Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo) Ocena EPR pH, pO2, stanu redoks oraz stężeń fosforanów i glutationu w mikrośrodowisku guza

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56624

⸱

16 marca 2018

 ,  ,  , 
1In Vivo Multifunctional Magnetic Resonance center, Robert C. Byrd Health Sciences Center, West Virginia University, 2Department of Biochemistry, West Virginia University School of Medicine, 3Department of Microbiology, Immunology & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Rezonans paramagnetyczny elektronów o niskim polu (pasmo L, 1,2 GHz) przy użyciu rozpuszczalnych sond nitroksylowych i trytylowych jest demonstrowany do oceny fizjologicznie ważnych parametrów w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi.

Streszczenie

Ten protokół demonstruje zdolność technik opartych na niskopolowym rezonansie paramagnetycznym elektronów (EPR) w połączeniu z funkcjonalnymi sondami paramagnetycznymi do dostarczania ilościowych informacji na temat chemicznego mikrośrodowiska guza (TME), w tym pO2, pH, statusu redoks, stężenia śródmiąższowego fosforanu nieorganicznego (Pi) i wewnątrzkomórkowego glutationu (GSH). W szczególności zastosowanie niedawno opracowanej rozpuszczalnej, wielofunkcyjnej sondy trytylowej zapewnia niezrównane możliwości jednoczesnych pomiarów in vivo pH, pO2 i Pi w przestrzeni Extracellular (sonda HOPE). Pomiary trzech parametrów za pomocą jednej sondy pozwalają na analizę ich korelacji niezależnie od rozkładu sondy i czasu pomiarów.

Wprowadzenie

Coraz większego znaczenia przypisuje się kluczowej roli mikrośrodowiska guza (TME) w progresji nowotworów i ich terapii1. Wśród ważnych parametrów fizjologicznych TME w guzach litych dobrze udokumentowane są: hipoksja tkankowa2, kwasica3,4, wysoka zdolność redukcyjna5, podwyżone stężenia wewnątrzkomórkowego GSH6,7 oraz śródmiąższowy Pi8. Nieinwazyjne oceny in vivo pO2, pH, Pi, GSH oraz stanu redox dostarczają unikalnych informacji o procesach biologicznych w TME i pomagają w rozwoju narzędzi do badań przedklinicznych leków przeciwnowotworowych oraz strategii terapeutycznych celujących w TME. Odpowiednia głębokość penetracji tkanek przez fale radiowe w obrazowaniu rezonansem magnetycznym (MRI) oraz technikach opartych na EPR niskopolowym sprawia, że są one najwłaściwszymi metodami do nieinwazyjnej oceny tych parametrów TME. MRI opiera się głównie na obrazowaniu protonów wody i jest powszechnie stosowane w warunkach klinicznych w celu uzyskania rozdzielczości anatomicznej, jednak brakuje mu rozdzielczości funkcjonalnej. Pomiary jądrowego rezonansu magnetycznego fosforu-31 (31P-NMR) stężenia pozakomórkowego Pi i pH, oparte na sygnale z endogennego fosforanu, są potencjalnie atrakcyjne dla charakterystyki TME, ale zazwyczaj są maskowane przez kilkukrotnie wyższe stężenia Pi wewnątrzkomórkowego9,10. W przeciwieństwie do tego, pomiary EPR opierają się na spektroskopii i obrazowaniu specjalnie zaprojektowanych sond paramagnetycznych, aby zapewnić rozdzielczość funkcjonalną. Należy zauważyć, że egzogenne sondy EPR mają przewagę nad egzogennymi sondami NMR ze względu na znacznie wyższą czułość wewnętrzną EPR oraz brak endogennych sygnałów tła EPR. Niedawne opracowanie dwufunkcyjnej sondy nitroksylowej do pomiaru pH i redox11 oraz wielofunkcyjnej sondy trytylowej12 stwarzają bezprecedensowe możliwości jednoczesnych pomiarów in vivo kilku parametrów TME i analizy ich korelacji, niezależnie od rozkładu sondy i czasu pomiaru. Z naszej wiedzy nie istnieją inne dostępne metody pozwalające na jednoczesną ocenę in vivo fizjologicznie ważnych chemicznych parametrów TME u żywych osobników, takich jak pO2, pHe, Pi, redox i GSH.

Sondy do In vivo Pomiary funkcjonalne:

Rysunek 1 przedstawia struktury chemiczne sond paramagnetycznych wykorzystywanych do badania parametrów TME, obejmujące sondy cząsteczkowe i rozpuszczalne. Wysoka czułość funkcjonalna, stabilność w żywej tkance oraz minimalna toksyczność to niektóre z zalet, dzięki którym sondy cząsteczkowe są preferowane nad sondami rozpuszczalnymi w oksymetrii EPR in vivo. Na przykład sondy cząsteczkowe charakteryzują się dłuższym czasem retencji w miejscu implantacji tkankowej w porównaniu z sondami rozpuszczalnymi, co umożliwia podłużny pomiar pO2 w tkance przez kilka tygodni. Z drugiej strony, sondy rozpuszczalne przewyższają sondy cząsteczkowe, zapewniając pomiary o rozdzielczości przestrzennej przy użyciu technik obrazowania opartych na EPR, a także umożliwiając jednoczesne analizy wielu parametrów funkcjonalnych (pO2, pH, Pi, potencjału redoks i GSH).

