Ponieważ mitochondria stanowią tylko niewielki procent komórki roślinnej, muszą zostać oczyszczone do szeregu badań. Mitochondria można wyizolować z różnych organów roślinnych poprzez homogenizację, a następnie wirowanie w gradiacji różnicowej i gęstości w celu uzyskania wysoce oczyszczonej frakcji mitochondrialnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i pomiary oddechowe mitochondriów Arabidopsis thaliana
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mitochondria są niezbędnymi organellami zaangażowanymi w liczne szlaki metaboliczne w roślinach, w szczególności w produkcję trifosforanu adenozyny (ATP) z utleniania zredukowanych związków, takich jak dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NADH) i dinukleotyd flawinoadeninowy (FADH2). Pełna adnotacja genomu Arabidopsis thaliana ustaliła, że jest to najczęściej stosowany system modelowy roślin, a zatem potrzeba oczyszczenia mitochondriów z różnych organów (liścia, korzenia lub kwiatu) jest konieczna, aby w pełni wykorzystać narzędzia, które są obecnie dostępne dla Arabidopsis do badania biologii mitochondrialnej. Mitochondria są izolowane przez homogenizację tkanki przy użyciu różnych podejść, po których następuje szereg etapów wirowania różnicowego, w wyniku których powstaje surowy osad mitochondrialny, który jest dalej oczyszczany za pomocą ciągłego wirowania w gradionym gradieniu gęstości koloidalnej. Materiał o gęstości koloidalnej jest następnie usuwany przez wiele etapów wirowania. Zaczynając od 100 g świeżej tkanki liścia, można rutynowo uzyskać 2-3 mg mitochondriów. Eksperymenty oddechowe na tych mitochondriach wykazują typowe dawki 100 - 250 nmol O, 2 min-1 mg całkowitego białka mitochondrialnego-1 (szybkość zależna od NADH), z możliwością użycia różnych substratów i inhibitorów w celu określenia, które substraty są utleniane i pojemność oksydazy alternatywnych i końcowych cytochromów. Protokół ten opisuje metodę izolacji mitochondriów z liści Arabidopsis thaliana przy użyciu ciągłych gradientów gęstości koloidalnej i wydajnych pomiarów oddechowych oczyszczonych mitochondriów roślinnych.
Wprowadzenie
Historia badań nad mitochondriami roślin sięga ponad 100 lat wstecz1. Nienaruszone mitochondria zostały po raz pierwszy wyizolowane na początku lat 50. przy użyciu wirowania różnicowego. Pojawienie się gradientu gęstości koloidalnej w latach 80. pozwoliło na oczyszczenie mitochondriów bez dostosowań osmotycznych. Podczas gdy mitochondria oczyszczone gradientowo są odpowiednie do większości celów, ze względu na czułość spektrometrii mas, nawet stosunkowo niewielkie zanieczyszczenia mogą zostać wykryte i mogą być niewłaściwie przypisane do lokalizacji mitochondrialnej2. Zastosowanie elektroforezy swobodnego przepływu może usunąć zarówno zanieczyszczenia plastydowe, jak i peroksysomy3, ale elektroforeza swobodnego przepływu jest wysoce specjalistyczną techniką i nie jest wymagana w zdecydowanej większości badań. Ponadto przy określaniu lokalizacji białka należy pamiętać, że w komórkach występuje podwójne lub wielokrotne celowanie w białka. Opisano ponad 100 białek o podwójnym ukierunkowaniu dla chloroplastów/plastydów i mitochondriów4, a także znana jest pewna liczba białek ukierunkowanych na mitochondria i peroksysomy5. Co więcej, relokacja białek pod wpływem określonych bodźców, np. stresu oksydacyjnego, jest nowym tematem w biologii komórki6. W związku z tym lokalizacja białek musi być rozpatrywana w kontekście badanej biologii, a do określenia i weryfikacji lokalizacji stosuje się różne podejścia2.
Mitochondria są zazwyczaj izolowane z tkanek roślinnych przez homogenizację, wymagana jest równowaga między rozbiciem ściany komórkowej w celu uwolnienia mitochondriów, a nie uszkodzeniem mitochondriów. Tradycyjnie, w przypadku ziemniaków i kalafiora, homogenizacja polega na użyciu domowego blendera/sokowirówki do przygotowania płynnego ekstraktu w buforze z różnymi składnikami w celu utrzymania aktywności. Izolacja mitochondriów z liści grochu (popularny materiał do izolacji mitochondriów przy użyciu młodych sadzonek (w wieku ~10 dni), wykorzystuje blender do lizy komórek, ponieważ materiał liści jest miękki. Wraz z dostępnością linii nokautujących T-DNA Arabidopsis thaliana, potrzeba oczyszczenia mitochondriów w celu przeprowadzenia badań funkcjonalnych wymusiła opracowanie metod izolowania mitochondriów z tkanek liści, korzeni lub kwiatów. Ogólnie rzecz biorąc, metody opracowane dla innych zakładów działały dobrze7, z tym zastrzeżeniem, że mielenie materiału wymagało optymalizacji. W przypadku rzodkiewnika można to osiągnąć na różne sposoby (patrz poniżej) i różni się w zależności od typu tkanki (korzeń kontra pęd). Wykorzystanie ciągłego gradientu można również zoptymalizować, ponieważ gęstość mitochondriów z różnych narządów lub etapów rozwoju oznacza, że mogą one migrować w różny sposób. W ten sposób, aby uzyskać maksymalną separację, gęstość gradientu można udoskonalić, aby zapewnić najlepszą separację.
