Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie niestandardowych studzienek agarozowych do wysiewu komórek i samomontażu pierścieni tkankowych przy użyciu form drukowanych w 3D

13.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56618

⸱

2 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, 2Gladstone Institute for Cardiovascular Disease

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje platformę do produkcji samodzielnie składających się pierścieni tkankowych w różnych rozmiarach przy użyciu dostosowanej formy z tworzywa sztucznego wydrukowanej w 3D. Negatywy PDMS są utwardzane w formie wydrukowanej w 3D; następnie agaroza jest odlewana w utwardzonych negatywach PDMS. Komórki są wysiewane do powstałych studzienek agarozowych, gdzie agregują się w pierścienie tkankowe.

Streszczenie

Zmodyfikowane tkanki są wykorzystywane klinicznie do naprawy i wymiany tkanek, a także są rozwijane jako narzędzia do badań przesiewowych leków i modelowania chorób ludzkich. Samoorganizujące się tkanki mają zalety w porównaniu z inżynierią tkankową opartą na rusztowaniach, takie jak lepsze osadzanie matrycy, wytrzymałość i funkcjonalność. Istnieje jednak kilka dostępnych metod wytwarzania tkanek 3D bez wysiewania komórek na rusztowaniu nośnym lub w jego obrębie. Wcześniej opracowaliśmy system do wytwarzania samoorganizujących się pierścieni tkankowych poprzez wysiewanie komórek do nieprzywierających studzienek agarozowych. Negatyw polidimetylosiloksanu (PDMS) został najpierw odlany w obrobionej maszynowo formie poliwęglanowej, a następnie agaroza została zżelowana w negatywie PDMS w celu stworzenia studzienek do wysiewu komórek w kształcie pierścienia. Wszechstronność tego podejścia była jednak ograniczona przez rozdzielczość dostępnych narzędzi do obróbki formy poliwęglanowej. Tutaj pokazujemy, że plastik drukowany w 3D może być używany jako alternatywa dla obrabianego maszynowo poliwęglanu do produkcji negatywów PDMS. Wydrukowana w 3D forma i zmieniony projekt formy są prostsze w użyciu, niedrogie w produkcji i wymagają znacznie mniej agarozy i PDMS na studnię wysiewu komórek. Wykazaliśmy, że powstałe dołki agarozowe można wykorzystać do tworzenia samoorganizujących się pierścieni tkankowych o niestandardowych średnicach z wielu różnych typów komórek. Pierścienie mogą być następnie używane do analizy mechanicznej, funkcjonalnej i histologicznej lub do wytwarzania większych i bardziej złożonych tkanek rurkowych.

Wprowadzenie

Metody samoorganizacji komórkowej do wytwarzania naczyń krwionośnych z inżynierii tkankowej są alternatywą dla metod opartych na rusztowaniach. Samoorganizujące się, wolne od rusztowań tkanki mogą mieć większą gęstość komórek, lepsze osadzanie i wytrzymałość matrycy oraz lepszą funkcję biologiczną w porównaniu z tkankami opartymi na rusztowaniach1,2,3,4. Wyzwaniem pozostaje jednak formowanie tkanek 3D bez użycia egzogennego podłoża rusztowania o określonych rozmiarach i kształtach. Niektóre metody łączą ze sobą warstwy arkuszy komórek, tworząc grubsze konstrukcje, chociaż proces ten może być czasochłonny i pracochłonny5. Alternatywnie, komórki można umieścić w nieprzywierającej formie i pozwolić na agregację w sferoidy, pierścienie i inne kształty tkanek6,7,8.

Samoorganizujące się pierścienie tkankowe wymagają mniejszej liczby komórek, krótszych czasów hodowli i mniejszej ilości odczynników niż większe tkanki rurkowe, ale nadal mogą być testowane mechanicznie, histologicznie lub używane do kurczliwości i innych testów funkcjonalnych7,9,10,11. Ze względu na to, że można je szybko wyprodukować i łatwo przetestować, pierścienie tkankowe są idealne do badania przesiewowego dużej liczby parametrów hodowli i mają potencjał do wykorzystania jako modele chorób11 lub narzędzia do badań przesiewowych leków12. Dodatkowo, pierścienie mogą być łączone w bardziej złożone struktury tkankowe, takie jak naczynia krwionośne lub tchawica7,13, a pierścienie mogą łączyć się pełniej niż inne kształty, takie jak sferoidy14,15.

