przed załadowaniem do kolumny zgodnie z całkowitą objętością kolumny. Ostateczna objętość białka powinna wynosić <5% całkowitej objętości kolumny.
   18. Przeanalizuj 20 μl każdej frakcji za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS (12%) (SDS-PAGE) ¹⁶ i Coomassie Brilliant Blue staining¹⁷ (patrz Tabela materiałów).
       UWAGA: Żel SDS-PAGE barwiony na niebiesko Coomassie Brilliant Blue wykazuje frakcje zawierające dimery (26 kDa) oraz frakcje zawierające monomery (13 kDa).
   19. Pula frakcji zawierających dimery. Dializować pulę dimerów zawierających frakcje przez noc w temperaturze 4 °C w stosunku do 1 mM HCl (objętość 5 litrów). Zagęścić produkt końcowy za pomocą zagęszczającego filtra odśrodkowego o natężeniu 10 kDa (patrz Tabela materiałów). Analiza produktu końcowego za pomocą elektroforezy żelowej z poliakryloamidu (12%) SDS (SDS-PAGE) i barwienia Coomassie Brilliant Blue.
       UWAGA: Pasmo na żelu SDS-PAGE barwionym na niebiesko Coomassie Brilliant Blue powinno pokazywać tylko jedno pasmo przy 26 kDa. Jest to końcowy produkt BMP2-K3Plk.

2. Optymalizacja warunków cykloaddycji alkinowo-azydkowej (CuAAC) katalizowanej miedzią (I)

1. Wpływ askorbinianu sodu (NaAsc) i siarczanu miedzi (II) (_CuSO4 ) _{na BMP2 typu dzikiego (BMP2-WT)}
   1. Inkubować 20 μM BMP2-WT z różnymi stosunkami NaAsc do CuSO₄. Użyć 0,5 mM NaAsc i 0,5 mM CuSO₄ (stężenie początkowe) w objętości 50 μl. Postępuj zgodnie z następującymi stosunkami NaAsc do CuSO₄: (1:1), (1,7:1), (10:1), (20:1), utrzymując stężenie CuSO₄ na stałym poziomie 0,5 mM i odpowiednio dostosowując stężenie NaAsc. Przeprowadzić reakcję w_H2Ona mieszalniku obrotowym (20 obr./min) przez noc w temperaturze pokojowej.
   2. Przygotować zredukowane próbki, dodając bufor ładujący zawierający 5% 2-merkaptoetanolu i inkubować próbkę w temperaturze 95 °C przez 6 minut. Analizować zredukowane i niezredukowane próbki za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS (12%) (SDS-PAGE) i barwienia Coomassie Brilliant Blue. Barwione żele SDS-PAGE Coomasie wykazują pasma w zakresie od 13 kDa (warunki zredukowane) do 26 kDa i wyższą masę cząsteczkową (warunki niezredukowane).
2. Wpływ tris(3-hydroksypropylotriolilometylometylo)aminy (THPTA) na reakcję CuAAC
   1. Inkubować 20 μM BMP2-K3Plk z różnymi stosunkami THPTA do CuSO₄. Użyj 5 mM NaAsc i 200 μM 3-Azido-7-hydroksykumaryny (utrzymuj NaAsc i 3-Azido-7-hydroksykumarynę na stałym poziomie). Jako stężenia wyjściowe należy użyć 50 μM THPTA i 0,5 mM_CuSO4. Stosować różne proporcje THPTA do CuSO₄: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). Przeprowadzić reakcję w_H2O(50 μL objętości całkowitej) przez 24 godziny w temperaturze pokojowej na mieszalniku obrotowym (20 obr./min).
   2. Po sprzężeniu 3-azydo-7-hydroksykumaryna staje się barwnikiem fluorescencyjnym. Przygotuj próbki w warunkach zredukowanych i niezredukowanych i przeanalizuj je za pomocą SDS-PAGE. Wizualizuj żele pod kanałem wzbudzenia o określonej długości fali dla 3-azydo-7-hydroksykumaryny (λ_abs = 404 nm; λ_em = 477 nm).

