Artykuł metodologiczny

Elastyczny pomiar reporterów bioluminescencyjnych za pomocą zautomatyzowanego podłużnego obrazowania lucyferazy zoptymalizowanego pod kątem gazu i temperatury rejestratora (ALLIGATOR)

9.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56623

⸱

13 grudnia 2017

 ,  , 
1MRC Laboratory of Molecular Biology

W tym artykule

Podsumowanie

Genetycznie kodowana lucyferazy jest popularnym nieinwazyjnym raportem ekspresji genów. Zastosowanie zautomatyzowanego rejestratora ALLIGATOR do obrazowania podłużnego lucyferazy pod kątem gazu i temperatury umożliwia rejestrację podłużną komórek bioluminescencyjnych w szerokim zakresie warunków. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób ALLIGATOR może być stosowany w kontekście badań nad rytmami okołodobowymi.

Streszczenie

Oparte na lucyferazie reportery ekspresji genów komórkowych są powszechnie używane zarówno do badań podłużnych, jak i końcowych aktywności biologicznej. Na przykład w badaniach nad rytmami okołodobowymi fuzje genów zegarowych z lucyferazy świetlików powodują powstanie silnych rytmów w bioluminescencji komórkowej, które utrzymują się przez wiele dni. Ograniczenia techniczne związane z lampami fotopowielającymi (PMT) lub konwencjonalnymi metodami ilościowego oznaczania bioluminescencji opartymi na mikroskopii zazwyczaj wymagały, aby komórki i tkanki były utrzymywane w zupełnie niefizjologicznych warunkach podczas rejestracji, z kompromisem między czułością a przepustowością. W tym miejscu informujemy o udoskonaleniu wcześniejszych metod, które umożliwiają długoterminowe obrazowanie bioluminescencyjne z wysoką czułością i przepustowością, które obsługuje szeroki zakres warunków hodowli, w tym zmienną kontrolę gazu i wilgotności, i które akceptuje wiele różnych płytek i szalek do hodowli tkankowych. Ten zautomatyzowany podłużny rejestrator obrazowania lucyferazy zoptymalizowany pod kątem gazu i temperatury (ALLIGATOR) umożliwia również obserwację przestrzennych zmian w ekspresji lucyferazy w monowarstwie komórki lub tkance, których nie można łatwo zaobserwować tradycyjnymi metodami. Podkreślamy, w jaki sposób ALLIGATOR zapewnia znacznie większą elastyczność w wykrywaniu aktywności lucyferazy w porównaniu z istniejącymi metodami.

Wprowadzenie

Wykorzystanie lucyferazy jako reporterów ekspresji genów i aktywności białek stało się popularną techniką w badaniach biologii molekularnej i komórkowej. Jest to prawdą w dziedzinie okołodobowej, gdzie kinetyka syntezy lucyferazy świetlików i inaktywacji katalitycznej jest szczególnie dobrze dostosowana do zgłaszania podłużnych zmian w ekspresji genów, które zachodzą w ciągu około 24-godzinnego cyklu okołodobowego. W związku z tym lucyferazy są wykorzystywane jako reporter okołodobowy w szerokim zakresie organizmów, w tym grzybów, roślin, much i ssaków1,2,3,4.

Podczas ilościowego określania ekspresji genów okołodobowych in vitro, powszechnie używa się lampy fotopowielacza (PMT) do rejestrowania sygnału bioluminescencyjnego. Pomiary oparte na PMT mają jednak ograniczoną elastyczność, zwykle są ograniczone do wcześniej określonego rozmiaru talerza lub naczynia. Nie jest również możliwe zebranie żadnych informacji przestrzennych z próbek monitorowanych za pomocą PMT, co może prowadzić do utraty informacji podczas obrazowania próbek, które wykazują przestrzenną zmienność ekspresji lucyferazy. Ponadto, ponieważ PMT i związana z nim elektronika są podatne na awarie pod wpływem wilgotnego środowiska standardowego inkubatora do hodowli komórkowych, podłużny zapis lucyferazy za pomocą PMT jest zawsze wykonywany w inkubatorach nienawilżanych. W związku z tym szalki do hodowli komórkowych muszą być szczelnie zamknięte, aby zapobiec utracie wilgoci w wyniku parowania, a zatem pożywki hodowlane muszą być buforowane kwasem 3-(N-morfolino)propanosulfonowym (MOPS) lub kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES), a nie systemem buforowym CO2/wodorowęglan, który działa in vivo i jest rutynowo stosowany w hodowlach tkankowych ssaków.

W wyniku tych ograniczeń, pomiar bioluminescencji za pomocą PMT zazwyczaj nakłada ścisłe ograniczenia na warunki, w których komórki są utrzymywane podczas eksperymentów. Aby przezwyciężyć te problemy, a także zwiększyć zakres możliwych warunków eksperymentalnych, używamy standardowego inkubatora do hodowli tkankowych CO2/N2 170 L, który został dostosowany poprzez dodanie chłodzonej wodą kamery EMCCD z urządzeniem do namnażania elektronów z optyką przeciwmgielną i cyfrową kontrolą temperatury i poziomu gazów. Zostało to nazwane Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas and Temperature-Optimized Recorder (ALLIGATOR). ALLIGATOR pozwala na znaczne zwiększenie elastyczności obrazowania bioluminescencyjnego, zarówno w przypadku wysokoprzepustowego obrazowania standardowych płytek do hodowli tkankowych (do 6 x 96- lub 384-dołkowych płytek jednocześnie), jak i w przypadku niestandardowych systemów hodowli tkankowych, takich jak perfuzje komórek hodowanych w urządzeniach mikroprzepływowych. Przyrząd ten pozwala również na obrazowanie w wilgotnych warunkach i ze zmienną kontrolą ciśnienia parcjalnego CO2 i O2 oraz temperatury.