figure-introduction-1
Rycina 1Struktury chemiczne sond paramagnetycznych wykorzystywanych w teście oceny mikrośrodowiska guza (TME). Obejmuje to frakcję cząsteczkową pO2 sonda, LiNc-BuO (R = -O(CH2)3CH3), oraz sondy rozpuszczalne: dwufunkcyjna sonda pH i redox, NR; sonda wrażliwa na GSH, RSSR; oraz wielofunkcyjna pO2, sonda pH i Pi przestrzeni pozakomórkowej mikrośrodowisko, sonda HOPE. Synteza tych sond została opisana w podanych materiałach referencyjnych. 11,12. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace ze zwierzętami były prowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez WVU IACUC.

1. Synteza i kalibracja sondy

  1. Cząsteczkowy pO2czuła sonda LiNc-BuO
    Uwaga: Mikrokryształy LiNc-BuO syntetyzuje się i przygotowuje zgodnie z opisem w literaturze13Są one bardzo stabilne i mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej przez lata. Szerokość linii EPR sondy cząsteczkowej LiNc-BuO wynosi pO2parametr wrażliwy. Mikrokryształy LiNc-BuO wykazują idealną liniową zależność szerokości linii od stężenia tlenu w zakresie od warunków anoksycznych do 760 mmHg pO2 ciśnienie parcjalne13przy czym wartości wewnętrznej szerokości linii w warunkach beztlenowych oraz nachylenie zależności od stężenia tlenu (mierzone w mG/mmHg) nieznacznie różnią się dla poszczególnych partii preparatu mikrokryształów. W związku z tym wymagana jest kalibracja dla każdej konkretnej partii.
    1. Odważ 60 mg mikrokryształów LiNc-BuO.
    2. W celu kalibracji czułości na tlen należy zawiesić mikrokryształy w 3 ml pożywki DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) (w stężeniu 20 mg/ml), a następnie poddać sonikacji przez 5 min na lodzie za pomocą sonikatora proteinuria o częstotliwości 20 kHz i mocy 7 W w szklanej probówce okrągłodnej o pojemności 5 ml.
    3. Umieść 1 ml sonikowanych mikrokryształów w probówce szklanej w rezonatorze z cewką powierzchniową spektrometru EPR pasma L (1,2 GHz) i zarejestruj widma EPR w trybie ciągłym (CW) w temperaturze fizjologicznej wynoszącej 37 °C or stężenia tlenu wynoszące 0, 1, 2, 4, 8 i 20,9%. Poziom stężenia tlenu należy utrzymywać poprzez napowietrzanie roztworu mieszaniną gazową podawaną z kontrolera gazów, a temperaturę utrzymywać za pomocą łaźni wodnej podłączonej do termostatu. Należy zastosować następujące parametry akwizycji spektrometru EPR: amplituda modulacji 100 mG; częstotliwość modulacji 100 kHz; szerokość sweepu 5 G; czas sweepu 60 s.
    4. Aby uzyskać lepszy stosunek sygnału do szumu (SNR), należy zastosować amplitudę modulacji wynoszącą 60% szerokości linii (np., zastosuj amplitudę modulacji 0,6 G (dla szerokości linii wynoszącej 1 G).
    5. Alternatywna uproszczona procedura kalibracji: Rejestracja widm EPR w roztworach napowietrzanych i anoksycznych14W tym drugim przypadku należy utrzymać anoksję w próbkach poprzez dodanie 10 mM glukozy i 100 U/mL oksydazy glukozowej do 1 ml roztworów sondy zgodnie z referencją14.
    6. Dopasuj widma EPR za pomocą funkcji Lorentza, aby wyznaczyć szerokość linii, LW. Oceń czułość mikrokryształów na pO2 jako nachylenie zależności LW od pO2, a mianowicie jako wartość (LWpowietrze−LWanoksja)/pO2air, gdzie LWpowietrze oraz LWanoksja są szerokościami linii widmowych odpowiednio w warunkach powietrznych i anoksji; pO2air = 152 mmHg.
  2. Sonda dwufunkcyjna do pomiaru pH i potencjału redoks, NR
    Uwaga: Sonda NR jest syntetyzowana zgodnie z opisem w źródle bibliograficznym11Jest on stabilny w temperaturze pokojowej zarówno w formie stałej, jak i w roztworach wodnych. Zsyntetyzowana sonda NR jest przechowywana w 4 °CRozszczepienie nadsubtelne azotu, aN, a szybkość spadku amplitudy sygnału są parametrami widmowymi sondy NR, które są wrażliwe na pH (pK sondya = 6,6 przy 37 °C, odpowiednio zakres czułości na pH od 5,6 do 7,6 oraz zdolność redukcyjną mikrośrodowiska sondy.
    1. Wyjąć NR z zamrażarki i pozostawić naczynie do ogrzania do temperatury pokojowej (10–15 min). Odważyć 6,34 mg NR, rozpuścić w 1 ml roztworu soli fizjologicznej i skorygować pH do 7,2, dodając niewielkie ilości HCl lub NaOH przy użyciu pH-metru. Przygotowany roztwór NR (10 mM) należy wykorzystać jako roztwór zapasowy.
    2. Kalibrację pH sondy NR należy przeprowadzić w następujący sposób (patrz odniesienie11). Najpierw należy dodać 0,1 ml roztworu zapasowego NR do 0,9 ml buforu fosforanowego sodu o stężeniu 2 mM z dodatkiem 150 mM NaCl. Uzyskany 1 mM roztwór NR należy miareczkować porcjami HCl lub NaOH do uzyskania wymaganego pH, korzystając z pH-metru. Temperaturę należy kontrolować za pomocą łaźni wodnej podłączonej do termostatu.