3. Technika kowalencyjnego sprzężenia BMP2-K3Plk z azydkowymi funkcjonalizowanymi kulkami agarozowymi

1. Inkubować 20 μM BMP2-K3Plk lub BMP2-WT (stosowanych jako kontrola ujemna) z 20 μl kulek agarozowych aktywowanych azydkiem w całkowitej objętości 500 μL w buforze reakcyjnym (0,1 M HEPES pH 7,0, 3,9 M mocznik, 50 μM CuSO₄, 250 μM THPTA, 5 mM askorbinianu sodu) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na mieszalniku obrotowym (20 obr./min). Zatrzymaj reakcję, dodając 5 mM EDTA (stężenie końcowe).
2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut na mieszalniku obrotowym (20 obr./min). Odwirować próbki o masie 20 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Zebrać supernatanty.
3. Przepłukać osad zawierający kulki trzykrotnie 1 000 μl buforu HBS₅₀₀ (50 mM HEPES, 500 mM NaCl), trzy razy 1 000 μl 4 M MgCl₂ i dwa razy 1 000 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Na każdym etapie płukania odwirować przy 20 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i zebrać supernatanty. Przechowywać sprzężone kulki w 1 000 μl PBS w temperaturze 4 °C.
   Ostrzeżenie: Nie naruszaj granulki kulki podczas usuwania supernatantu.

4. Walidacja obecności i aktywności biologicznej unieruchomionego BMP2-K3Plk przy użyciu teksańskiego receptora BMP znakowanego czerwono I A Ektodomena (BMPR-IA _EC )

1. Inkubować 50 μl kulek funkcjonalizowanych BMP2-K3Plk z 1 μM BMPR-IA_EC znakowanego czerwienią Texas Red ze 150 μl buforu HBS₅₀₀ (50 mM HEPES, 500 mM NaCl) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na mieszalniku obrotowym (20 obr./min).
2. Odwirować kulki o stężeniu 20 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant. Umyj kulki 1000 μl buforu HBS₅₀₀. Powtórz krok prania dodatkowo 3 razy. Wirować przy 20 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej po każdym etapie mycia.
3. Zawiesić kulki w 500 μl PBS i odpipetować 50 μl na szkiełku podstawowym. Ustaw filtr mikroskopu między 561 a 594 nm. Wykryj funkcjonalizowane kulki Texas Red–BMPR-IA_EC–BMP2-K3Plk za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i rób zdjęcia.

5. Pomiar ekspresji fosfatazy alkalicznej (ALP) w celu udowodnienia in vitro bioaktywności wytworzonego BMP2-K3Plk przed i po reakcji sprzęgania.

1. Test fosfatazy alkalicznej (ALP)
   1. Hodowla promyoblastycznych komórek C2C12 (ATCC CRL-172) w zmodyfikowanej pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), 100 U/ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze przy 5% CO₂ .
   2. Umieść komórki C2C12 o gęstości 3 × 10⁴ komórek/dołek do 96-dołkowej mikropłytki. Pozwól komórkom przyczepić się na noc. Usunąć pożywkę i inkubować komórki C2C12 w obecności 0,5-200 nM BMP2-WT lub BMP2-K3Plk w 100 μl/basenik DMEM (2% FCS, 100 U/ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny) w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze przy 5% CO₂ przez 72 godziny.
   3. Usunąć pożywkę i przemyć komórki 100 μl PBS na studzienkę. Lizować komórki w RT przez 1 godzinę ze 100 μl/studzienkę buforu do lizy (1% NP-40, 0,1 M glicyny, pH 9,6, 1 mM MgCl₂, 1 mM ZnCl₂) na płytce wytrząsającej (220 obr./min).
   4. Dodać 100 μl/basenik buforu ALP (0,1 M glicyny, pH 9,6, 1 mM MgCl₂, 1 mM ZnCl₂) z 1 mg/ml p-nitrofenylofosforanu (świeżo dodanego) do lizatu komórkowego.
   5. Zmierz absorpcję przy 405 nm w czytniku wielopłytkowym po dodaniu buforu ALP i co 5 minut, aż do zakończenia opracowywania koloru. Wygeneruj krzywe odpowiedzi na dawkę i wartości EC50 przy użyciu modelu logistycznego, y = A₂ + (A_{1-A 2})/(1 + (x/x₀)^p).
2. Barwienie fosfatazą alkaliczną (ALP)
   1. Hodowla promyoblastycznych komórek C2C12 (ATCC CRL-172) w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), 100 U/ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze przy 5% CO₂ .
   2. Nasiona komórek C2C12 o gęstości 3 × 10⁴ komórek/dołek w 96-dołkowej mikropłytce. Pozwól komórkom przyczepić się na noc. Usuń pożywkę i dodaj 20 μl/dołek koralików sprzężonych z BMP2-K3Plk. Koraliki sprzężone BMP2-K3Plk znajdują się w 1000 μl zawiesiny PBS.
   3. Przygotować roztwór 0,4% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w DMEM. Rozpuść w kuchence mikrofalowej (600 W przez 3 minuty) i pozostaw do ostygnięcia w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C do czasu użycia.
   4. Dodaj 20 μl 0,4% agarozy o niskiej temperaturze topnienia do każdej studzienki (przykrywającej kulki i komórki). Wirować przy 2000 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C. Dodać 80 μl DMEM (2% FCS, 100 U/ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny) i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze przy 5% CO₂ przez 72 godziny.
   5. Usuń pożywkę, uważając, aby nie oderwać zestalonej 0,4% agarozy. Dodać 100 μl/basenik 1-stopniowego roztworu substratu NBT/BCIP (nitro-niebieski chlorek tetrazolu, sól 5-bromo-4-chloro-3'-indolifosforanu p-toluidyny).
   6. Analizuj barwienie fosfatazą alkaliczną za pomocą mikroskopii świetlnej natychmiast po tym, jak fioletowe zabarwienie stanie się widoczne. Użyj mikroskopii jasnego pola i rób zdjęcia.

