Wytwarzanie niestandardowych studzienek agarozowych do wysiewu komórek i samomontażu pierścieni tkankowych przy użyciu form drukowanych w 3D

Podsumowanie

Ten protokół opisuje platformę do produkcji samodzielnie składających się pierścieni tkankowych w różnych rozmiarach przy użyciu dostosowanej formy z tworzywa sztucznego wydrukowanej w 3D. Negatywy PDMS są utwardzane w formie wydrukowanej w 3D; następnie agaroza jest odlewana w utwardzonych negatywach PDMS. Komórki są wysiewane do powstałych studzienek agarozowych, gdzie agregują się w pierścienie tkankowe.

Streszczenie

Zmodyfikowane tkanki są wykorzystywane klinicznie do naprawy i wymiany tkanek, a także są rozwijane jako narzędzia do badań przesiewowych leków i modelowania chorób ludzkich. Samoorganizujące się tkanki mają zalety w porównaniu z inżynierią tkankową opartą na rusztowaniach, takie jak lepsze osadzanie matrycy, wytrzymałość i funkcjonalność. Istnieje jednak kilka dostępnych metod wytwarzania tkanek 3D bez wysiewania komórek na rusztowaniu nośnym lub w jego obrębie. Wcześniej opracowaliśmy system do wytwarzania samoorganizujących się pierścieni tkankowych poprzez wysiewanie komórek do nieprzywierających studzienek agarozowych. Negatyw polidimetylosiloksanu (PDMS) został najpierw odlany w obrobionej maszynowo formie poliwęglanowej, a następnie agaroza została zżelowana w negatywie PDMS w celu stworzenia studzienek do wysiewu komórek w kształcie pierścienia. Wszechstronność tego podejścia była jednak ograniczona przez rozdzielczość dostępnych narzędzi do obróbki formy poliwęglanowej. Tutaj pokazujemy, że plastik drukowany w 3D może być używany jako alternatywa dla obrabianego maszynowo poliwęglanu do produkcji negatywów PDMS. Wydrukowana w 3D forma i zmieniony projekt formy są prostsze w użyciu, niedrogie w produkcji i wymagają znacznie mniej agarozy i PDMS na studnię wysiewu komórek. Wykazaliśmy, że powstałe dołki agarozowe można wykorzystać do tworzenia samoorganizujących się pierścieni tkankowych o niestandardowych średnicach z wielu różnych typów komórek. Pierścienie mogą być następnie używane do analizy mechanicznej, funkcjonalnej i histologicznej lub do wytwarzania większych i bardziej złożonych tkanek rurkowych.

Wprowadzenie

Metody samoorganizacji komórkowej do wytwarzania naczyń krwionośnych z inżynierii tkankowej są alternatywą dla metod opartych na rusztowaniach. Samoorganizujące się, wolne od rusztowań tkanki mogą mieć większą gęstość komórek, lepsze osadzanie i wytrzymałość matrycy oraz lepszą funkcję biologiczną w porównaniu z tkankami opartymi na rusztowaniach^1,2,3,4. Wyzwaniem pozostaje jednak formowanie tkanek 3D bez użycia egzogennego podłoża rusztowania o określonych rozmiarach i kształtach. Niektóre metody łączą ze sobą warstwy arkuszy komórek, tworząc grubsze konstrukcje, chociaż proces ten może być czasochłonny i pracochłonny⁵. Alternatywnie, komórki można umieścić w nieprzywierającej formie i pozwolić na agregację w sferoidy, pierścienie i inne kształty tkanek^6,7,8.

Samoorganizujące się pierścienie tkankowe wymagają mniejszej liczby komórek, krótszych czasów hodowli i mniejszej ilości odczynników niż większe tkanki rurkowe, ale nadal mogą być testowane mechanicznie, histologicznie lub używane do kurczliwości i innych testów funkcjonalnych^7,9^,10,11. Ze względu na to, że można je szybko wyprodukować i łatwo przetestować, pierścienie tkankowe są idealne do badania przesiewowego dużej liczby parametrów hodowli i mają potencjał do wykorzystania jako modele chorób¹¹ lub narzędzia do badań przesiewowych leków¹². Dodatkowo, pierścienie mogą być łączone w bardziej złożone struktury tkankowe, takie jak naczynia krwionośne lub tchawica^7,13, a pierścienie mogą łączyć się pełniej niż inne kształty, takie jak sferoidy^14,15.