Agaroza jest szeroko stosowana jako materiał do produkcji samodzielnie składających się tkanek ze względu na jej biokompatybilność, przepuszczalność i właściwości adhezyjne niekomórkowe. Na przykład Norotte i in. wytwarzali formy agarozowe z wytłaczanych prętów, co umożliwiało ograniczoną kontrolę nad kształtem formy i wymagało specjalistycznego sprzętu15. Tan i wsp. zdeponowali kropelki alginianu jako jednostki budulcowe do wytwarzania niestandardowych form hydrożelowych w różnych kształtach (piramida, kwadrat)16. Jednak duża średnica sferoid alginianowych (300 μm) skutkowała uzyskaniem cech o niskiej rozdzielczości. Tak niska rozdzielczość może skutkować nierównymi powierzchniami formy, które mogą niekorzystnie wpływać na spójność agregacji komórek. Alternatywnie, agaroza może być odlewana w negatywy polimerowe, aby stworzyć nieprzylepne formy o gładkich cechach i określonych wymiarach6,7,17.

Wcześniej informowaliśmy o systemie do wytwarzania niestandardowych pierścieniowych studni do wysiewu komórek agarozy z ujemnego odlewu PDMS w zmielonej formie z poliwęglanu7,18. Agarozę wlano do negatywu PDMS i pozwolono ustawić7,18. Komórki zostały następnie wysiane w studzienkach agarozowych, gdzie agregowały się, tworząc samoorganizujące się, wolne od rusztowań pierścienie tkankowe w czasie krótszym niż 24 godziny7,18. Negatywy PDMS można sterylizować w autoklawie, można ich używać wielokrotnie, są miękkie i elastyczne, co ułatwia usuwanie zestalonych studzienek agarozowych. Kiedy ten system został po raz pierwszy opisany w Gwyther et al.7, negatywy PDMS zostały odlane z frezowanych form poliwęglanowych (Rysunek 1A). Po odlaniu agarozy, dołki do wysiewu komórek zostały indywidualnie wycięte i umieszczone w studzienkach 12-dołkowej płytki7,18. Projekt został niedawno zmodyfikowany w taki sposób, że pojedyncza forma agarozy wytwarza 5 pierścieni i mieści się w studzience na płytce 6-dołkowej, eliminując potrzebę wycinania pojedynczych dołków i zmniejszając ilość PDMS i agarozy wymaganych do wytworzenia każdego pierścienia (Rysunek 1B). Zastosowano mniejszą szerokość koryta wysiewu komórek, aby zmniejszyć liczbę wysiewanych komórek wymaganych do uzyskania pierścienia. Pomimo tych zmian, rozdzielczość i dostosowywanie form były ograniczone do dostępnych standardowych wymiarów frezów walcowo-czołowych, a mikrofrezowanie może być zbyt drogie. Ponadto obróbka sterowana numerycznie (CNC) może być czasochłonna i kłopotliwa ze względu na konieczność zarezerwowania czasu na intensywnie wykorzystywany sprzęt niestandardowy, dodatkowe oprogramowanie do produkcji wspomaganej komputerowo (CAM) do konwersji pliku projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) na programowalną ścieżkę narzędzia oraz niezawodne mocowanie części z poliwęglanu podczas obróbki.

W niniejszym badaniu zbadaliśmy wykorzystanie druku 3D jako alternatywy dla CNC, machining. 3D drukowanie jest szeroko stosowane do inżynierii niestandardowych implantów, wytwarzania materiałów na rusztowania oraz do bezpośredniego drukowania komórek i sferoidów tkanek15,19,20. Użyliśmy drukarki 3D o wysokiej rozdzielczości oraz specjalistycznego materiału do druku 3D, który umożliwił nam wydrukowanie sztywnej formy o gładkim, błyszczącym wykończeniu powierzchni (patrz Tabela Materiałów). Nasza technika pozwala na wytwarzanie wysoce konfigurowalnych form z tworzywa sztucznego o wysokiej rozdzielczości, które można wykorzystać do odlewania negatywów PDMS i studni agarozowych. Iteracje projektu są podsumowane w Rysunek 1. Konstrukcja formy została dodatkowo zmodyfikowana w wersji formy wydrukowanej w 3D, aby uwzględnić zwężające się ścianki zewnętrzne i otwór środkowy, aby ułatwić usuwanie zarówno negatywów PDMS z form drukowanych w 3D, jak i studzienek agarozowych z negatywów PDMS. Tych stożkowych cech nie można osiągnąć przy użyciu standardowych procesów obróbki. Odległość od dna studzienek do dna formy została zwiększona w tej iteracji, co spowodowało grubszą podstawę agarozy poniżej słupków, aby zmniejszyć ryzyko pęknięcia słupków podczas usuwania studni agarozowej. Procedura wytwarzania formy i pierścienia jest pokazana schematycznie w Rysunek 2.