Wyniki

W tym artykule opisujemy metodę kowalencyjnego sprzężenia nowego wariantu BMP2, BMP2-K3Plk, z dostępnymi na rynku azydkowymi funkcjonalizowanymi kulkami agarozy (Rysunek 1). Bioaktywność wytworzonego wariantu BMP2-K3Plk zwalidowano poprzez indukcję ekspresji genu fosfatazy alkalicznej (ALP) w komórkach C2C12. Test in vitro wykazuje podobne poziomy ekspresji ALP indukowane przez BMP2 typu dzikiego (BMP2-WT) i BMP2-K3Plk (Rysunek 2)...

Dyskusja

Generowanie znakowanych wariantów białek poprzez genetyczną ekspansję kodonów pozwala na wprowadzenie różnych nienaturalnych analogów aminokwasów, głównie w dowolnej pozycji pierwotnej sekwencji białka. W przypadku BMP, takich jak BMP2, powszechne znaczniki, takie jak znacznik 6-histydyny (His), mogą być wprowadzane tylko N-końcowy, ponieważ C-końcowy koniec białka jest zakopany w trzeciorzędowej strukturze białka, a zatem nie jest dostępny z zewnątrz. W innych pozycjach rozmiar wprowadzonego znacznika może z dużym prawd...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiał
1-stopniowy NBT/BCIP	Thermo Fisher	34042	Dodaj roztwór do komórek
3-Azido-7-hydroksykumaryna	BaseClick	BCFA-047-1	Substancja chemiczna stosowana w reakcji kliknięcia
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Biozym	840101	Agaroza do testu ALP
Koraliki agarozy azydkowej	Jena Bioscience	CLK-1038-2	Koraliki używane do reakcji
BamHI (enzym Fast Digest)	Thermo Fisher Scientific	FD0054	Enzym restrykcyjny
receptor BMP IA (BMPR-IAEC)		---	Wyprodukowano w naszym laboratorium
Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye	Thermo Fisher Scientific	20279	Substancja chemiczna stosowana do barwienia Coomassie na błękit brylantowy SDS PAGE
Siarczan miedzi (II) bezwodny (CuSO4)	Alfa Aesar	A13986	Substancja chemiczna stosowana w reakcji kliknięcia
Polimeraza DNA i bufor reakcyjny	Kapabiosystems	KK2102	KAPA Zestaw HiFi PCR
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM) GlutaMAX	Gibco	61965-026	Pożywka do hodowli komórkowych
kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma Aldrich GmbH	E5134-1kg	Substancja chemiczna stosowana do zatrzymania reakcji kliknięcia
Izopropyl ß-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)	Carl Roth GmbH	2316.5	Indukcja bakterii (stężenie końcowe 1mM)
NdeI (enzym szybko trawiony)	Thermo Fisher Scientific	ER0581	Enzym restrykcyjny
aktywowany przez NHS technologie Texas Red	Life	T6134	sprzężony z receptorem
P-fosforan nitrofenylu	Sigma Aldrich GmbH	N4645-1G	Fosfataza alkaliczna
p25N-hmBMP2	-	---	Plazmid uprzejmie dostarczony przez Waltera Sebalda do J. Nickel