    3. Zarejestruj widma EPR próbek znajdujących się w probówkach do mikrowirowania o pojemności 1,5 ml, korzystając ze spektrometru EPR w pasmie L. Zastosuj następujące parametry akwizycji spektrometru EPR: amplituda modulacji 2,5 G; częstotliwość modulacji 100 kHz; szerokość zakresu sweep 60 G; czas sweep 20 s.
    4. Wyznacz stałą rozszczepienia nadsubtelnego (aN) jako połowę odległości między komponentami niskopolowym i wysokopolowym widm EPR i nanieś ją na wykres w funkcji pH, aby uzyskać krzywą kalibracyjną dla pomiarów pH za pomocą EPR w pasmie L.
  3. Sonda RSSR wrażliwa na GSH
    Uwaga: Sonda RSSR jest syntetyzowana zgodnie z opisem w literaturze przedmiotu15Przechowywać zsyntetyzowaną sondę NR w 4 °CLipofilowy związek biradykałowy z mostkiem disiarczkowym RSSR łatwo dyfunduje przez błonę komórkową, reagując z wewnątrzkomórkowym GSH, co stanowi wiarygodną metodę oznaczania GSH. in vivo przy użyciu EPR16,17Ta metoda opiera się na wysokich szybkościach reakcji dominującego wewnątrzkomórkowego pulu tioli GSH za pomocą sondy RSSR. Reakcja biradykału RSSR z GSH powoduje rozszczepienie jego wiązania disiarczkowego (patrz Schemat 1) co prowadzi do zniesienia wymiany spinowej między dwoma fragmentami rodnikowymi, objawiając się spadkiem komponentów spektralnych biradykału i odpowiadającym temu wzrostem komponentów monoradykału. W przypadku sondy biradykalowej RSSR szybkość wzrostu amplitudy komponentu monoradykalowego jest proporcjonalna do stężenia GSH i stanowi wygodny, wrażliwy na GSH parametr widmowy EPR. Aby ocenić stężenie GSH na podstawie in vivo Przed przeprowadzeniem pomiarów EPR należy wykonać kalibrację szybkości reakcji RSSR z GSH w odpowiedniej temperaturze i pH w następujący sposób.
    1. Wyjąć RSSR z zamrażarki i pozwolić naczyniu ogrzać się do temperatury pokojowej (10–15 min). Odważyć 4,05 mg NR i rozpuścić w 1 ml DMSO. Przygotowany roztwór RSSR (10 mM) należy wykorzystać jako roztwór stokowy.
    2. Wyznaczenie wartości stałej szybkości reakcji, kobsreakcji RSSR z GSH w pożądanej temperaturze i pH, zgodnie z poniższymi wytycznymi.
    3. Najpierw należy dodać 20 µL roztworu zapasowego RSSR (10 mM) do 0,98 ml 1 mM buforu fosforanowego Na, pH 7,2, 150 mM NaCl, aby otrzymać 0,2 mM roztwór sondy RSSR.
    4. Przygotować roztwory GSH o stężeniach 1, 2 i 5 mM w 0,1 M buforze fosforanowym sodu o pH 7,2. Aby dokładnie ocenić stężenie GSH w komórkach docelowego organu z... in vivo pomiary, in vitro Kalibrację należy przeprowadzić przy pH zbliżonym do wartości pH wewnątrzkomórkowego.
    5. Wymieszać równe objętości 0,2 mM roztworu RSSR oraz jednego z roztworów GSH przygotowanych w kroku 1.3.4., aby uzyskać końcowe stężenie sondy wynoszące 0,1 mM oraz GSH wynoszące 0,5, 1 lub 2,5 mM.
    6. Bezpośrednio po zmieszaniu roztworów RSSR i GSH umieść próbkę w rezonatorze EPR i rejestruj widma EPR co 12 sekund przez 10 minut. Następnie oblicz kinetykę wzrostu amplitudy widma monorodnikowego. Należy zastosować następujące parametry akwizycji spektrometru EPR: amplituda modulacji: 1 G; częstotliwość modulacji: 100 kHz; zakres sweepu: 60 G; czas sweepu: 10–60 s.
    7. Dopasuj zmierzoną kinetykę EPR do funkcji monoeksponencjalnych i oblicz stałą czasową kinetyki wykładniczej, τRegresja liniowa (1/τ = kobs × [GSH]) dostarcza obserwowanej wartości stałej szybkości reakcji między GSH a RSSR (np., w 34 °C oraz pH 7,2, kobs = 2.8 ± 0,2 M-1s-1)11.
  4. Wielofunkcyjna sonda HOPE do pO2, ocena pH oraz Pi
    Uwaga: Sonda HOPE z monofosfonowaną grupą tritylową została zsyntezowana zgodnie z opisem w literaturze12 i przechowywany w 4 °CWidma CW EPR HOPE przy pH << pKa (A - forma kwasowa) oraz pH >> pKa (B – forma podstawowa) są reprezentowane przez dublety wynikające z nadsobnego rozszczepienia fosforu, aPTypowe ustawienia urządzenia są następujące: amplituda modulacji 37,5 mG; częstotliwość modulacji 100 kHz; szerokość zakresu skanowania 0,9 G; czas skanowania 20–60 s. Przy umiarkowanym pH (5 < pH < 8) widmo EPR sondy HOPE charakteryzuje się kwartetem, gdy obecne są oba stany A i B. Indywidualna szerokość linii EPR sondy HOPE wynosi a pO2 marker (dokładność, ≈ 1 mmHg; pO2 zakres, 1–100 mmHg). Frakcja protonowanej HOPE (forma A) stanowi marker pH w zakresie od 6 do 8,0 (dokładność, ± 0,05). Wartość szybkości wymiany protonów (wyrażona w mG) dla Pi, wyznaczona na podstawie symulacji widma, stanowi marker Pi (dokładność, ± 0,1 mM, zakres 0,1–20 mM). Procedury kalibracji przeprowadza się w temperaturze fizjologicznej (37 °C), siłę jonową roztworu (NaCl, 150 mM) oraz stężenie sondy HOPE wynoszące 0,2 mM, zgodnie z opisem w poprzednich referencjach12,18or szczegółowo opisano poniżej.