Protokół

1. Przygotowanie formy wydrukowanej w 3D

  1. Przygotuj rysunek CAD formy w żądanych wymiarach.
  2. Wyślij plik CAD do drukarki 3D o wysokiej rozdzielczości. Wybierz odpowiedni plastikowy materiał drukarski z błyszczącym wykończeniem.
  3. Po wydrukowaniu dokładnie umyj formę detergentem i wodą.

2. Rzutowanie negatywów PDMS

  1. Zmierz żądaną ilość podstawy PDMS na wadze. W przypadku formy o średnicy 60 mm i wkładkach studzienkowych 2 mm użyj 25 g.
  2. Dodaj utwardzacz w stosunku 1:10 (w/w) do bazy PDMS.
  3. Mieszaj energicznie, aż oba składniki dokładnie się połączą. Niewystarczające wymieszanie może spowodować niepełne utwardzenie PDMS, co spowoduje "lepką" powierzchnię.
  4. Umieść kawałek taśmy laboratoryjnej wokół granicy form wydrukowanych w 3D, aby umożliwić utworzenie warstwy bazowej PDMS nad wydrukowanymi studzienkami.
  5. Wlej mieszaninę PDMS do formy i umieść formę w komorze próżniowej, aby odgazować, aż wszystkie pęcherzyki zostaną uwolnione.
  6. Utwardzać PDMS w temperaturze 50 °C przez 2–4 godziny lub do momentu, gdy zestalą się na tyle, aby można je było usunąć.
  7. Usuń taśmę laboratoryjną i ostrożnie wyjmij negatyw PDMS.
  8. Inkubuj PDMS w temperaturze 60 °C przez dodatkową 1 godzinę (po wyjęciu z formy wydrukowanej w 3D), aby upewnić się, że pleśń jest w pełni utwardzona.
  9. Dokładnie umyj PDMS detergentem i wodą, aby usunąć wszelkie pozostałości. Niewystarczające mycie może skutkować słabym tworzeniem pierścienia przy pierwszych zastosowaniach PDMS negative.

3. Wytwarzanie studni agarozowych

  1. Przygotuj dołki agarozowe 1 dzień przed wysiewem komórek.
  2. Przygotować 2% (w/v) roztwór agarozy w DMEM i autoklawie.
  3. Odpipetować 4 ml stopionej agarozy do autoklawizowanego ujemnego PDMS. Następnie pipetuj agarozę bezpośrednio do słupków negatywów PDMS. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą końcówki pipety, ponieważ pęcherzyki mogą powodować niejednorodności w wymiarach studzienki.
  4. UWAGA: Nie przepełniaj form; górna powierzchnia agarozy musi być płaska, tak aby studzienki agarozowe były wypoziomowane po wyjęciu z PDMS i umieszczeniu na 6-dołkowych płytkach hodowlanych. Resztki agarozy można ponownie sterylizować w autoklawie i ponownie wykorzystać, jednak nie więcej niż raz.
  5. Po ostygnięciu agarozy (około 10 minut na 4 ml agarozy; większe formy mogą wymagać dłuższego czasu chłodzenia), ostrożnie oddziel dołki agarozowe od negatywów PDMS za pomocą kleszczy i przenieś do studzienki na 6-dołkowej płytce.
  6. Zanurzyć studzienki agarozowe w kompletnej pożywce hodowlanej i zrównoważyć przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C przed użyciem.