Agaroza jest szeroko stosowana jako materiał do produkcji samodzielnie składających się tkanek ze względu na jej biokompatybilność, przepuszczalność i właściwości adhezyjne niekomórkowe. Na przykład Norotte i in. wytwarzali formy agarozowe z wytłaczanych prętów, co umożliwiało ograniczoną kontrolę nad kształtem formy i wymagało specjalistycznego sprzętu¹⁵. Tan i wsp. zdeponowali kropelki alginianu jako jednostki budulcowe do wytwarzania niestandardowych form hydrożelowych w różnych kształtach (piramida, kwadrat)¹⁶. Jednak duża średnica sferoid alginianowych (300 μm) skutkowała uzyskaniem cech o niskiej rozdzielczości. Tak niska rozdzielczość może skutkować nierównymi powierzchniami formy, które mogą niekorzystnie wpływać na spójność agregacji komórek. Alternatywnie, agaroza może być odlewana w negatywy polimerowe, aby stworzyć nieprzylepne formy o gładkich cechach i określonych wymiarach^6,7,17.

Wcześniej informowaliśmy o systemie do wytwarzania niestandardowych pierścieniowych studni do wysiewu komórek agarozy z ujemnego odlewu PDMS w zmielonej formie z poliwęglanu^7,18. Agarozę wlano do negatywu PDMS i pozwolono ustawić^7,18. Komórki zostały następnie wysiane w studzienkach agarozowych, gdzie agregowały się, tworząc samoorganizujące się, wolne od rusztowań pierścienie tkankowe w czasie krótszym niż 24 godziny^7,18. Negatywy PDMS można sterylizować w autoklawie, można ich używać wielokrotnie, są miękkie i elastyczne, co ułatwia usuwanie zestalonych studzienek agarozowych. Kiedy ten system został po raz pierwszy opisany w Gwyther et al.⁷, negatywy PDMS zostały odlane z frezowanych form poliwęglanowych (Rysunek 1A). Po odlaniu agarozy, dołki do wysiewu komórek zostały indywidualnie wycięte i umieszczone w studzienkach 12-dołkowej płytki^7,18. Projekt został niedawno zmodyfikowany w taki sposób, że pojedyncza forma agarozy wytwarza 5 pierścieni i mieści się w studzience na płytce 6-dołkowej, eliminując potrzebę wycinania pojedynczych dołków i zmniejszając ilość PDMS i agarozy wymaganych do wytworzenia każdego pierścienia (Rysunek 1B). Zastosowano mniejszą szerokość koryta wysiewu komórek, aby zmniejszyć liczbę wysiewanych komórek wymaganych do uzyskania pierścienia. Pomimo tych zmian, rozdzielczość i dostosowywanie form były ograniczone do dostępnych standardowych wymiarów frezów walcowo-czołowych, a mikrofrezowanie może być zbyt drogie. Ponadto obróbka sterowana numerycznie (CNC) może być czasochłonna i kłopotliwa ze względu na konieczność zarezerwowania czasu na intensywnie wykorzystywany sprzęt niestandardowy, dodatkowe oprogramowanie do produkcji wspomaganej komputerowo (CAM) do konwersji pliku projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) na programowalną ścieżkę narzędzia oraz niezawodne mocowanie części z poliwęglanu podczas obróbki.

W niniejszym badaniu zbadaliśmy wykorzystanie druku 3D jako alternatywy dla CNC, machining. 3D drukowanie jest szeroko stosowane do inżynierii niestandardowych implantów, wytwarzania materiałów na rusztowania oraz do bezpośredniego drukowania komórek i sferoidów tkanek^15,19,20. Użyliśmy drukarki 3D o wysokiej rozdzielczości oraz specjalistycznego materiału do druku 3D, który umożliwił nam wydrukowanie sztywnej formy o gładkim, błyszczącym wykończeniu powierzchni (patrz Tabela Materiałów). Nasza technika pozwala na wytwarzanie wysoce konfigurowalnych form z tworzywa sztucznego o wysokiej rozdzielczości, które można wykorzystać do odlewania negatywów PDMS i studni agarozowych. Iteracje projektu są podsumowane w Rysunek 1. Konstrukcja formy została dodatkowo zmodyfikowana w wersji formy wydrukowanej w 3D, aby uwzględnić zwężające się ścianki zewnętrzne i otwór środkowy, aby ułatwić usuwanie zarówno negatywów PDMS z form drukowanych w 3D, jak i studzienek agarozowych z negatywów PDMS. Tych stożkowych cech nie można osiągnąć przy użyciu standardowych procesów obróbki. Odległość od dna studzienek do dna formy została zwiększona w tej iteracji, co spowodowało grubszą podstawę agarozy poniżej słupków, aby zmniejszyć ryzyko pęknięcia słupków podczas usuwania studni agarozowej. Procedura wytwarzania formy i pierścienia jest pokazana schematycznie w Rysunek 2.