    1. Wyjąć sondę HOPE z zamrażarki i pozwolić pojemnikowi ogrzać się do temperatury pokojowej (10-15 min).
    2. Odważ 10,7 mg sondy HOPE, rozpuść ją w 1 ml roztworu soli fizjologicznej i dostosuj pH do wartości 7,4. Dodaj 20 µL przygotowanego roztworu zapasu HOPE (10 mM) do 0,98 ml roztworu soli fizjologicznej, aby otrzymać 0,2 mM roztwór sondy HOPE.
    3. W celu kalibracji sondy pH, miareczkować 0,2 mM roztworu sondy HOPE poprzez dodanie niewielkiej objętości NaOH lub HCl, tak aby końcowe rozcieńczenie próbki nie przekroczało 1%. Pomiar pH należy przeprowadzić za pomocą elektrody pH skalibrowanej przy 37 °C stosując wartości pH dla roztworu referencyjnego zalecane przez National Bureau of Standards (U.S.). Należy użyć z płaszczem zlewki reakcyjnej podłączonej do cyrkulatora, aby starannie utrzymać temperaturę roztworów referencyjnych i miareczkowanych podczas pomiarów pH. Warunki anoksyczne należy utrzymać poprzez dodanie 10 mM glukozy i 100 U/ml oksydazy glukozowej do roztworów pomiarowych.
    4. Należy zarejestrować widma EPR formy A i B odpowiednio przy pH ≤ 5 i pH ≥ 8, w warunkach anoksycznych, w obecności brakującego fosforanu.
    5. Należy wykorzystać odpowiadające im widma do wyznaczenia wewnętrznych parametrów spektralnych. W szczególności należy zasymulować linię widmową jako splot funkcji Lorentza z funkcją Gaussa, która przybliża nierozdzieloną superstrukturę hiperprecyzyjną sondy HOPE. Dopasowanie obliczonych widm EPR do widm eksperymentalnych pozwala na wyznaczenie wartości aP oraz szerokość linii Lorentza (ΔLpp), wyznaczane przez szybkość relaksacji poprzecznej, 1/T2 (gdzie 1/T2 = (√3/2)Lpp dla zmierzonej pochodnej linii absorpcji RF (w CW EPR) oraz szerokości linii rozkładu Gaussa, G.
      Uwaga: Poniżej przedstawiono parametry uzyskane ze widm zmierzonych w warunkach określonych w kroku 1.4.2: aP(A) = 3,63 G, aP(B) = 3,37 G; 1/T2(A) = 23,6 mG; 1/T2(B) = 9 mG; G(A) = 40 mG; G(B) = 45 mG (patrz odniesienie8).
    6. Należy zarejestrować widma EPR próbki HOPE przy pośrednim pH (5 < pH < 8). Przeprowadź symulację komponentu wysokopolowego uzyskanych widm EPR, wykorzystując teorię wymiany między kilkoma centrami w układach niesprzężonych lub słabo sprzężonych, zaadaptowaną z literatury.19 zgodnie z wcześniejszym opisem18Wykorzystaj parametry wewnętrzne uzyskane dla stanów A i B (patrz krok 1.4.5), aby zmniejszyć liczbę zmiennych. Dopasuj obliczone widma do widm eksperymentalnych, aby wyznaczyć wartości frakcji A (pA), a następnie wykreślić zależność pA wartość pH. Wykorzystać zależność pA w dalszych badaniach jako krzywa kalibracyjna pH.
      Uwaga: Dopasowanie zależności pH dla pA przy zastosowaniu standardowej krzywej miareczkowania pozwala na wyznaczenie wartości stałej dysocjacji, pKa (HOPE) = 6,98W in vivo W badaniach tych pozyskiwanie pełnych widm EPR sondy HOPE jest niepraktyczne ze względu na dodatkowy czas potrzebny na zarejestrowanie przerwy między komponentami niskopolowymi a wysokopolowymi rozszczepienia hiperdzielczego fosforu w widmie EPR. W związku z tym w dalszych badaniach przykładowych mierzono i analizowano wyłącznie komponent wysokopolowy widma EPR.
    7. Do kalibracji sondy w przypadku pO2następnie zarejestrowano widma EPR sondy HOPE przy różnych stężeniach tlenu.
    8. Kontrolować pO2 wartości roztworów poprzez napowietrzanie mieszaniną gazów dostarczaną z kontrolera gazów. Kontrolować temperaturę roztworu (37 °C) przy użyciu łaźni wodnej z podłączonym termostatem.
    9. Przeprowadź symulację widm EPR i dopasuj je do widm eksperymentalnych zgodnie z opisem w kroku 1.4.6, aby wyznaczyć wartości stałych szybkości relaksacji indukowanej tlenem.
      Uwaga: Wartości szybkości relaksacji indukowanej tlenem wynosiły 0,49 mG/mmHg zarówno dla formy A, jak i B sondy HOPE, zmierzone przy 37 °C8.
    10. W celu kalibracji sondy [Pi] należy zarejestrować widma EPR sondy HOPE przy różnych stężeniach fosforanu. Należy użyć roztworu rodnika HOPE o wartości pH zbliżonej do pKa (pKa = 6,9 at 37 °C)18 następnie miareczkować go różnymi stężeniami fosforanów. Należy utrzymać temperaturę i skład gazowy zgodnie z opisem w powyższych krokach.
    11. Przeprowadź symulację widm EPR i dopasuj je do widm eksperymentalnych zgodnie z opisem w kroku 1.4.6, aby wyznaczyć wartości szybkości wymiany indukowanej przez Pi.
      Uwaga: Zależność szybkości wymiany indukowanej przez Pi od stężenia [Pi] jest wykorzystywana jako kalibracja w dalszych badaniach.