4. Pierścienie tkankowe do wysiewu

  1. Hodowla komórek mięśni gładkich aorty szczura21 (RaSMC) w DMEM zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% L-glutaminy, 1% aminokwasów endogennych, 1% pirogronianu sodu i 1% penicyliny-streptomycyny, aż osiągną 70% konfluencji.
    UWAGA: Komórki należy hodować w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C na 15 cm płytkach do hodowli tkankowych.
  2. Po zrównoważeniu pleśni (sekcja 3) przygotuj RaSMC do wysiewu.
  3. Przepłukać płytki dwukrotnie po 5 ml na płytkę soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  4. Dodaj 3 ml 0,25% trypsyny na 15 cm szalki Petriego. Przenieść płytki do inkubatora o temperaturze 37 °C na 2–3 minuty lub do momentu, gdy komórki oderwą się od płytki.
  5. Zneutralizować trypsynę równą objętością (3 ml na płytkę) kompletnej pożywki hodowlanej. Dokładnie zawieś komórki, aby rozbić grudki.
  6. Rozcieńczyć podwielokrotność zawiesiny komórkowej w stosunku 1:1 barwnikiem błękitu trypanowego i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
  7. Odwirować całkowitą objętość zawiesiny komórek przez 5 minut przy 200 x g do osadzania komórek.
  8. Ponowne zawieszenie komórek w stężeniu 10 milionów komórek na ml, co da 500 000 komórek na 50 μl.
    UWAGA: Różne typy komórek mogą wymagać różnych stężeń komórek.
  9. Odessać całe podłoże z formy agarozy. Należy uważać, aby usunąć całe medium z poszczególnych studzienek, ale nie przebijać dna studzienek.
  10. Odpipetować 50 μl zawiesiny do każdej studzienki.
  11. Ostrożnie dodaj 2 ml świeżego podłoża wokół zewnętrznej strony formy agarozowej. Uważaj, aby pożywka nie przelała się do studzienek agarozy. Umieść płytki w inkubatorze na noc (około 16 godzin).
  12. Po całonocnej inkubacji odessać pożywkę z zewnątrz form i dodać 4,5 ml świeżej pożywki do każdego dołka płytki 6-dołkowej, tak aby formy i pierścienie były całkowicie zanurzone. Zmieniaj medium codziennie.

Wyniki

System ten umożliwia prostą, spersonalizowaną fabrykację agarozowych dołków do wysiewu komórek, co pozwala na samozorganizację komórek w pierścieniowate tkanki 3D. Druk 3D zapewnia lepszą rozdzielczość i większą elastyczność w projektowaniu form niż obróbka poliwęglanu, gdzie wymiary są ograniczone dostępnymi rozmiarami narzędzi. Przy użyciu drukarki 3D o wysokiej rozdzielczości można wydrukować ścianki o grubości zaledwie 0,254 mm, a wymiary koryt ograniczona są jedynie rozdzielczością drukarki (rozdzielczość 15,2 µm w tych badaniach). Zazwyczaj frezy CNC o średnicy poniżej 0,3 mm nie są dostępne w sprzedaży, co uniemożliwia tworzenie koryt o mniejszej szerokości. Mikrofrezowanie pozwala na uzyskanie mniejszych detali, jednak wymagany sprzęt może być zaporowo drogi lub niedostępny dla wielu laboratoriów badań biomedycznych. Wymiary i krzywizna koryt są również ograniczone kształtem końcówki freza. Dodatkowo niemożliwe jest wykonanie takich elementów jak ścianki skośne lub stożkowe, a drobne detale mogą ulec uszkodzeniu podczas procesu obróbki.

Rysunki CAD można łatwo modyfikować w celu wytworzenia wydrukowanych w technologii 3D form oraz negatywów z PDMS o dostosowanych wymiarach. Rycina 3 przedstawia wymiary naszych obecnych form wydrukowanych w 3D z filarkami o średnicy 2 mm w porównaniu z poprzednimi wersjami projektu. Proces ten jest niedrogi; koszt wydruku 3D formy z 5 pierścieniami i filarkami 2 mm wyniósł 44,67 USD, a każda część może być wykorzystana do stworzenia wielu negatywów z PDMS. Do tej pory z jednej formy wydrukowanej w 3D stworzyliśmy ponad 30 negatywów z PDMS. Każdy negatyw wymaga 25 g PDMS w cenie 0,11 USD za g (2,75 USD za jeden negatyw z PDMS). Każdy negatyw z PDMS można przemyć detergentem, wysterylizować w autoklawie i ponownie wykorzystywać przez kilka lat, w zależności od częstotliwości użytkowania. W porównaniu z pierwotnym projektem18, kompaktowa forma wydrukowana w 3D zużywa znacznie mniej PDMS i agarozy na jeden 2 mm pierścień tkankowy (Rycina 1E).

Komórki wysiane w ustabilizowanych dołkach agarozowych agregują, tworząc pierścienie tkankowe w czasie krótszym niż 24 h. Wymiary pierścieni zależą od wymiarów dołków agarozowych. Tutaj wykazaliśmy, że samorzutnie organizujące się pierścienie z komórek mięśni gładkich szczura mogą być wytwarzane w dołkach z trzpieniami o średnicy 2, 4 lub 12 mm (Rysunek 4). Choć w niniejszym badaniu pierścienie hodowano jedynie przez 3 dni, wcześniej hodowaliśmy pierścienie hSMC do 2 tygodni22 oraz pierścienie hMSC-chrząstki do 3 tygodni13. Jak zgłoszono wcześniej, pierścienie mogą funkcjonować jako modele 3D in vitro tkanek ludzkich do ilościowej oceny funkcji tkanki11 i wytrzymałości mechanicznej13,22, a także mogą służyć jako modularne jednostki budulcowe do generowania rurkowatych konstruktów tkankowych7,13. Warunki wysiewu komórek oraz cechy funkcjonalne pierścieni tkankowych inżynieryjnie wytworzonych z tych typów komórek podsumowano w Tabeli 1.