Protokół

1. Przygotowanie formy wydrukowanej w 3D

1. Przygotuj rysunek CAD formy w żądanych wymiarach.
2. Wyślij plik CAD do drukarki 3D o wysokiej rozdzielczości. Wybierz odpowiedni plastikowy materiał drukarski z błyszczącym wykończeniem.
3. Po wydrukowaniu dokładnie umyj formę detergentem i wodą.

2. Rzutowanie negatywów PDMS

1. Zmierz żądaną ilość podstawy PDMS na wadze. W przypadku formy o średnicy 60 mm i wkładkach studzienkowych 2 mm użyj 25 g.
2. Dodaj utwardzacz w stosunku 1:10 (w/w) do bazy PDMS.
3. Mieszaj energicznie, aż oba składniki dokładnie się połączą. Niewystarczające wymieszanie może spowodować niepełne utwardzenie PDMS, co spowoduje "lepką" powierzchnię.
4. Umieść kawałek taśmy laboratoryjnej wokół granicy form wydrukowanych w 3D, aby umożliwić utworzenie warstwy bazowej PDMS nad wydrukowanymi studzienkami.
5. Wlej mieszaninę PDMS do formy i umieść formę w komorze próżniowej, aby odgazować, aż wszystkie pęcherzyki zostaną uwolnione.
6. Utwardzać PDMS w temperaturze 50 °C przez 2–4 godziny lub do momentu, gdy zestalą się na tyle, aby można je było usunąć.
7. Usuń taśmę laboratoryjną i ostrożnie wyjmij negatyw PDMS.
8. Inkubuj PDMS w temperaturze 60 °C przez dodatkową 1 godzinę (po wyjęciu z formy wydrukowanej w 3D), aby upewnić się, że pleśń jest w pełni utwardzona.
9. Dokładnie umyj PDMS detergentem i wodą, aby usunąć wszelkie pozostałości. Niewystarczające mycie może skutkować słabym tworzeniem pierścienia przy pierwszych zastosowaniach PDMS negative.

3. Wytwarzanie studni agarozowych

1. Przygotuj dołki agarozowe 1 dzień przed wysiewem komórek.
2. Przygotować 2% (w/v) roztwór agarozy w DMEM i autoklawie.
3. Odpipetować 4 ml stopionej agarozy do autoklawizowanego ujemnego PDMS. Następnie pipetuj agarozę bezpośrednio do słupków negatywów PDMS. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą końcówki pipety, ponieważ pęcherzyki mogą powodować niejednorodności w wymiarach studzienki.
4. UWAGA: Nie przepełniaj form; górna powierzchnia agarozy musi być płaska, tak aby studzienki agarozowe były wypoziomowane po wyjęciu z PDMS i umieszczeniu na 6-dołkowych płytkach hodowlanych. Resztki agarozy można ponownie sterylizować w autoklawie i ponownie wykorzystać, jednak nie więcej niż raz.
5. Po ostygnięciu agarozy (około 10 minut na 4 ml agarozy; większe formy mogą wymagać dłuższego czasu chłodzenia), ostrożnie oddziel dołki agarozowe od negatywów PDMS za pomocą kleszczy i przenieś do studzienki na 6-dołkowej płytce.
6. Zanurzyć studzienki agarozowe w kompletnej pożywce hodowlanej i zrównoważyć przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C przed użyciem.