2. Modele mysie raka piersi

  1. Spontaniczny model nowotworu MMTV-PyMT
    1. Do badań EPR in vivo należy wykorzystać samice myszy z linii FVB/N (Friend virus B-type susceptibility/NIH) z promotorem wirusa guza sutka (MMTV) i antygenem środkowym T poliyomy (PyMT+), w wieku 4-8 tygodni, z utrwalonymi spontanicznie guzami sutka.
    2. W celu porównania mikrośrodowiska tkankowego prawidłowych gruczołów sutkowych i nowotworów, należy wykorzystać samice z tego samego miotu, w tym samym wieku, pozbawione onkogenu PyMT (PyMT−, „typ dziki”)20.
    3. Myszy należy poddać spektroskopii EPR w paśmie L raz w tygodniu przez cztery tygodnie, w znieczuleniu izofluranem (patrz: podawanie sondy poniżej).
    4. Mysz należy znieczulić mieszaniną powietrza i izofluranu (3% izofluranu), a następnie umieścić na regulowanym stole w pozycji bocznej prawej, tak aby guz (gruczoły sutkowe) znajdował się blisko rezonatora z cewką powierzchniową.
    5. Po umieszczeniu myszy należy podać sondę poprzez wstrzyknięcie śródtkankowe (i.t.), nastroić spektrometr EPR i rejestrować widma EPR przez 5-10 min.
    6. Podczas tej samej sesji EPR należy zmierzyć 2-3 guzy sutka (u myszy MMTV-PyMT+) lub grupy sutkowe bez nowotworu (u myszy PyMT−).
  2. Ortotopowy model nowotworu MET-1
    1. Komórki raka piersi myszy Met-1 na tle FVB/N należy hodować w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i 95% wilgotności względnej w pożywce DMEM zawierającej 10% płatowej surowicy bydlęcej (FBS), 10 µg/mL insuliny, 5 ng/mL rhEGF oraz 1% PSA (penicylina G sodowa, siarczan streptomycyny i amfoterycyna B) aż do uzyskania ok. 80% konfluencji w kolbie T175.
    2. Należy odessać pożywkę i wypłukać przylegające komórki 10 mL PBS (1,54 mM KH2PO4, 155 mM NaCl i 2,71 mM Na2HPO4-7H2O bez chlorku wapnia lub chlorku magnezu, pH = 7,4).
    3. Komórki należy odkleić, dodając 5 mL 0,25% roztworu Trypsyny-EDTA i kołysząc kolbą. Po odklejeniu komórek do kolby należy dodać 10 mL DMEM z 10% FBS i zebrać komórki.
    4. Zawiesinę komórkową należy odwirować przy 132 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Liczbę komórek należy określić za pomocą hemocytometru, a następnie resuspender do stężenia 1 x 106 komórek na 100 µL minimalnej pożywki DMEM.
    5. Za pomocą strzykawki insulinowej (igła 29G1/2) należy powoli wstrzyknąć 100 µL zawiesiny komórek nowotworowych do 4. poduszki tłuszczowej gruczołu sutkowego u 8-tygodniowych samic myszy FVB/N typu dzikiego.
    6. Pojawienie się guza należy monitorować poprzez palpację (pojawiają się po około 2-3 tygodniach), wzrost (wizualnie) oraz stan zdrowia myszy (wizualnie) co drugi dzień.
    7. Wymiary guza należy mierzyć raz w tygodniu za pomocą suwmiarki, a objętość guza wyznaczyć przy użyciu równania:
      figure-protocol-1