Poniższy protokół opisuje metodę bioluminescencyjnego zapisu systemów hodowli komórek i tkanek ssaków za pomocą ALLIGATORA (zwanego dalej 'inkubatorem bioluminescencji'). Należy jednak zauważyć, że system ten doskonale nadaje się do obrazowania bioluminescencyjnego, a także, z pewnymi modyfikacjami, obrazowania fluorescencyjnego, w wielu innych systemach i kontekstach biologicznych.

Protokół

1. Wysiewanie i synchronizacja temperaturowa komórek

UWAGA: Niniejszy protokół został rygorystycznie przetestowany z użyciem pierwotnych i unieśmiertelnionych fibroblastów mysich wykazujących ekspresję białka fuzyjnego PERIOD2::LUCIFERASE (PER2::LUC)4. W przypadku eksperymentów z wykorzystaniem innych linii komórkowych mogą być konieczne modyfikacje.

  1. Przed rozpoczęciem hodowli komórkowej umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C w celu ogrzania: roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) (pH 7.4), PBS uzupełniony o 0,68 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy, pH 7,2 (PBS+EDTA), odpowiednie pożywki do hodowli komórkowej, np. DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) uzupełnione o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 U/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny oraz 0,25% roztwór trypsyny.
  2. Rozcieńczyć trypsynę w stosunku 1:3 uprzednio ogrzanym roztworem PBS+EDTA i ponownie umieścić w kąpieli wodnej.
  3. Przygotować kolbę 125 cm2 z komórkami wykazującymi ekspresję lucyferazy o stopniu konfluencji 70-90%. Odessać pożywkę. Dodać 10 mL ogrzanego PBS.
  4. Odessać PBS. Dodać 2,5 mL ogrzanej trypsyny-EDTA i inkubować kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 5 min.
  5. Wyjąć komórki z inkubatora i obejrzeć pod mikroskopem. Gdy większość komórek oddzieli się od dna kolby, przejść do następnego kroku. Jeśli większość komórek pozostaje przytwierdzona do dna kolby, zwrócić ją do inkubatora, aż większość komórek znajdzie się w zawiesinie.
  6. Do kolby dodać kolejne 7,5 mL standardowej pożywki do hodowli komórkowej. Opcjonalnie można pobrać 1 mL tego roztworu do dalszego pasażowania komórek, jeśli jest to wymagane.
  7. Oznaczyć gęstość pozostałych komórek przy użyciu komory countingowej (hemocytometru) i błękitu trypanu. Rozcieńczyć komórki dalej, zgodnie z wymaganiami dla danej linii komórkowej.
    UWAGA: W poniższych eksperymentach fibroblasty PERIOD2::LUC wysiewano w zagęszczeniu od 6 x 103 komórek/cm2 do 1 x 104 komórek/cm2 w płytkach 96-dołkowych, naczyniach 35 mm lub szkiełkach z kanałami.
  8. Wysiać komórki na naczynia lub płytki do hodowli tkankowej, które będą wykorzystywane do rejestracji.
    UWAGA: Zaleca się stosowanie płytek z czarnymi ściankami i przezroczystym dnem, co pozwala na ocenę stanu hodowli przed rozpoczęciem pomiarów, jednocześnie ograniczając interferencję między dołkami podczas rejestracji. W przypadku bardzo niskich poziomów bioluminescencji należy używać białych naczyń/płytek w celu zmaksymalizowania detekcji światła, należy jednak pamiętać, że fosforescencja może prowadzić do zwiększenia sygnału tła, który utrzymuje się przez kilka godzin.
  9. Umieścić płytki w inkubatorze i pozwolić monowarstwom osiągnąć 100% konfluencji (około 7 dni).
    UWAGA: Po osiągnięciu konfluencji linie komórkowe wykazujące inhibicję kontaktową mogą być utrzymywane do trzech tygodni przed eksperymentem, pod warunkiem regularnej wymiany pożywki (co 5-7 dni).
  10. Po osiągnięciu konfluencji zsynchronizować rytmy komórkowe za pomocą cykli temperatury (12 h w 32 °C, 12 h w 37 °C) przez minimum 72 h bezpośrednio przed eksperymentem5,6 (używając zaprogramowanego inkubatora cyklicznego, sterowanego komputerem połączonym z inkubatorem przez port szeregowy RS-232).
    UWAGA: Liczba cykli temperatury wymagana do synchronizacji rytmów komórkowych może różnić się w zależności od linii komórkowej i może zatem wymagać optymalizacji dla innych linii. Wcześniej do synchronizacji rytmów komórkowych stosowano również ostrą stymulację farmakologiczną za pomocą forskoliny lub deksametazonu7,8.

2. Przygotowanie NS21

UWAGA: NS21 jest suplementem bezsurowiczym stosowanym do utrzymania kultur neuronów oraz innych typów komórek. Stanowi on udoskonaloną wersję podobnego suplementu znanego jako B27, który jest dostępny komercyjnie i może być stosowany jako zamiennik surowicy podczas rejestracji okołodobowej bioluminescencji9. Oba suplementy można stosować zamiennie w mediach do rejestracji w poniżej opisanych protokołach eksperymentalnych. Przygotowanie NS21 we własnym zakresie, zgodnie z metodą Chen et al.10 oraz opisem przedstawionym w niniejszym opracowaniu, jest w pełni wykonalne i efektywne kosztowo.