4. Pierścienie tkankowe do wysiewu

1. Hodowla komórek mięśni gładkich aorty szczura²¹ (RaSMC) w DMEM zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% L-glutaminy, 1% aminokwasów endogennych, 1% pirogronianu sodu i 1% penicyliny-streptomycyny, aż osiągną 70% konfluencji.
   UWAGA: Komórki należy hodować w temperaturze 5% CO₂ i temperaturze 37 °C na 15 cm płytkach do hodowli tkankowych.
2. Po zrównoważeniu pleśni (sekcja 3) przygotuj RaSMC do wysiewu.
3. Przepłukać płytki dwukrotnie po 5 ml na płytkę soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
4. Dodaj 3 ml 0,25% trypsyny na 15 cm szalki Petriego. Przenieść płytki do inkubatora o temperaturze 37 °C na 2–3 minuty lub do momentu, gdy komórki oderwą się od płytki.
5. Zneutralizować trypsynę równą objętością (3 ml na płytkę) kompletnej pożywki hodowlanej. Dokładnie zawieś komórki, aby rozbić grudki.
6. Rozcieńczyć podwielokrotność zawiesiny komórkowej w stosunku 1:1 barwnikiem błękitu trypanowego i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
7. Odwirować całkowitą objętość zawiesiny komórek przez 5 minut przy 200 x g do osadzania komórek.
8. Ponowne zawieszenie komórek w stężeniu 10 milionów komórek na ml, co da 500 000 komórek na 50 μl.
   UWAGA: Różne typy komórek mogą wymagać różnych stężeń komórek.
9. Odessać całe podłoże z formy agarozy. Należy uważać, aby usunąć całe medium z poszczególnych studzienek, ale nie przebijać dna studzienek.
10. Odpipetować 50 μl zawiesiny do każdej studzienki.
11. Ostrożnie dodaj 2 ml świeżego podłoża wokół zewnętrznej strony formy agarozowej. Uważaj, aby pożywka nie przelała się do studzienek agarozy. Umieść płytki w inkubatorze na noc (około 16 godzin).
12. Po całonocnej inkubacji odessać pożywkę z zewnątrz form i dodać 4,5 ml świeżej pożywki do każdego dołka płytki 6-dołkowej, tak aby formy i pierścienie były całkowicie zanurzone. Zmieniaj medium codziennie.

Wyniki

Ten system pozwala na prostą, dostosowaną do potrzeb produkcję studzienek do wysiewu komórek agarozy, która umożliwia samodzielną organizację komórek w pierścieniowym druku 3D tissues. 3D, co pozwala na lepszą rozdzielczość i większą elastyczność w projektowaniu form niż obróbka poliwęglanu, gdzie wymiary są ograniczone dostępnymi rozmiarami narzędzi. Za pomocą drukarki 3D o wysokiej rozdzielczości można drukować ścianki o grubości zaledwie 0,254 mm, a wymiary koryta są ograniczone jedynie rozdzielczością drukarki (rozdzielczość 15,2 μm dla tych badań). Zazwyczaj frezy walcowo-czołowe CNC o średnicy mniejszej niż 0,3 mm nie są dostępne na rynku, więc nie jest możliwe tworzenie rynien o mniejszych szerokościach. Mikromielenie może wytwarzać mniejsze elementy, chociaż wymagany sprzęt może być zbyt drogi lub niedostępny dla wielu laboratoriów badań biomedycznych. Wymiary koryta i krzywizna są również ograniczone przez kształt końcówki frezu palcowego. Ponadto elementy takie jak kątowe lub stożkowe ścianki nie są możliwe, a małe elementy mogą ulec uszkodzeniu podczas procesu obróbki.

Rysunki CAD mogą być łatwo modyfikowane w celu uzyskania drukowanych w 3D form i negatywów PDMS o konfigurowalnych wymiarach. Rysunek 3 opisuje wymiary naszych obecnych form drukowanych w 3D na słupkach 2 mm, w porównaniu do poprzednich iteracji projektu. Proces jest niedrogi; 2-milimetrowa, 5-pierścieniowa forma wydrukowana w 3D kosztowała 44,67 USD za druk 3D, a każda część może być wykorzystana do stworzenia wielu negatywów PDMS. Do tej pory stworzyliśmy ponad 30 negatywów PDMS z jednej formy wydrukowanej w 3D. Każdy ujemny wymaga 25 g PDMS po 0,11 USD za g (2,75 USD za ujemny PDMS). Każdy negatyw PDMS może być czyszczony detergentem, sterylizowany w autoklawie i ponownie używany przez okres do kilku lat, w zależności od częstotliwości użytkowania. W porównaniu z oryginalnym projektem¹⁸, kompaktowa forma wydrukowana w 3D zużywa znacznie mniej PDMS i agarozy na 2 mm pierścień tkankowy (Rysunek 1E).