Konfiguracja do produkcji płytek z dołkami; formy z poliwęglanu, drukowane w 3D, z PDMS; tabela materiałów, formatów.
Rysunek 1: Projekty form z poliwęglanu. Początkowo wykonano formy 15-dołkowe z poliwęglanu (A). Późniejsze wersje charakteryzowały się bardziej kompaktową konstrukcją (B), w której 5 dołków zostało zaprojektowanych tak, aby zmieścić się w jednej formie poliwęglanowej oraz w obrębie jednego dołka płytki 6-dołkowej. Tutaj zmodyfikowano tę konstrukcję, wykorzystując plastik drukowany w 3D jako bardziej konfigurowalną alternatywę dla poliwęglanu obrabianego mechanicznie (C). Na panelu (D) przedstawiono dołki agarowe wykonane według pierwotnego projektu18 (lewo) w porównaniu z obecnym kompaktowym projektem (prawo), który wymaga znacznie mniejszej ilości agaru i nie wymaga ręcznego oddzielania dołków. Ilości PDMS i agaru wymagane dla każdej iteracji projektu pokazano w (E). Środkowe słupki mają średnicę 2 mm. Forma w (A) ma wymiary 6 cm x 12 cm, (B) ma średnicę 5 cm, a (C) ma średnicę 6 cm. Pasek skali w (D) = 3 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat wykonania dołka w żelu agarozy i samoorganizujących się pierścieni; forma 3D, negatyw z PDMS, wysiew komórek.
Rycina 2: Wykonanie samoorganizujących się pierścieni tkankowych. Forma wydrukowana w technologii 3D służy do odlecia negatywu z PDMS, który następnie jest wykorzystywany do odlania dołków z agarozy (A). Następnie komórki są wysiewane bezpośrednio do dołków z agarozy, gdzie w czasie krótszym niż 24 h agregują, tworząc pierścienie tkankowe (B). Linie przerywane na rysunku (B) przedstawiają obrys dołka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat formy do mikropłytek; wymiary oznaczone A-F; zawiera formaty drukowane w 3D i z poliwęglanu.
Rycina 3: Przekrój rysunku CAD formy wydrukowanej w 3D. Przedstawiono wymiary szerokości rynien (A), wysokości rynien (B), otworu centralnego (C), całkowitej średnicy (D), zewnętrznego kołnierza (E) oraz wysokości zewnętrznej ścianki (F). Ścianki zewnętrzne (1), górna część studni (2) oraz otwór centralny (3) są zwężone (pod kątem 5 ° dla 1 i 3 oraz 45 ° dla 2), aby ułatwić usuwanie negatywu z PDMS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Schematy form wydrukowanych w 3D do odlewania PDMS, dołków agarozowych, pierścieni PBS. Wyniki eksperymentu mikroskopowego.
Rysunek 4: Rysunki CAD z odpowiadającymi im negatywami z PDMS oraz samozorganizowanymi pierścieniami SMC o średnicach słupków 2 (A), 4 (B) i 12 (C) mm. W (A) (1) oznacza wcięcie służące do orientacji, (2) oznacza otwór centralny w celu poprawy perfuzji, (3) to numer pliku, który jest odciskany bezpośrednio na negatywach z PDMS, a (4) pokazuje ścianę zewnętrzną, która jest zwężana, aby ułatwić usuwanie negatywu z PDMS. Paski skali w dołkach agarozowych = 1 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Typ komórkiLiczba komórek wysianych na pierścieńŚrednica pierścieniaCzas hodowliPrzeprowadzono analizę funkcjonalną
SMC szczura0,5, 1 lub 3 x 1062, 4 lub 12 mm3 dniNiniejsze badanie; N/D
SMC pochodzące z iPSC110,6 x 1062 mm17 dniBadanie kurczliwości, jednowymiarowy test rozciągania, analiza histologiczna
ludzkie SMC220,4 x 1062 mm2, 7 lub 14 dniJednoosiowa próba rozciągania, analiza histologiczna
Ludzkie MSC140,4 x 1062 mm21 dniJednoosiowa próba rozciągania, analiza histologiczna, testy zrostu pierścieni i ściskania rurek, różnicowanie w tkankę chrzęstną

Tabela 1: Liczba komórek wymagana do wytworzenia pierścieni z różnych typów komórek.