  1. Przed rozpoczęciem doprowadzić wszystkie komponenty opisane w Tabeli 1 do temperatury pokojowej, pozostawiając je w niej przez 1 h.
  2. Rozpuścić 50 g albuminy wołowej w 324 mL pożywki podstawowej (np. neurobasal) na lodzie. Mieszać mieszaninę w jak najmniejszym stopniu.
  3. Dodać wszystkie pozostałe komponenty, minimalnie mieszając po dodaniu każdego z nich, dbając jednocześnie o dokładne wymieszanie. Należy dążyć do rozpuszczenia wszystkich składników w ciągu 90 min od rozpoczęcia procesu.
  4. Rozdzielić końcową mieszaninę na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.
    UWAGA: Na tym etapie mieszanina jest zbyt lepka, aby ją filtrować, jednak zostanie poddana sterylnej filtracji po rozcieńczeniu pożywką przed dodaniem do komórek.

3. Przygotowanie nośników zapisu

UWAGA: Główną zaletą inkubatora do bioluminescencji w porównaniu z innym sprzętem do rejestrowania podłużnej bioluminescencji jest możliwość nawilżania inkubatora oraz zmiany ciśnień parcjalnych O2 i CO2, co pozwala na zastosowanie szerszego zakresu warunków pożywek do rejestracji bioluminescencji — w tym warunków, które dokładniej odwzorowują niszę fizjologiczną zajmowaną przez różne typy komórek in vivo. Poniżej opisujemy skład pożywek do rejestracji zaadaptowany z pracy Hastings et al.9, z których rutynowo korzystaliśmy w przypadku hodowli fibroblastów i innych typów komórek. Pierwsza z nich jest przeznaczona do warunków hodowli w zamknięciu (bez wymiany gazowej), a druga do warunków fizjologicznie istotnych i powinna być stosowana w warunkach nawilżonych z dodatkiem 5% CO2. W zależności od konkretnego zastosowania i typu komórek możliwe i zalecane są również wiele innych wariantów.

  1. Przygotowanie pożywki z wysoką zawartością glukozy buforowanej MOPS
    UWAGA: Roztwór zapasowy (1 L): proszek DMEM (8,3 g/L), 0,35 mg/mL wodorowęglanu sodu, 5 mg/mL glukozy, 0,02 M MOPS, 100 U/mL penicyliny, 100 µg/mL streptomycyny.
    1. Rozpuścić 8,3 g proszku DMEM w 900 mL wody ultrapurej w cylindrze mierniczym o pojemności 1 000 mL i mieszać przez 30 min, aż wszystkie cząsteczki zostaną rozpuszczone.
    2. Dodać 50 mL roztworu glukozy (100 g/L), 20 mL MOPS (1 M, pH 7,6), 10 mL 100-krotnego roztworu pen/strep i mieszać przez kolejne 10 min.
    3. Dodać 4,7 mL 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu i mieszać przez kolejne 5 min.
    4. Dostosować pH pożywki do 7,6 (w temperaturze pokojowej) lub 7,4 (37 °C) za pomocą HCl/NaOH.
    5. Dodać wodę ultrapurej do uzyskania końcowej objętości 1 000 mL.
    6. Sterylizować poprzez filtrację przez filtr 0,22 µm i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
    7. Przed rozpoczęciem eksperymentów odpowiednią objętość roztworu zapasowego uzupełnić o 10% surowicy, 2 mM L-alanylo-L-glutaminy, 2% NS21 i 1 mM lucyferyny, aby przygotować roztwór roboczy. Przepuścić ten roztwór przez sterylny filtr 0,22 µm.
    8. Zmierzyć osmolalność pożywki za pomocą osmometru.
      1. Włączyć osmometr.
      2. Zkalibrować osmometr, najpierw za pomocą wody ultrapurej. Dodać 50 µL wody na dno naczynia pomiarowego. Upewnić się, że w cieczy nie ma pęcherzyków powietrza. Zamocować naczynie nad sondą. Nacisnąć przycisk „Zero” i ostrożnie opuścić ramię osmometru do najniższego punktu. Poczekać do zakończenia odczytu i zapalenia się zielonej kontrolki „result” przed podniesieniem ramienia i wyjęciem naczynia.
      3. Powtórzyć czynność, aby skalibrować osmometr do 300 mOsmol/kg, używając 50 µL wzorca kalibracyjnego. Przed opuszczeniem ramienia nacisnąć przycisk „Cal”.
      4. Zmierzyć osmolalność próbki, dodając 50 µL pożywki na dno naczynia pomiarowego i wykonując pomiar jak wyżej. Przed opuszczeniem ramienia osmometru nacisnąć przycisk „sample”.
    9. Dostosować osmolalność do 350 mOsmol za pomocą 5 M NaCl.
  2. Przygotowanie pożywki z niską zawartością glukozy buforowanej HCO3 (pożywka perfuzyjna)
    UWAGA: Roztwór zapasowy (1 L): proszek DMEM (8,3 g/L), 3,7 mg/mL wodorowęglanu sodu, 1 mg/mL glukozy, 100 U/mL penicyliny, 100 µg/mL streptomycyny.
    1. Rozpuścić 8,3 g proszku DMEM w 900 mL wody ultrapurej w cylindrze mierniczym o pojemności 1 000 mL i mieszać przez 30 min, aż wszystkie cząsteczki zostaną rozpuszczone.
    2. Dodać 50 mL roztworu glukozy (100 g/L), 10 mL 100-krotnego roztworu pen/strep i mieszać przez kolejne 10 min.
    3. Dodać 49,4 mL 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu i mieszać przez kolejne 5 min.
    4. Dostosować pH pożywki do 7,6 (w temperaturze pokojowej) lub 7,4 (37 °C) za pomocą HCl/NaOH.
    5. Dodać wodę ultrapurej, aby uzyskać końcową objętość 1 000 mL.
    6. Przepuścić roztwór przez sterylny filtr 0,22 µm i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
    7. Przed rozpoczęciem eksperymentów odpowiednią objętość roztworu zapasowego uzupełnić o 2% surowicy, 2 mM L-alanylo-L-glutaminy, 2% NS21 i 1 mM lucyferyny, aby przygotować roztwór roboczy. Przepuścić ten roztwór przez sterylny filtr 0,22 µm.
    8. Zmierzyć i dostosować osmolalność do 350 mOsmol za pomocą 5 M NaCl, analogicznie jak w przypadku pożywki buforowanej MOPS.