Komórki wysiane w zrównoważonych studzienkach agarozowych łączą się, tworząc pierścienie tkankowe w czasie krótszym niż 24 godziny. Wymiary pierścienia zależą od wymiarów dołków agarozowych. Tutaj wykazaliśmy, że samoorganizujące się pierścienie komórek mięśni gładkich szczurów mogą być wytwarzane w studzienkach ze słupkami o średnicy 2, 4 lub 12 mm (Rysunek 4). Podczas gdy pierścienie w tym badaniu były hodowane tylko przez 3 dni, wcześniej hodowaliśmy pierścienie hSMC przez okres do 2 tygodni²², a pierścienie chrząstki hMSC przez okres do 3 tygodni¹³. Jak wspomniano wcześniej, pierścienie mogą funkcjonować jako modele 3D in vitro tkanek ludzkich do ilościowej oceny funkcji tkanek ¹¹ i wytrzymałości mechanicznej^13,22, a także mogą służyć jako modułowe jednostki konstrukcyjne do generowania konstruktów tkankowych w kształcie rurki^7,13. Warunki wysiewu komórek i atrybuty funkcjonalne pierścieni tkankowych zaprojektowanych z tych typów komórek podsumowano w Tabeli 1.

Rysunek 1: Projekty form z poliwęglanu. Początkowo formy 15-dołkowe były obrabiane z poliwęglanu (A). Późniejsze wersje charakteryzowały się bardziej kompaktową konstrukcją (B), z 5 dołkami zaprojektowanymi tak, aby zmieściły się w jednej formie z poliwęglanu oraz w jednej studzience na płytce 6-dołkowej. Tutaj zmodyfikowaliśmy ten projekt, aby wykorzystać plastik drukowany w 3D jako bardziej konfigurowalną alternatywę dla obrabianego poliwęglanu (C). Pokazane w (D) są studzienki agarozowe wykonane z początkowego projektu¹⁸ (po lewej) w porównaniu z obecną kompaktową konstrukcją (po prawej), która wymaga znacznie mniej agarozy i nie wymaga ręcznego oddzielania studzienek. Ilości PDMS i agarozy wymagane dla każdej iteracji projektu przedstawiono w (E). Słupki środkowe mają średnicę 2 mm. Forma w (A) ma 6 cm x 12 cm, (B) ma średnicę 5 cm, a (C) ma średnicę 6 cm. Podziałka w (D) = 3 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wytwarzanie samoorganizujących się pierścieni tkankowych. Wydrukowana w 3D forma służy do odlewania negatywu PDMS, który jest następnie używany do odlewania studzienek agarozowych (A). Komórki są następnie wysiewane bezpośrednio do studzienek agarozowych, gdzie agregują się w czasie krótszym niż 24 godziny, tworząc pierścienie tkankowe (B). Linie przerywane w (B) pokazują kontur studni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przekrój poprzeczny rysunku CAD formy wydrukowanej w 3D. Pokazano wymiary szerokości koryta (A), wysokości koryta (B), otworu środkowego (C), średnicy całkowitej (D), krawędzi zewnętrznej (E) i wysokości ściany zewnętrznej (F). Ściany zewnętrzne (1), górna część studzienek (2) i otwór środkowy (3) są zwężane (pod kątem 5 ° dla 1 i 3, 45 ° dla 2), aby ułatwić usuwanie ujemnych PDMS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Rysunki CAD z odpowiednimi negatywami PDMS i samodzielnie zmontowanymi pierścieniami SMC o średnicach słupków 2 (A), 4 (B) i 12 (C) mm. W (A), (1) oznacza wycięcie zapewniające orientację, (2) wskazuje centralny otwór poprawiający perfuzję, (3) jest numerem pliku, który odciska się bezpośrednio na negatywach PDMS, oraz (4) pokazuje zewnętrzną ściankę, która jest zwężana, aby ułatwić usuwanie negatywów PDMS. Podziałka w studzienkach agarozowych = 1 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Typ komórki	Komórki wysiane na pierścień	Średnica pierścienia	Czas trwania kultury	Przeprowadzona analiza funkcjonalna
Szczur SMC	0,5, 1 lub 3 x 106	2, 4 lub 12 mm	3 dni	Aktualne badanie; N/a
Klasa SMC="xref">11	0,6 x 106	2 mm	17 dni	Badanie kurczliwości, jednoosiowa próba rozciągania, analiza histologiczna
Ludzka klasa SMC22	0,4 x 106	2 mm	2, 7 lub 14 dni	Jednoosiowa próba rozciągania, analiza histologiczna
Człowiek MSC14	0,4 x 106	2 mm	21 dni	Jednoosiowa próba rozciągania, analiza histologiczna, próba złączenia pierścienia i próba ściskania rurki, różnicowanie w tkankę chrzęstną

Tabela 1: Numery komórek wymagane do produkcji pierścieni z różnych typów komórek.