Dyskusja

Tutaj przedstawiliśmy wszechstronną metodę szybkiego wytwarzania samodzielnie składających się pierścieni tkankowych o łatwych do dostosowania wymiarach za pomocą druku 3D. Nasza metoda jest podobna do tej opisanej w Svoronos et al. 6, gdzie wydrukowane w 3D formy woskowe o strukturze plastra miodu i psiej kości zostały użyte do odlewania negatywów PDMS. Jednak formy zostały zmodyfikowane tak, aby zawierały kilka unikalnych cech konstrukcyjnych. Wycięcie (Rysunek 4A(1)) zapewnia orientację formy, aby umożliwić indywidualne etykietowanie i monitorowanie każdego pierścienia. Centralny otwór (Rysunek 4A(2)) pomaga poprawić dyfuzję medium do studzienek. Numery plików CAD są drukowane bezpośrednio na formie; dlatego negatywy PDMS są oznaczone numerem wersji i średnicą słupka (Rysunek 4A3). Zwężające się ścianki zewnętrzne (Rysunek 3(1), 5 °), w górnej części koryt studni (Rysunek 3(2), 45 °) i otwór środkowy (Rysunek 3(3), 5 °) ułatwiają usuwanie negatywów PDMS z form wydrukowanych w 3D, a studzienki agarozowe są łatwiejsze do usunięcia z negatywów PDMS (Rysunek 4A(2), A(4)).

Wykazaliśmy wszechstronność tego systemu, wytwarzając samoorganizujące się tkanki w kształcie pierścienia o różnych średnicach i typach komórek, w tym pierwotne ludzkie komórki mięśni gładkich (SMC)18,22, SMC aorty szczura 7,23, ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC)13 i SMC pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)11 (Tabela 1). W trwających pracach oceniamy tworzenie pierścieni z dodatkowych typów komórek, takich jak komórki śródbłonka, oraz łączenie pierścieni chrzęstnych o różnych rozmiarach do potencjalnych zastosowań w wymianie tchawicy. Oprócz konstruktów całkowicie pochodzących z komórek, wykorzystaliśmy również ten system do wytwarzania pierścieni z wbudowanymi usieciowanymi mikrosferami żelatynowymi 13,22. Mikrosfery mogą być włączane do pierścieni tkankowych podczas samoorganizacji, aby zapewnić dodatkową wytrzymałość mechaniczną lub w celu miejscowego dostarczania czynników wzrostu13,22.

Podczas wytwarzania pierścieni tkankowych może być wymagana optymalizacja liczby komórek dla różnych typów komórek. Minimalna liczba komórek może się różnić w zależności od rozmiaru i typu komórek. Na przykład hSMC pochodzące z iPSC są wysiewane w 600 000 komórek/pierścień11, hMSC i pierwotne hSMC są wysiewane w 400 000 komórek/pierścień13,22, a SMC aorty szczura są wysiewane w 500 000 komórek/pierścień18. Wymiary koryta mogą również wpływać na tworzenie pierścieni i minimalną liczbę komórek wymaganych do tworzenia pierścieni24. Do badań z komórkami ludzkimi i formami wydrukowanymi w 3D użyto koryta o szerokości 2 mm. Oryginalne formy z poliwęglanu miały szerokość koryta 3,75 mm, co wymagało 750 000 hSMC do utworzenia pierścienia ogniw o średnicy 2 mm18. Dzięki zmniejszonej szerokości rynny byliśmy w stanie zmniejszyć liczbę komórek niezbędnych do tworzenia pierścieni o 46%, do 400 000 komórek na pierścień25. Ilości komórek wysiewanych na pierścień podsumowano w tabeli 1.