3. Dostarczanie sondy do pomiarów funkcjonalnych in vivo

  1. Do pomiaru pO2 należy użyć sondy cząsteczkowej LiNc-BuO (Protokół I)2 pomiary w ortotopowych modelach nowotworowych poprzez implantację komórek nowotworowych z internalizowanymi mikrokryształami LiNc-BuO zgodnie z wcześniejszym opisem14,21 or szczegółowo opisano poniżej.
    1. W przypadku modelu nowotworu MET-1, w celu internalizacji mikrokryształów LiNc-BuO do komórek MET-1, należy zawiesić mikrokryształy LiNc-BuO w medium DMEM w stężeniu 20 mg/ml i poddać sonikacji za pomocą sonikatora sondpyowego o częstotliwości 20 kHz przy mocy 7 W w szklanej probówce o dnie okrągłym o pojemności 5 ml przez 5 min na lodzie.
    2. Dodaj 100 µL (2 mg LiNc-BuO) zawiesiny do kolby T75 zawierającej 10 ml pożywki z komórkami MET-1 (zlewne w około 30%). Wszystkie procedury odbywają się w komorze z laminarnym przepływem powietrza, a pożywka zawiera penicylinę i streptomycynę w celu zminimalizowania ryzyka potencjalnego zakażenia.
    3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 72 h lub do momentu osiągnięcia przez nie ok. 80% konfluencji.
    4. Odssać pożywkę. Przemyć komórki pięciokrotnie 10 ml PBS. Odczepić komórki za pomocą 5 ml trypsyny-EDTA. Zebrać komórki. Odwirować zgodnie z opisem w kroku 2.2.4. Próbkę komórek zbarwić barwnikiem wykluczającym w celu określenia żywotności i liczby komórek.
    5. Z zawiesić komórki w stężeniu 1 x 106 na 100 µL minimalna pożywka DMEM.
    6. Przy użyciu strzykawki insulinowej powoli wstrzyknąć 100 µL zawiesiny komórkowej zawierającej zinternalizowane mikrokryształy LiNc-BuO do poduszek tłuszczowych gruczołów mlekowych nr 4 u 8-tygodniowych samic myszy szczepu FVB/N myszy typu dzikiego, zgodnie z opisem w kroku 2.2.5.
    7. Monitoruj inicjację i wzrost guza zgodnie z opisem w krokach 2.2.6 i 2.2.7.
  2. Stosuj sondę LiNc-BuO w formie cząsteczkowej (Protokół II) w modelach spontanicznych lub ortotopowych. Wstrzyknij mikrokryształy LiNc-BuO w obszar zainteresowania, np.do prawidłowych gruczołów mlekowych lub guzów gruczołu mlekowego, przy użyciu strzykawki insulinowej.
  3. Sondy rozpuszczalne
    1. Zanurzyć myszy w znieczuleniu poprzez inhalację mieszaniny powietrza i izofluranu (przepływ 1,0 l/min i stężenie izofluranu 2-3%) przy użyciu aparatury do znieczulania, a następnie umieścić je w przerwie spektrometru EPR.
    2. Nastroić instrument, a następnie wstrzyknąć NR (10-30 µL, 10 mM), sonda HOPE (10−30 µL, 0,5–2 mM) w soli fizjologicznej, pH 7,2, lub sondę RSSR w DMSO (10 µL, roztwory 10 mM) (p.s.).