UWAGA: Stężenie lucyferyny powinno zostać określone empirycznie dla każdego typu komórek i kontekstu. Dalsze informacje znajdują się w pracy Feeney et al.11 Stężenia surowicy i NS21 (lub B27, jeśli jest stosowany) mogą być zmienne w zależności od zastosowania. Zalecamy jednak, chyba że testy empiryczne wykażą inaczej, stosowanie surowicy i NS21 (lub alternatywnego suplementu bezzurowiczego), ponieważ wspomagają one przeżywalność i przyleganie komórek. W liniach komórkowych, które nie wykazują wyraźnego hamowania kontaktowego, może być konieczne obniżenie stężenia surowicy w mediach do rejestracji, aby zapobiec zakłócającemu wpływowi proliferacji, która jest również stymulowana przez surowicę.

4. Rejestracja

  1. Przed rozpoczęciem pomiaru umieść odpowiedni zapas pożywki roboczej (z kroku 3.1 lub 3.2, w zależności od eksperymentu) w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C w celu ogrzania.
  2. Podczas ogrzewania pożywki ustaw ostrość kamery w inkubatorze do bioluminescencji.
    1. Odkręć wodoodporny, podgrzewany filtr neutralnej gęstości i odłóż go na bok.
    2. Skonfiguruj oprogramowanie do nagrywania wideo z wysoką częstotliwością akwizycji. Kliknij „Acquisition | Acquisition Setup”. Ustaw „Exposure time” na 0,2 s oraz czas cyklu kinetycznego („kinetic cycle time”) na 0,3 sekundy. Upewnij się, że wzmocnienie EM („EM gain”) jest wyłączone.
    3. Zamknij okno „Acquisition Setup” i kliknij ikonę „take video”.
    4. Używając cylindra ostrzenia, obracaj obiektyw kamery, aż elementy na półce na wysokości rejestracji będą wyraźnie widoczne na wideo.
    5. Zatrzymaj nagrywanie wideo, klikając ikonę „stop video”.
    6. Przykręć podgrzewany filtr neutralnej gęstości z powrotem na miejsce; zaniechanie tego kroku spowoduje uszkodzenie kamery EM-CCD i/lub zaparowanie obiektywu w wyniku kondensacji.
  3. Ustaw poziom O2, CO2 oraz temperaturę na pożądane warunki eksperymentalne, korzystając z panelu sterowania na przedniej ściance inkubatora do bioluminescencji.
    UWAGA: W przypadku prowadzenia hodowli komórkowej perfuzyjnej należy na tym etapie przejść bezpośrednio do sekcji 5.
  4. Wyjmij komórki z inkubatora do hodowli tkankowej i odessij pożywkę. Zastąp pożywkę uprzednio ogrzanym zapasem roboczym.
  5. Jeśli inkubator do bioluminescencji nie ma być nawilżany podczas eksperymentu, szczelnie zamknij szalki i płytki za pomocą uszczelki nieprzepuszczającej gazów. Jeśli inkubator do bioluminescencji ma być nawilżany, uszczelnianie szalek nie jest ściśle wymagane, choć zaleca się uszczelnianie naczyń o małej objętości, takich jak płytki 96-dołkowe, za pomocą uszczelki przepuszczalnej dla gazów, ponieważ nawet w nawilżonych inkubatorach może nadal dochodzić do niewielkiego parowania.
    UWAGA: Nawilżanie odbywa się poprzez napełnienie tacy z wodą u podstawy inkubatora.
  6. Przenieś komórki do inkubatora do bioluminescencji, zamknij drzwi inkubatora i zabezpiecz pokrywę inkubatora, aby stworzyć szczelną barierę przed światłem.
  7. Wybierz parametry rejestracji odpowiednie dla zastosowania.
    1. Kliknij „Acquisition| Acquisition Setup”.
    2. W panelu „Camera Setup” ustaw: „Acquisition mode” na „Kinetic”; „Exposure time” na pożądany czas ekspozycji w sekundach (patrz uwaga poniżej); „Accumulations” na 1; „Kinetic Series length” na pożądaną liczbę cykli akwizycji; „Kinetic cycle time” na pożądany odstęp czasu między obrazami (upewnij się, że jest on większy niż czas ekspozycji); „Shift speed” na 4,33 µsecs; „Gain” na 1 oraz „EM gain” na pożądany poziom (patrz uwaga poniżej).
    3. W panelu „Autosave” ustaw typ pliku na .sif lub .tif. Podaj nazwę pliku i odpowiednią lokalizację zapisu.
    4. W panelu „Spooling” ustaw typ pliku na tiff. Podaj nazwę pliku i odpowiednią lokalizację zapisu. Zamknij okno konfiguracji akwizycji.
  8. Rozpocznij rejestrację, klikając przycisk „take signal”.
    UWAGA: Ponieważ inkubator do bioluminescencji może być używany dla wielu różnych typów komórek i tkanek, z których każda będzie miała inny poziom bioluminescencji, czas ekspozycji wymagany do zebrania odpowiedniego sygnału bioluminescencyjnego będzie różnić się w zależności od eksperymentu. Można również zmieniać wzmocnienie elektronomnożne (EM) obrazowania w celu zwiększenia amplitudy zebranego sygnału. W przypadku nowych zastosowań o nieznanej jasności sugerujemy najpierw wykonanie pojedynczego obrazu z relatywnie krótkim czasem ekspozycji (około 10 min) bez wzmocnienia EM, a następnie regulowanie zarówno czasu ekspozycji, jak i wzmocnienia EM, aż do osiągnięcia pożądanych warunków rejestracji. W większości przypadków dobrym celem jest średni sygnał wynoszący 10-20% maksymalnej możliwej intensywności piksela dla danej kamery. Po ustaleniu odpowiedniego zestawu parametrów rejestracji rozpocznij podłużną akwizycję obrazów, zgodnie z powyższym opisem.