Wybierając materiał drukowany w 3D, należy wziąć pod uwagę wiele czynników. Ponieważ PDMS jest zwykle utwardzany w temperaturze 60 °C, materiał wydrukowany w 3D musi mieć wystarczająco wysoką temperaturę topnienia, aby uniknąć uszkodzenia podczas utwardzania PDMS. Temperatura topnienia materiału użytego w tym badaniu (materiał zastrzeżony, patrz Tabela materiałów) nie jest dostępna. Jednak po pieczeniu w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę zaobserwowaliśmy, że materiał zaczął wydzielać nieprzyjemny zapach. Dlatego zdecydowaliśmy się obniżyć temperaturę utwardzania do 50 °C i wydłużyć czas utwardzania, aby upiec PDMS bez uszkadzania materiału wydrukowanego w 3D. Korekta czasu utwardzania może być konieczna, jeśli formy są modyfikowane w celu utworzenia większych negatywów PDMS. Dodatkowy okres utwardzania w temperaturze 60 °C po usunięciu PDMS z form wydrukowanych w 3D zapobiega pozostaniu lepkości końcowego negatywu PDMS, jednocześnie ograniczając temperaturę, na którą narażona jest forma wydrukowana w 3D. Należy pamiętać, że niektóre materiały hamują utwardzanie PDMS, więc upewnij się, że wybrany materiał jest kompatybilny z PDMS. Na koniec należy również wziąć pod uwagę toksyczność materiału formy. Chociaż forma wydrukowana w 3D nie będzie w bezpośrednim kontakcie z komórkami, możliwe jest, że niektóre pozostałości z formy mogą zostać przeniesione do negatywu PDMS podczas procedury utwardzania. Stwierdziliśmy, że bardzo dokładne mycie detergentem było wystarczające, aby usunąć wszelkie pozostałości po ujemnym PDMS. Jednak wcześniej zaobserwowaliśmy, że nieodpowiednie mycie prowadziło do słabego tworzenia pierścieni w studzienkach agarozowych przy pierwszych kilku zastosowaniach PDMS negatyw. Użycie PDMS odlewanego z innych materiałów drukowanych w 3D może wymagać dodatkowych badań w celu sprawdzenia, czy detergent jest wystarczający do usunięcia pozostałości pleśni, w tym wszelkich potencjalnych odcieków. Konieczne mogą być również okresowe testy, ponieważ możliwe jest, że powtarzające się cykle nagrzewania (nawet do 50 °C) mogą z czasem uszkodzić formę i spowodować wzrost pozostałości po wielokrotnym użyciu. Do tej pory użyliśmy jednej formy wydrukowanej w 3D do wyprodukowania ponad 30 negatywów PDMS, które zostały wykorzystane do skutecznego generowania pierścieni tkankowych.

Ogólnie rzecz biorąc, druk 3D pozwala na większą wszechstronność w wytwarzaniu form agarozowych niż obróbka poliwęglanu. Zapewnia wyższą rozdzielczość niż jest to możliwe w przypadku oprzyrządowania, a konstrukcja formy nie jest ograniczona wymiarami dostępnych narzędzi. Pozwala to na większą personalizację i dodanie funkcji, takich jak zwężanie się, które mogą nie być możliwe w przypadku obróbki skrawaniem. System ten może być stosowany również do wytwarzania samodzielnie składających się tkanek w innych kształtach, oprócz pierścieni 6,17. Korzystając z metody wytwarzania pierścieni, opracowaliśmy pierścienie tkankowe z różnych typów i rozmiarów komórek do potencjalnych zastosowań w inżynierii tkankowej tchawicy13, inżynierii naczyń krwionośnych7 i modelowaniu chorób naczyniowych11.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Serdecznie dziękujemy dr Erice Stults (Academic Research & Application Scientist, WPI Information Technology Services) za pomoc w druku 3D, Amandzie Zoë Reidinger, Ph.D., Chrisowi Nyczowi i Karen Levi, M.E., za ich wkład w projektowanie form, Kathy Suqui i Jennifer Mann za pomoc w testowaniu projektów form oraz Michaelowi O'Keefe za pomoc przy filmowaniu. Prace te były wspierane przez NSF IGERT DGE 1144804 (MWR, HAS), NIH R15 HL097332 (MWR, TAH), NSF REU EEC0754996 (BA), NIH 1R01 EB023907 (MWR, HAS) oraz NIH R15 HL137197 (MWR, HAS).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SeaKem LE AgaroseLonza50040
PDMSDow CorningSylgard 184
DMEMCorning Cellgro15-017-CV
VeroWhiteStrataSysRGD835
Drukarka 3DStrataSysObjet 260 Connex
DMEMCorning Cellgro15-017-CV
FBSThermo Fisher16000069
L-glutaminaCorning Cellgro25-015-CI
Aminokwasy endogenneCorning Cellgro25-025-CI
Pirogronian soduCorning Cellgro25-000-CI
PaciorkowiecCorning Cellgro30-002-CI
TrypsynaCorning Cellgro25-053-CI
Trypan niebieskiCorning Cellgro25-900-CI
PBSLonza17-516F
6-dołkowa płytkaCorning353046
WKY 3M-22 szczurze komórki mięśni gładkich aortyDostarczone przez T. Wight [ref 21]N/A