4. Pomiary funkcjonalne in vivo

  1. W celu przeprowadzenia pomiarów spektroskopowych EPR, uśpij myszy poprzez inhalację mieszaniny powietrza z izofluranym, używając aparatu do znieczulenia zgodnie z opisem w kroku 3.3.1.
  2. Wykonaj pomiary funkcjonalne za pomocą spektrometru EPR pasma L (1,2 GHz) w następujący sposób:
    1. Umieść rezonator z cewką powierzchniową na prawidłowej gruczole mlekowej lub guzie gruczołu mlekowego i nastroj spektrometr.
    2. Rejestruj widma EPR z wszczepionej sondy cząsteczkowej przez 5−10 min w odstępach kilku tygodni po implantacji. W przypadku sond rozpuszczalnych rejestruj widma EPR przez 5-10 min bezpośrednio po wstrzyknięciu sondy.
    3. Przeanalizuj widma EPR sondy NR, aby wyznaczyć rozszczepienie nadsubtelne, aN, oraz amplitudę sygnału, I(t). Przelicz wartość aN na wartość pH, korzystając z krzywej kalibracyjnej uzyskanej w kroku 1.2.4. Przeanalizuj szybkość zaniku amplitudy sygnału I(t) jako względną zmianę w stosunku do amplitudy początkowej, I(t = 0), obliczoną w jednostkach arbitralnych na sekundę (s-1).
    4. Dopasuj wzrost komponentu monoradykalnego w widmie EPR sondy RSSR czułej na GSH do funkcji monoeksponencjalnych, aby uzyskać stałą czasową kinetyki wykładniczej w celu obliczenia stężenia GSH.
    5. Dopasuj widma EPR komponentu wysokopolowego wielofunkcyjnej sondy HOPE do widm eksperymentalnych, zgodnie z opisem w (kroku 1.4.5), aby wyznaczyć wartości pH, pO2 oraz Pi.

5. Analiza statystyczna

  1. Przeprowadź przetwarzanie danych oraz analizy statystyczne. Do analiz korelacji zastosuj test korelacji r Pearsona (dla zestawów danych o rozkładzie normalnym) oraz korelację rang Spearmana (dla zestawów danych, w których odrzucono normalność rozkładu danych).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ocena tkankowego pO2 z wykorzystaniem sond LiNc-BuO:

Stosując procedurę opisaną w kroku 1.1, przeprowadziliśmy kalibrację świeżo przygotowanej zawiesiny mikrokryształów LiNc-BuO. Rysunek 2 przedstawia typową zależność szerokości linii sondy LiNc-BuO od stężenia tlenu, a także przykładowe widma EP...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawione metody pozwalają na nieinwazyjną ocenę in vivo krytycznych parametrów substancji chemicznej TME, tj. pO2, pH, stanu redoks oraz stężeń śródmiąższowego Pi i wewnątrzkomórkowego GSH. Techniki rezonansu magnetycznego, takie jak rezonans magnetyczny i niskopolowy EPR, są metodami z wyboru do nieinwazyjnego profilowania in vivo tych parametrów TME. Rezonans magnetyczny wizualizuje struktury anatomiczne, ale brakuje mu czułości funkcjonalnej. W przeciwieństwie do rezonansu ma...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez granty NIH CA194013, CA192064 i U54GM104942. WVCTSI jest dopuszczony do rozruchu przez VVK, AB i TDE. Autorzy dziękują dr M. Gencheva i K. Steinbergerowi za pomoc w przeprowadzeniu eksperymentów ilustracyjnych. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Spektrometr EPR w paśmie LMagnettech, NiemcySpektrometr elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) w paśmie L (1,2 GHz) do zbierania widm in vitro i in vivo cząsteczek paramagnetycznych
  Temperatura i Kontroler gazu Noxygen, NiemcyTemperatura & Sterownik gazu przeznaczony do kontroli i regulacji temperatury oraz składu gazu   
SonicatorFisher Scientific
GSH (L-Glutation zredukowany)Sigma-AldrichG4251
MMTV-PyMT  myszyw domu
DMEMThermo Fisher Scientific11995065
Mysie komórki raka piersi Met-1W domu
myszy typu dzikiego C57Bl/6 Jackson Laboratory
TrypsinThermo Fisher Scientific25200056
Barwnik wykluczający błękit trypanowy Thermo Fisher ScientificT10282
Ohmeda Fluotec 3 
Izofluran (IsoFlo)Abbott Laboratories
Fosforan sodu dwuzasadowySigma-AldrichS9763
Fosforan sodu jednozasadowysigma-AldrichS07051
Chlorek sodusigma-AldrichS7653
Kwas solnysigma-Aldrich320331
Wodorotleneksodu sigma-AldrichS8045
Glukozasigma-Aldrich
Oksydaza glukozowasigma-Aldrich
Lauda Circulator E100Lauda-Brikmann
pH-metr OrionThermo Scientific 
Sonda LiNc-BuOW domuSonda Octa-n-butoksy-naftalocyjaninowa została zsyntetyzowana zgodnie z sondą nr ref. 13
NRW domuSonda nitroksydowa została zsyntetyzowana zgodnie z nr ref. 11
Sonda RSSRW domuSonda dwunitroksydowa została zsyntetyzowana zgodnie z ref 15
HOPE sondaW domuMonofoshonowana sonda triarylometylowa została zsyntetyzowana zgodnie z ref 12