pET11a-pyrtRNA-	-	--	Dostarczony przez Katedrę Farmacji i Biofarmacji, Uniwersytet w Wuerzburgu
propargylo-L-lizyna (Plk)	--	--	Dostarczony przez Katedrę Farmacji i Biofarmacji, Uniwersytet w Wuerzburgu
pSRFduet-pyrtRNAsynth	--	--	Dostarczone przez Katedrę Farmacji i Biofarmacji, Uniwersytet w Wuerzburgu
Zestaw do ekstrakcji żelu	Qiagen Qiagen	28704	Zestaw do oczyszczania
żelu Qiagen PCR Zestaw do oczyszczania	Qiagen	28104	PCR
L-askorbinian sodu	Sigma Aldrich GmbH	A7631-100G	Substancja chemiczna stosowana w reakcji kliknięcia
Ligaza DNA T4	ThermoScientific	EL0011	Ligacja
tris(3-hydroksypropylotriazolylo)amina (THPTA)	BaseClick	BCMI-006-100	Substancja chemiczna stosowana w reakcji
kliknięcia Glikol 4-(1,1,3,3-Tetrametylobutylo)fenylo-polietylenowy	Sigma Aldrich GmbH	X100-1L	Triton X 100
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Equipment
Amicon komora koncentracyjna 400 ml	Merck KGaA	UFSC40001	Jednostka zagęszczająca
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15 Merck	KGaA	UFC901024	Koncentratorowa jednostka odśrodkowa
Ä KTA avant FPLC	Ä KTA-	-	Maszyna FPLC
Avanti J-26XP	Beckman Coulter	393124	Wirówka do hodowli bakterii
Inkubator do wytrząsania bakterii	Infors HT		Inkubator do wytrząsania do hodowli bakterii
FluorChem Q system	proteinsimple	-	System obrazowania i analizy dla SDS-PAGE
Fluorescencyjny miscroskop	Keyence	BZ-9000 (BIOREVO)
Fractogel® EMD SO3- (M)	Merck KGaA	116882	Materiał kolumny do chromatografii jonowymiennej
Greiner CELLSTAR®   Płytki 96-dołkowe	Sigma	M5811-40EA	96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych (test ALP)
Heraeus Multifuge X1R	ThermoScientific	-	-Wirówka
M-20 Wirnik do mikropłytek wahadłowych	ThermoScientific	75003624	Rotor do mikrowirówki do płytki podczas barwienia ALP
Mikrowirówka - 5417R	Eppendorf	-	-Wirówka
OriginPro 9.1 G	OriginLab	-	oprogramowanie do analizy statycznej danych z testów ALP
Szkiełka polisynowe Preparaty	mikroskopowe	ThermoScientific	10143265
Rotor JA-10	Beckman Coulter	--	wirnik do wirówki Avanti J-26XP
Rotor JLA 8.1	Beckman Coulter	--	wirnik do wirówki Avanti J-26XP
Rotor JA 25.50	Beckman Coulter	--	wirnik do wirówki Avanti J-26XP
Tecan nieskończony czytnik wielopłytkowy M200	Tecan Deutschland GmbH	--	Czytnik wielopłytkowy do testu ALP
Termocykler - Labcycler Gradient	SensoQuest GmbH	--	PCR
TxRed - filtr mikroskopowy	Keyence		Filtr do mikroskopu fluorescencyjnego
Ultrafiltracja krążki z regenerowanej celulozy 3 kDa	Merck KGaA	PLBC04310	stosowane z komórką zagęszczającą amicon 400ml
Ultrafiltracja krążki z regenerowanej celulozy 10 kDa	Merck KGaA	PLGC04310	stosowane z amikonową kuwetą 400ml