Bibliografia

  1. L'Heureux, N., Paquet, S., Labbe, R., Germain, L., Auger, F. A. A completely biological tissue-engineered human blood vessel. FASEB J. 12 (1), 47-56 (1998).
  2. Adebayo, O., Hookway, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. Self-assembled smooth muscle cell tissue rings exhibit greater tensile strength than cell-seeded fibrin or collagen gel rings. J Biomed Mater Res A. 101 (2), 428-437 (2013).
  3. Hayashi, K., Tabata, Y. Preparation of stem cell aggregates with gelatin microspheres to enhance biological functions. Acta Biomater. 7 (7), 2797-2803 (2011).
  4. Kelm, J. M., et al. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. J Biotechnol. 148 (1), 46-55 (2010).
  5. McAllister, T. N., et al. Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study. Lancet. 373, 1440-1446 (2009).
  6. Svoronos, A. A., Tejavibulya, N., Schell, J. Y., Shenoy, V. B., Morgan, J. R. Micro-mold design controls the 3D morphological evolution of self-assembling multicellular microtissues. Tissue Eng Part A. 20 (7-8), 1134-1144 (2014).
  7. Gwyther, T. A., et al. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).
  8. Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002(2011).
  9. Laterreur, V., et al. Comparison of the direct burst pressure and the ring tensile test methods for mechanical characterization of tissue-engineered vascular substitutes. J Mech Behav Biomed Mater. 34, 253-263 (2014).
  10. L'Heureux, N., et al. Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization. Nat Med. 12 (3), 361-365 (2006).
  11. Dash, B. C., et al. Tissue-Engineered Vascular Rings from Human iPSC-Derived Smooth Muscle Cells. Stem Cell Reports. 7 (1), 19-28 (2016).
  12. Heureux, N., et al. A human tissue-engineered vascular media: a new model for pharmacological studies of contractile responses. FASEB J. 15, 515-524 (2001).
  13. Dikina, A. D., Strobel, H. A., Lai, B. P., Rolle, M. W., Alsberg, E. Engineered cartilaginous tubes for tracheal tissue replacement via self-assembly and fusion of human mesenchymal stem cell constructs. Biomaterials. 52, 452-462 (2015).
  14. Twal, W. O., et al. Cellularized microcarriers as adhesive building blocks for fabrication of tubular tissue constructs. Ann Biomed Eng. 42 (7), 1470-1481 (2014).
  15. Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).
  16. Tan, Y., et al. 3D printing facilitated scaffold-free tissue unit fabrication. Biofabrication. 6 (2), 1-11 (2014).
  17. Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries. The FASEB Journal. 21 (14), 4005-4012 (2007).
  18. Gwyther, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. Directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering. J Vis Exp. (57), e3366(2011).
  19. Zhu, W., et al. 3D printing of functional biomaterials for tissue engineering. Curr Opin Biotechnol. 40, 103-112 (2016).
  20. Jakab, K., et al. Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 022001(2010).
  21. Lemire, J. M., Potter-Perigo, S., Hall, K. L., Wight, T. N., Schwartz, S. M. Distinct Rat Aortic Smooth Muscle Cells Differ in Versican/PG-M Expression. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (6), 821-829 (1996).
  22. Strobel, H. A., et al. Cellular self-assembly with microsphere incorporation for growth factor delivery within engineered vascular tissue rings. Tissue Eng Part A. 23 (3-4), 143-155 (2017).
  23. Strobel, H. A., Calamari, E. L., Beliveau, A., Jain, A., Rolle, M. W. Fabrication and characterization of electrospun polycaprolactone and gelatin composite cuffs for tissue engineered blood vessels. JBMR Part B. , In Press (2017).
  24. Napolitano, A. P., Chai, P., Dean, D. M., Morgan, J. R. Dynamics of the self-assembly of complex cellular aggregates on micromolded nonadhesive hydrogels. Tissue Eng. 13 (8), 2087-2094 (2007).
  25. Gwyther, T. Engineered Vascular Tissue Generated by Cellular Self-Assembly. , Worcester Polytechnic Institute. (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Formy drukowane w 3Dnegatyw z PDMSniestandardowe wymiarymodele tkanek naczyniowychanaliza mechanicznaanaliza histologicznaocena funkcjonalna
Wytwarzanie niestandardowych studzienek agarozowych do wysiewu komórek i samomontażu pierścieni tkankowych przy użyciu form drukowanych w 3D
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.