Dyskusja

Tutaj przedstawiliśmy wszechstronną metodę szybkiego wytwarzania samodzielnie składających się pierścieni tkankowych o łatwych do dostosowania wymiarach za pomocą druku 3D. Nasza metoda jest podobna do tej opisanej w Svoronos et al. ⁶, gdzie wydrukowane w 3D formy woskowe o strukturze plastra miodu i psiej kości zostały użyte do odlewania negatywów PDMS. Jednak formy zostały zmodyfikowane tak, aby zawierały kilka unikalnych cech konstrukcyjnych. Wycięcie (Rysunek 4A(1)) zapewnia orientację formy, aby umożliwić indywidualne etykietowanie i monitorowanie każdego pierścienia. Centralny otwór (Rysunek 4A(2)) pomaga poprawić dyfuzję medium do studzienek. Numery plików CAD są drukowane bezpośrednio na formie; dlatego negatywy PDMS są oznaczone numerem wersji i średnicą słupka (Rysunek 4A3). Zwężające się ścianki zewnętrzne (Rysunek 3(1), 5 °), w górnej części koryt studni (Rysunek 3(2), 45 °) i otwór środkowy (Rysunek 3(3), 5 °) ułatwiają usuwanie negatywów PDMS z form wydrukowanych w 3D, a studzienki agarozowe są łatwiejsze do usunięcia z negatywów PDMS (Rysunek 4A(2), A(4)).

Wykazaliśmy wszechstronność tego systemu, wytwarzając samoorganizujące się tkanki w kształcie pierścienia o różnych średnicach i typach komórek, w tym pierwotne ludzkie komórki mięśni gładkich (SMC)^18,22, SMC aorty szczura ^7,23, ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC)¹³ i SMC pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)¹¹ (Tabela 1). W trwających pracach oceniamy tworzenie pierścieni z dodatkowych typów komórek, takich jak komórki śródbłonka, oraz łączenie pierścieni chrzęstnych o różnych rozmiarach do potencjalnych zastosowań w wymianie tchawicy. Oprócz konstruktów całkowicie pochodzących z komórek, wykorzystaliśmy również ten system do wytwarzania pierścieni z wbudowanymi usieciowanymi mikrosferami żelatynowymi ^13,22. Mikrosfery mogą być włączane do pierścieni tkankowych podczas samoorganizacji, aby zapewnić dodatkową wytrzymałość mechaniczną lub w celu miejscowego dostarczania czynników wzrostu^13,22.

Podczas wytwarzania pierścieni tkankowych może być wymagana optymalizacja liczby komórek dla różnych typów komórek. Minimalna liczba komórek może się różnić w zależności od rozmiaru i typu komórek. Na przykład hSMC pochodzące z iPSC są wysiewane w 600 000 komórek/pierścień¹¹, hMSC i pierwotne hSMC są wysiewane w 400 000 komórek/pierścień^13,22, a SMC aorty szczura są wysiewane w 500 000 komórek/pierścień¹⁸. Wymiary koryta mogą również wpływać na tworzenie pierścieni i minimalną liczbę komórek wymaganych do tworzenia pierścieni²⁴. Do badań z komórkami ludzkimi i formami wydrukowanymi w 3D użyto koryta o szerokości 2 mm. Oryginalne formy z poliwęglanu miały szerokość koryta 3,75 mm, co wymagało 750 000 hSMC do utworzenia pierścienia ogniw o średnicy 2 mm¹⁸. Dzięki zmniejszonej szerokości rynny byliśmy w stanie zmniejszyć liczbę komórek niezbędnych do tworzenia pierścieni o 46%, do 400 000 komórek na pierścień²⁵. Ilości komórek wysiewanych na pierścień podsumowano w tabeli 1.