Bibliografia

  1. Siemann, D. W. Tumor Microenvironment. , John Wiley & Sons Ltd.,. Chichester, UK; Hoboken, NJ, USA. (2011).
  2. Tatum, J. L., et al. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82 (10), 699-757 (2006).
  3. Brahimi-Horn, M. C., Chiche, J., Pouyssegur, J. Hypoxia signalling controls metabolic demand. Curr Opin Cell Biol. 19 (2), 223-229 (2007).
  4. Haulica, A., Ababei, L. Comparative study of glycolytic activity in the erythrocytes of animals with chronic experimental hypoxia and with tumours. Neoplasma. 21 (1), 29-35 (1974).
  5. Matsumoto, K., et al. High-resolution mapping of tumor redox status by magnetic resonance imaging using nitroxides as redox-sensitive contrast agents. Clin Cancer Res. 12 (8), 2455-2462 (2006).
  6. Estrela, J. M., Ortega, A., Obrador, E. Glutathione in cancer biology and therapy. Crit Rev Clin Lab Sci. 43 (2), 143-181 (2006).
  7. Voegtlin, C., Thompson, J. W. Glutathione content of tumor animals. J. Biol. Chem. 70, 801-806 (1926).
  8. Bobko, A. A., et al. Interstitial Inorganic Phosphate as a Tumor Microenvironment Marker for Tumor Progression. Sci Rep. 7, 41233(2017).
  9. Gillies, R. J., Raghunand, N., Garcia-Martin, M. L., Gatenby, R. A. pH imaging. A review of pH measurement methods and applications in cancers. IEEE Eng Med Biol Mag. 23 (5), 57-64 (2004).
  10. Gade, T. P., et al. Imaging intratumoral convection: pressure-dependent enhancement in chemotherapeutic delivery to solid tumors. Clin Cancer Res. 15 (1), 247-255 (2009).
  11. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn Reson Med. 67, 1827-1836 (2012).
  12. Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Eubank, T. D., Komarov, D. A., Khramtsov, V. V. Phosphonated Trityl Probe for Concurrent In Vivo Tissue Oxygen and pH Monitoring Using EPR-based Techniques. JACS. 135, 5904-5910 (2013).
  13. Pandian, R. P., Parinandi, N. L., Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Novel particulate spin probe for targeted determination of oxygen in cells and tissues. Free Radic Biol Med. 35 (9), 1138-1148 (2003).
  14. Bobko, A. A., Evans, J., Denko, N. C., Khramtsov, V. V. Concurrent Longitudinal EPR Monitoring of Tissue Oxygenation, Acidosis, and Reducing Capacity in Mouse Xenograft Tumor Models. Cell Biochem Biophys. 75, 247-253 (2017).
  15. Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev Yu, I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J Biochem Biophys Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
  16. Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical probe. Free Rad. Biol. Med. 45, 312-320 (2008).
  17. Hicks, R. Stable Radicals: Fundamentals and Applied Aspects of Odd-Electron Compounds. , John Wiley & Sons, Ltd. 537-566 (2010).
  18. Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Fourier Transform EPR of Trityl Radicals for Multifunctional Assessment of Chemical Microenvironment). Angew. Chem. Int. Edit. 53, 2735-2738 (2014).
  19. Martin, M. L., Martin, G. J., Delpuech, J. J. Practical NMR spectroscopy. , Heyden. (1980).
  20. Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. Am J Pathol. 163 (5), 2113-2126 (2003).
  21. Eubank, T. D., et al. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor inhibits breast cancer growth and metastasis by invoking an anti-angiogenic program in tumor-educated macrophages. Cancer Res. 69 (5), 2133-2140 (2009).
  22. Khramtsov, V. V., et al. Quantitative determination of SH groups in low- and high-molecular-weight compounds by an electron spin resonance method. Anal Biochem. 182 (1), 58-63 (1989).
  23. Komarov, D. A., et al. Electron paramagnetic resonance monitoring of ischemia-induced myocardial oxygen depletion and acidosis in isolated rat hearts using soluble paramagnetic probes. Magnetic Resonance in Medicine. 68 (2), 649-655 (2012).
  24. Song, Y. G., Liu, Y. P., Liu, W. B., Villamena, F. A., Zweier, J. L. Characterization of the binding of the Finland trityl radical with bovine serum albumin. Rsc Advances. 4 (88), 47649-47656 (2014).
  25. Khramtsov, V. V., Bobko, A. A., Tseytlin, M., Driesschaert, B. Exchange Phenomena in the Electron Paramagnetic Resonance Spectra of the Nitroxyl and Trityl Radicals: Multifunctional Spectroscopy and Imaging of Local Chemical Microenvironment. Analyt. Chem. 89 (9), 4758-4771 (2017).
  26. Samouilov, A., et al. In Vivo Proton-Electron Double-Resonance Imaging of Extracellular Tumor pH Using an Advanced Nitroxide Probe. Analyt. Chem. 86 (2), 1045-1052 (2014).
  27. Goodwin, J., et al. In vivo tumour extracellular pH monitoring using electron paramagnetic resonance: the effect of X-ray irradiation. NMR Biomed. 27 (4), 453-458 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

elektronowy rezonans paramagnetycznypomiar pHocena pO2stężenie fosforanówdetekcja glutationusonda wielofunkcyjnaspektrometr EPR pasma Lsondy paramagnetyczne
In vivo (in vivo) Ocena EPR pH, pO2, stanu redoks oraz stężeń fosforanów i glutationu w mikrośrodowisku guza
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.