5. Hodowla tkanek perfuzyjnych (opcjonalnie)

UWAGA: Jak opisano we wstępie, inkubator do bioluminescencji nadaje się do obrazowania niestandardowych systemów hodowli tkankowej. Przykładem tego jest opracowanie systemu do perfuzyjnej hodowli komórek.

  1. Wysiać komórki na szkiełka jednokanałowe z łącznikami Luer o głębokości kanału 0,6 lub 0,8 mm, w pożywce DMEM z 10% FBS oraz pen/strep, zgodnie z opisem w sekcji 1. Przygotować pożywkę perfuzyjną zgodnie z opisem w kroku 3.2.
  2. Przed rozpoczęciem rejestracji przygotować przewody dla wymaganego systemu perfuzji, używając przewodów ETFE o średnicy wewnętrznej (I.D.) 1 mm oraz przewodów silikonowych o średnicy wewnętrznej 1 mm, kolanek oraz męskich i żeńskich złączy Luer, jak pokazano na Rysunku 2A.
    UWAGA: Większość długości układu stanowią przewody ETFE, natomiast 2 cm odcinki przewodów silikonowych służą do połączenia przewodów ETFE ze złączami Luer, które następnie są łączone ze szkiełkami kanałowymi.
  3. Zasterylizować przewody, przepłukując je 70% etanolem, a następnie sterylnym PBS.
  4. Wyjąć hodowle komórkowe w szkiełkach kanałowych z inkubatora. Odessać pożywkę i zastąpić ją uprzednio ogrzaną pożywką perfuzyjną.
  5. Napełnić strzykawkę 20 mL uprzednio ogrzaną pożywką perfuzyjną.
  6. Podłączyć przewody do szkiełka buforowego (patrz Rysunek 2), ale nie do szkiełka z komórkami, a następnie przepłukać przewody i szkiełko pożywką perfuzyjną (3-5 mL).
  7. Podłączyć szkiełko z komórkami i przepłukać cały układ kolejnym 1 mL pożywki, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
  8. Przenieść cały układ do inkubatora do bioluminescencji.
  9. Zamocować napełnione pożywką strzykawki w pompie strzykawkowej bez odłączania ich od przewodów i przepłukać cały układ kolejnym 1 mL pożywki za pomocą pompy, aby upewnić się, że w systemie nie ma pęcherzyków powietrza.
  10. Ustawić w pompie średnicę odpowiadającą używanej strzykawce.
    UWAGA: Dla stosowanych tutaj strzykawek 20 mL średnica wynosi 19,13 mm.
  11. Ustawić szybkość przepływu pompy na 50 µL/h i uruchomić ją.
  12. Przed rozpoczęciem rejestracji upewnić się, że w szkiełkach i przewodach nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ ich przemieszczanie się nad monowarstwą komórek wpłynie na ekspresję lucyferazy. Jeśli to konieczne, przepłukać komórki większą ilością pożywki, aby osiągnąć ten stan.
  13. Zamknąć drzwi inkubatora do bioluminescencji i kontynuować zgodnie z krokiem 4.7, aby rozpocząć rejestrację.

6. Przebieg zabiegu podczas rejestracji

UWAGA: Czasami pożądane jest poddanie komórek działaniu czynników farmakologicznych lub hormonalnych w trakcie trwania pomiaru. W takich przypadkach niezbędna jest ostrożna manipulacja komórkami, aby zapobiec zresetowaniu oscylacji komórkowych podczas zabiegu. Z tego powodu szczególnie ważne jest utrzymywanie komórek w stałej temperaturze, ponieważ stanowi ona główny sygnał synchronizujący dla komórkowych rytmów okołodobowych5,6.

  1. Przygotuj wszystkie komponenty do zabiegu przed zatrzymaniem rejestracji.
  2. Przygotuj chemiczną podkładkę izotermiczną o temperaturze 37 °C.
  3. Zatrzymaj rejestrację urządzenia, wyjmij naczynia przeznaczone do obróbki i umieść je na izotermicznej podkładce grzewczej.
  4. Poddaj hodowle wymaganym zabiegom, a następnie przenieś je z powrotem do inkubatora bioluminescencyjnego w to samo miejsce, w którym znajdowały się wcześniej.
  5. Wznów rejestrację.

7. Analiza

UWAGA: Inkubator do bioluminescencji generuje dane w formie serii pojedynczych obrazów. Do zarządzania tymi obrazami wykorzystujemy głównie program Fiji12, a następnie eksportujemy dane dotyczące średniej intensywności pikseli dla każdego obszaru zainteresowania (ROI) w celu przeprowadzenia dalszej analizy.