Wybierając materiał drukowany w 3D, należy wziąć pod uwagę wiele czynników. Ponieważ PDMS jest zwykle utwardzany w temperaturze 60 °C, materiał wydrukowany w 3D musi mieć wystarczająco wysoką temperaturę topnienia, aby uniknąć uszkodzenia podczas utwardzania PDMS. Temperatura topnienia materiału użytego w tym badaniu (materiał zastrzeżony, patrz Tabela materiałów) nie jest dostępna. Jednak po pieczeniu w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę zaobserwowaliśmy, że materiał zaczął wydzielać nieprzyjemny zapach. Dlatego zdecydowaliśmy się obniżyć temperaturę utwardzania do 50 °C i wydłużyć czas utwardzania, aby upiec PDMS bez uszkadzania materiału wydrukowanego w 3D. Korekta czasu utwardzania może być konieczna, jeśli formy są modyfikowane w celu utworzenia większych negatywów PDMS. Dodatkowy okres utwardzania w temperaturze 60 °C po usunięciu PDMS z form wydrukowanych w 3D zapobiega pozostaniu lepkości końcowego negatywu PDMS, jednocześnie ograniczając temperaturę, na którą narażona jest forma wydrukowana w 3D. Należy pamiętać, że niektóre materiały hamują utwardzanie PDMS, więc upewnij się, że wybrany materiał jest kompatybilny z PDMS. Na koniec należy również wziąć pod uwagę toksyczność materiału formy. Chociaż forma wydrukowana w 3D nie będzie w bezpośrednim kontakcie z komórkami, możliwe jest, że niektóre pozostałości z formy mogą zostać przeniesione do negatywu PDMS podczas procedury utwardzania. Stwierdziliśmy, że bardzo dokładne mycie detergentem było wystarczające, aby usunąć wszelkie pozostałości po ujemnym PDMS. Jednak wcześniej zaobserwowaliśmy, że nieodpowiednie mycie prowadziło do słabego tworzenia pierścieni w studzienkach agarozowych przy pierwszych kilku zastosowaniach PDMS negatyw. Użycie PDMS odlewanego z innych materiałów drukowanych w 3D może wymagać dodatkowych badań w celu sprawdzenia, czy detergent jest wystarczający do usunięcia pozostałości pleśni, w tym wszelkich potencjalnych odcieków. Konieczne mogą być również okresowe testy, ponieważ możliwe jest, że powtarzające się cykle nagrzewania (nawet do 50 °C) mogą z czasem uszkodzić formę i spowodować wzrost pozostałości po wielokrotnym użyciu. Do tej pory użyliśmy jednej formy wydrukowanej w 3D do wyprodukowania ponad 30 negatywów PDMS, które zostały wykorzystane do skutecznego generowania pierścieni tkankowych.

Ogólnie rzecz biorąc, druk 3D pozwala na większą wszechstronność w wytwarzaniu form agarozowych niż obróbka poliwęglanu. Zapewnia wyższą rozdzielczość niż jest to możliwe w przypadku oprzyrządowania, a konstrukcja formy nie jest ograniczona wymiarami dostępnych narzędzi. Pozwala to na większą personalizację i dodanie funkcji, takich jak zwężanie się, które mogą nie być możliwe w przypadku obróbki skrawaniem. System ten może być stosowany również do wytwarzania samodzielnie składających się tkanek w innych kształtach, oprócz pierścieni ^6,17. Korzystając z metody wytwarzania pierścieni, opracowaliśmy pierścienie tkankowe z różnych typów i rozmiarów komórek do potencjalnych zastosowań w inżynierii tkankowej tchawicy¹³, inżynierii naczyń krwionośnych⁷ i modelowaniu chorób naczyniowych¹¹.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
SeaKem LE Agarose	Lonza	50040
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
DMEM	Corning Cellgro	15-017-CV
VeroWhite	StrataSys	RGD835
Drukarka 3D	StrataSys	Objet 260 Connex
DMEM	Corning Cellgro	15-017-CV
FBS	Thermo Fisher	16000069
L-glutamina	Corning Cellgro	25-015-CI
Aminokwasy endogenne	Corning Cellgro	25-025-CI
Pirogronian sodu	Corning Cellgro	25-000-CI
Paciorkowiec	Corning Cellgro	30-002-CI
Trypsyna	Corning Cellgro	25-053-CI
Trypan niebieski	Corning Cellgro	25-900-CI
PBS	Lonza	17-516F
6-dołkowa płytka	Corning	353046
WKY 3M-22 szczurze komórki mięśni gładkich aorty	Dostarczone przez T. Wight [ref 21]	N/A