  1. Otwórz stos obrazów w programie Fiji i dostosuj jasność oraz kontrast, klikając „Image| Adjust| Brightness/Contrast” i przesuwając suwaki, aż obrazy znajdą się w odpowiednim zakresie pozwalającym na obserwację sygnału bioluminescencyjnego.
  2. Wybierz obszary zainteresowania, korzystając z menedżera ROI dostępnego w menu „Analyze| Tools| ROI Manager”.
  3. Wyeksportuj średni sygnał dla wybranego obszaru, klikając „ROI manager| More| Multimeasure”.
  4. Skopiuj uzyskane dane do oprogramowania analitycznego.
  5. Ręcznie dostosuj bazę czasową danych do odstępu czasowego obrazowania (t.j. odstępy 15, 30 lub 60 min, opisane jako 0,25, 0,5 lub 1 h), zamiast korzystać z numeru obrazu podanego przez program Fiji.
    UWAGA: Można teraz przeprowadzić dalsze analizy, takie jak wyznaczenie okresu. W tym celu do przeprowadzenia nieliniowej analizy regresji stosuje się następujące równanie:
    Równanie tłumionego ruchu harmonicznego z członem liniowym, łączące wykładniczy spadek i funkcję cosinusa.
    gdzie y to sygnał, x to odpowiadający mu czas, m to nachylenie linii trendu, c to punkt przecięcia linii trendu z osią y, Amplitude to wysokość szczytu przebiegu fali powyżej linii trendu, k to stała zaniku lub współczynnik tłumienia (tak że 1/k to okres połowicznego rozpadu), phase to przesunięcie fali cosinusoidalnej w osi x, a period to czas potrzebny na wykonanie pełnego cyklu13. Wartość R2 jest wykorzystywana jako wskaźnik jakości dopasowania. Możliwe są również inne metody analizy. Pierwsze 24 h akwizycji należy wykluczyć z analizy, ponieważ bioluminescencja komórkowa może wykazywać w tym czasie przejściowe zmiany niecyrkadialne. Jest to wynik ostrej odpowiedzi na zmianę medium.

Wyniki

Niniejszy artykuł przedstawia protokół obrazowania bioluminescencyjnego komórek ssaków z wykorzystaniem inkubatora ALLIGATOR (inkubatora do bioluminescencji). Technika ta zapewnia elastyczność konfiguracji fizycznej oraz warunków pozakomórkowych podczas obrazowania układów bioluminescencyjnych. Opisano metody zarówno dla prostej statycznej hodowli tkankowej (Rysunek 1, Wideo uzupełniające 1), jak i perfuzyjnej hodowli komórkowej (Rysunek 2, Wideo uzupełniające 2), jednak za pomocą tego systemu można obrazować wiele innych konfiguracji. Wszystkie dane zostały ilościowo określone zgodnie z metodami opisanymi w sekcji 7.

Rysunek 1A przedstawia przykładowe nagranie wideo rejestracji bioluminescencji z 6 płytek 96-dołkowych zawierających fibroblasty PER2::LUC4. Zewnętrzne dołki nie zawierają komórek, ponieważ nie były one wymagane w tym eksperymencie. Komórki zostały poddane różnicowemu synchronizowaniu temperaturą, w ramach którego poddano je cyklowi temperatury 12 h w 32 °C, a następnie 12 h w 37 °C przez 72 h lub odwrotnie (12 h w 37 °C, a następnie 12 h w 32 °C przez 72 h), przed utrzymaniem stałej temperatury 37 °C podczas rejestracji. Ekspozycje 60 min wykonywano co godzinę. Dwa z tych warunków zostały ilościowo określone na Rysunku 1B.

Rycina 2A przedstawia schemat układu do perfuzyjnej hodowli tkanek. Składa się on z dwóch szkiełek z kanałami połączonych rurkami. Pożywka jest tłoczona przez komórki za pomocą pompy strzykawkowej. Pierwsze z tych szkiełek pełni rolę przepuszczalnej dla gazów pułapki na pęcherzyki powietrza (szkiełko buforowe) i nie zawiera komórek, natomiast drugie zawiera komórki, z których rejestrowana jest bioluminescencja. Reprezentatywny film z rejestracji z tego układu pokazano na Rycynie 2B. Ekspozycje 15 min wykonywano co 15 min. W tym przypadku komórki utrzymywano albo w standardowych warunkach perfuzji, albo w obecności inhibitora kinazy kazeinowej PF670462, o którym wcześniej wykazano, że wydłuża on okres okołodobowy i zmniejsza amplitudę rytmów ekspresji genów zegara w hodowanych komórkach ssaków14. Efekt na ekspresję PER2::LUC pokazano na Rycynie 2C (panel górny) w porównaniu z komórkami traktowanymi tym samym stężeniem leku w standardowych warunkach statycznej hodowli komórkowej pokazanymi na Rycynie 2C (panel dolny), a kwantyfikację okresu przedstawiono na Rycynie 2D. Z danych tych jasno wynika, że traktowanie PF670462 wpływa na ekspresję PER2::LUC w obu zestawach warunków. Jednak podczas gdy komórki traktowane PF670462 w warunkach perfuzji wykazują wydłużenie okresu o około 3 h (3 ±0,9 h), komórki w warunkach statycznych traktowane lekiem wykazują znacznie większe wydłużenie okresu do wartości >48 h. Można to dopasować do tłumionej funkcji cosinusoidalnej, jak opisano w Sekcji 7 (test F sumy kwadratów reszt versus linia prosta, p <0,0001). Co ciekawe, wielkość wydłużenia okresu podczas perfuzji jest znacznie bliższa tej obserwowanej in vivo14.

Wynik testu bioluminescencyjnego; ekspresja PER2::LUC; wykres przebiegu czasowego; cykle temperaturowe 32°C-37°C.
Rycina 1: Przykład danych. (A) Przykładowy zrzut ekranu z wideo przedstawiający bioluminescencję z unieśmiertelnionych komórek PER2::LUC w 6 płytkach 96-dołkowych w inkubatorze do bioluminescencji. Doilki przeznaczone do kwantyfikacji zostały zaznaczone na żółto w Supplementary Video 1. (B) Kwantyfikacja bioluminescencji z A. Dwa zestawy po 3 płytek z komórkami zostały zsynchronizowane za pomocą cykli temperaturowych (12 h w 32 °C; 12 h w 37°C), które były względem siebie przeciwfazowe, aby uzyskać przeciwne fazy ekspresji białka PER2 (n = 6, średnia ± SEM). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat systemu perfuzyjnego, wyniki luminescencji, wykres zależny od czasu oraz analiza na wykresie słupkowym.
Rycina 2: Perfuzja z inhibitorami CK1δ. (A) Schemat systemu perfuzyjnego. (B) Przykładowa klatka z nagrania wideo bioluminescencji komórek PER2::LUC podczas perfuzji. Żółtym kolorem zaznaczono przykładowy obszar kwantyfikacji. (C) Kwantyfikacja bioluminescencji fibroblastów PER2::LUC podczas perfuzji oraz w warunkach statycznych, z dodatkiem i bez dodatku 3 µM inhibitora CK1 PF670462 (n = 3, średnia ± SEM). Bioluminescencję znormalizowano do wartości minimalnej i maksymalnej. (D) Analiza okresu (dwuczynnikowa ANOVA, test wielokrotnych porównań Holma-Sidaka). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

KomponentKońcowe stężenie pożywki (μM)Roztwór zapasowy (mg/ml)Do 400 ml NS21
Albumina wołowa37-50 g
Katalaza0.01-50 mg
Glutation3.2-20 mg
Insulina0.6108 ml
Dysmutaza ponadtlenkowa0.077-50 mg
Holo-transferryna0.062-100 mg
T3 (trijodotyronina)0.0026220 µL
L-karnityna12-40 mg
Etanolamina16ciecz (1 g/ml)20 µL
D(+)-galaktoza83-300 mg
Putrescyna183-322 mg
Selenian sodu0.0831280 µL
Kortykosteron0.05820,2 ml
Kwas linolowy3.51000,2 ml
Kwas linolenowy3.51000,2 ml
Kwas lipowy0.24.70,2 ml
Progesteron0.023.20,04 ml
Octan retinolu0.2200,1 ml
Retinol, wszystko-trans0.3100,2 mL
D,L-alfa-tokoferol2.31000. 2 ml
Octan D,L-alfa-tokoferylu2.11000,2 mL

Tabela 1: Przygotowanie NS21.

Film uzupełniający 1: Przykład wideo bioluminescencji z płytek wielodołkowych. Przykładowy zrzut ekranu z filmu przedstawiający bioluminescencję unieśmiertelnionych komórek PER2::LUC w sześciu płytkach 96-dołkowych w inkubatorze do pomiaru bioluminescencji. Doilki przeznaczone do kwantyfikacji zostały zaznaczone na żółto. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający 2: Przykładowy kadr z rejestracji bioluminescencji komórek PER2::LUC w warunkach perfuzji. Przykładowy obszar kwantyfikacji zaznaczono na żółto. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół dotyczy hodowli komórek ssaków, zarówno w warunkach perfuzji, jak i statycznych. Jednak ALLIGATOR można łatwo dostosować do innych systemów modelowych. Rzeczywiście, wykazano już, że stanowi doskonałą platformę do jednoczesnego monitorowania lokomocji, snu i rytmów ekspresji genów obwodowych u Drosophila melanogaster utrzymywanych w ciągłej ciemności15. Należy również zauważyć, że w zależności od zastosowania odpowiednie mogą być typy kamer inne niż wymienione tutaj. Przewidujemy, że przy odpowiednich filtrach zmodyfikowana wersja obecnej konfiguracji może być zasadniczo używana do ilościowego oznaczania fluorescencji.

Jedynymi zastosowaniami, dla których ALLIGATOR może nie być odpowiedni, są te, dla których wymagana jest szczególnie wysoka rozdzielczość przestrzenna, takie jak obrazowanie czasoprzestrzennej organizacji ekspresji PER2::LUC w organotypowych wycinkach jądra nadskrzyżowaniowego ssaków lub innych małych wycinkach tkanki.

ALIGATOR umożliwia przeprowadzenie wielu eksperymentów, które do tej pory nie były łatwo osiągalne przy użyciu konwencjonalnych technik nagrywania. W porównaniu z obecnymi metodami pomiaru bioluminescencji, ALLIGATOR zapewnia większą elastyczność zarówno w zakresie rodzaju naczynia do hodowli komórkowej lub szkiełka, które można zastosować, warunków podłoża zewnętrznego, czułości i procesowości.

Jest to szczególnie istotne w czasach, gdy następuje odejście od standardowych modeli hodowli komórkowych 2D na rzecz 3D organoidów i systemów hodowli przepływowych. W związku z tym oczekuje się, że ALLIGATOR zapewni elastyczną metodę, za pomocą której bioluminescencja może być mierzona przez wiele dni i tygodni w szerokim zakresie warunków.

Oświadczenia

Nie występuje konflikt interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Cairn Research za współpracę z nami przy rozwoju tego systemu, w szczególności Markowi Hensonowi, Jeremy'emu Grahamowi i Joao Correi. Dziękujemy również Davidowi Qualishowi i Akhileshowi Reddy'emu za cenną dyskusję podczas fazy projektowania, a także Peterowi Laskeyowi (dawniej z Hamamatsu) za wypożyczenie kamery demonstracyjnej oraz Davidowi Wongowi za jego krytyczny wkład w rękopis.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM (1x) + GlutaMAXGibco31966-021
Hyclon FetalClone III SerumGE HealthcareSH30109.03
Podłoże neuropodstawoweThermofisher21103049podłoże podstawowe
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA4919
KatalazaSigmaC40
GlutationSigmaG6013
InsulinaSigmaI1882
Dysmutaza ponadtlenkowaSigmaS5395
HolotransferynaCalbiochem616424
T3 (trijodo-L-tyroninaSigmaT6397
L-karnitynaSigmaC7518
EtanoloaminaSigmaE9508
D (+)-galaktozaSigmaG0625
PutrescynaSigmaP5780
Selenin soduSigmaS9133
KortykosteronSigmaC2505
Kwas linolowySigmaL1012
Kwas linolenowySigmaL2376
Kwas liponowySigmaT1395
ProgesteronSigmaP8783
Octan retinoluSigmaR7882
Retinol, wszystko transSigma95144
D,L-alfa-tokoferolSigma95240
D,octan L-alfa-tokoferoluSigmaT3001
Roztwór wodorowęglanu soduSigmaS8761-100ML
GlutaMAX (100x)Gibco35050-038
Inkubator penicylina-streptomycynaSigmaP4333
Galaxy 170R EppendorfCO17301001
LuciferinBiosynthL-8220
D -(+)-Roztwór glukozySigmaG8644-100ML
DMEM w proszkuSigmaD5030
MOPSSigmaPHG0007
1 mm ID silikonowa rurka GE Healthcare19-4692-01
Złącze kolankoweluer Ibidi10802
Złączki męskieluer Ibidi10826
Złączki żeńskie luerIbidi10825
µ-slide luer I 0,6Ibidi80196
BD plastipak 20ml strzykawkaBecton Dickinson300613
1mm Rurki ID ETFEGE Healthcare18-1142-38
PF670462Suplement SigmaSML0795
B27 (50x)Kamera ThermoFisher17504044
iXon Ultra EMCCDAndoriXon 888
FidżiImageJN/A
Prism 7.0Oprogramowanie GraphpadN/A
Trypan niebieskiSigmaT8154
Podkładka izotermiczna DeltaphaseBraintree Scientific39DP
Podgrzewany filtr o neutralnej gęstości Cairn ResearchPozycja
Osmomat 030Gonotech Wycofanosprzedaży
300 mOsmol/kg standard kalibracjiGonotech30.9.0020
Naczynie pomiaroweGonotech30.9.0010
Cylinder skupiającyCairn ResearchPozycja niestandardowa
programowalna pompa strzykawkowaPump Systems inc. NE-1600
Oprogramowanie Andor SolisAndorNie dotyczy
niestandardowa ze NE-1600

Bibliografia

  1. Morgan, L. W., Greene, A. V., Bell-Pedersen, D. Circadian and light-induced expression of luciferase in Neurospora crassa. Fungal Genet. and Biol. 38 (3), 327-332 (2003).
  2. Millar, A. J. A Novel Circadian Phenotype Based on Firefly Luciferase Expression in Transgenic Plants. Plant Cell Online. 4 (9), 1075-1087 (1992).
  3. Yu, W., Hardin, P. E. Use of Firefly Luciferase Activity Assays to Monitor Circadian Molecular Rhythms In Vivo and In Vitro. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 465-480 (2007).
  4. Yoo, S. -H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci. 101 (15), 5339-5346 (2004).
  5. Buhr, D. E., Yoo, S. -H., Takahashi, J. S. Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators. Science. 330 (6002), 379-385 (2010).
  6. Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks. Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).
  7. Balsalobre, A., et al. Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling. Science. 289 (5488), 2344-2347 (2000).
  8. Balsalobre, A., Marcacci, L., Schibler, U. Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts. Curr. Biol. CB. 10 (20), 1291-1294 (2000).
  9. Hastings, M. H., Reddy, A. B., McMahon, D. G., Maywood, E. S. Analysis of circadian mechanisms in the suprachiasmatic nucleus by transgenesis and biolistic transfection. Methods Enzymol. 393, 579-592 (2005).
  10. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Ba Barres,, Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
  11. Feeney, K. A., Putker, M., Brancaccio, M., ONeill, J. S. In-depth Characterization of Firefly Luciferase as a Reporter of Circadian Gene Expression in Mammalian Cells. J. Biol. Rhythms. 31 (6), 540-550 (2016).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Hirota, T., Lewis, W. G., Liu, A. C., Lee, J. W., Schultz, P. G., Kay, S. A. A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta. Proc Natl Acad Sci. 105 (52), 20746-20751 (2008).
  14. Meng, Q., Maywood, E. S., Bechtold, D. A., Lu, W., Li, J., Gibbs, J. E. Entrainment of disrupted circadian behavior through inhibition of casein kinase 1 ( CK1 ) enzymes. Proc Natl Acad Sci. 1, 1-6 (2010).
  15. Khabirova, E., Chen, K. -F., O'Neill, J. S., Crowther, D. C. Flyglow: Single-fly observations of simultaneous molecular and behavioural circadian oscillations in controls and an Alzheimer's model. Sci. Rep. 6, 33759(2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie bioluminescencyjnereporter lucyferazysystem ALLIGATORrytmy okołodobowesynchronizacja temperaturąmedium perfuzyjnekontrola gazówakwizycja obrazuanaliza danychhodowla komórkowa
Elastyczny pomiar reporterów bioluminescencyjnych za pomocą zautomatyzowanego podłużnego obrazowania lucyferazy zoptymalizowanego pod kątem gazu i temperatury rejestratora (ALLIGATOR)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.