Po oczyszczeniu mitochondria mogą być wykorzystywane do różnych badań, w tym eksperymentów z wychwytem białek i tRNA, testów aktywności enzymatycznej, pomiarów łańcucha oddechowego i analiz western blot. Wyizolowane mitochondria mogą być również wykorzystywane do analiz spektrometrii mas obfitości białek. Ukierunkowane analizy monitorowania wielu reakcji (MRM) pozwalają na ilościowe określenie zdefiniowanych białek, ale wymagają znacznego opracowania testów. W przeciwieństwie do tego, kwantyfikacja za pomocą etykiet dimetylowych lub innych izotopów8, zapewnia podejście odkrywcze do identyfikacji różnic w całym proteomie, które można wykorzystać do odkrycia nowych spostrzeżeń biologicznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół jest używany do izolacji nienaruszonych mitochondriów z organów Arabidopsis thaliana rosnących na glebie przy użyciu ciągłych gradientów gęstości koloidalnej. Wszystkie procedury następujące po pobraniu materiału przeprowadza się w temperaturze 4 °C.
1. Przygotowanie medium do mielenia, buforu do płukania i roztworów gradientowych
- Przygotować 300 ml pożywki do mielenia (bez askorbinianu i cysteiny) i 200 ml 2x buforu do płukania według tabeli 1 na jeden dzień przed izolacją, przechowywać je w chłodzie w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Dodać askorbinian sodu i L-cysteinę (wolna zasada) do końcowego stężenia odpowiednio 17,84 mM i 20,36 mM do podłoża mielącego rano w dniu izolacji. Jeśli mitochondria mają być wykorzystane do analiz metodą western blot lub elektroforezy w monoforezie w natywnym żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE), należy uzupełnić 2x bufor do przemywania bez BSA. - Przygotuj gradienty rano w dniu izolacji mitochondriów (Rysunek 1 i Tabela 1).
- Ciężkie i lekkie roztwory gradientowe należy przygotować w dwóch zlewkach; 35 ml każdego z nich wystarcza na dwie probówki gradientowe.
- Umyj komory nalewaka gradientowego i rurki perystaltycznej z PVC wodą dejonizowaną i zapewnij równomierny przepływ przez rurkę ze wszystkich przewodów.
- Umieść 2 probówki wirówkowe (50 ml) pod niewielkim kątem na lodzie z wylotami rurek perystaltycznych z PVC przyklejonymi do wnętrza probówek, aby zapewnić, że roztwór gradientowy spływa po boku probówek.
- Zamknij połączenie między komorą wewnętrzną i zewnętrzną (dźwignia w dół). Umieść nalewak gradientowy na mieszadle magnetycznym z małym mieszadłem w wewnętrznej komorze.
- Wlać 35 ml roztworu o dużym gradinie do komory wewnętrznej (komory z wylotem rurki). Dozować roztwór o dużym gradicji do dwóch probówek wirówkowych umieszczonych na lodzie, aż pozostanie połowa z szybkością pompy perystaltycznej ustawioną na dużą (300 ml / h).
- Wlać 35 ml roztworu gradientu światła do komory zewnętrznej (komory bez wylotu rurki). Otwórz połączenie między komorami (popchnij czarną dźwignię do połowy) i pozwól, aby roztwory delikatnie się wymieszały. Wymieszać roztwory za pomocą mieszadła magnetycznego.
- Pozostawić roztwory do powolnego przepływu (60 ml/h) do momentu, gdy cała mieszanina gradientowa zostanie dozowana z komór, w wyniku czego uzyskamy dwie probówki wypełnione gradientem 0 - 4,4 % (w/v) poliwinylopirolidonu (PVP). Utrzymuj gradienty na lodzie, aż będą gotowe do użycia w kroku 2.12.
UWAGA: Po przygotowaniu gradientu rozcieńczyć 2x medium myjące do 1x wstępnie schłodzoną wodą dejonizowaną i przechowywać w chłodzie w temperaturze 4 °C.
2. Homogenizacja i izolacja mitochondriów
- Wytnij całą tkankę rozety z 4-tygodniowych roślin Arabidopsis uprawianych na glebie za pomocą nożyczek, co najmniej 80 roślin będzie potrzebnych do 1 przygotowania.
UWAGA: Można również użyć 10 - 14-dniowych kultur wodnych, minimum 5 doniczek / przygotowanie lub 2-tygodniowych sadzonek wyhodowanych na płytkach agarowych Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS), minimum 4 płytki. - Umieścić połowę materiału roślinnego, który został pokrojony na małe kawałki, we wstępnie schłodzonym dużym moździerzu o temperaturze 4 °C i tłuczku z 75 ml pożywki do mielenia (tabela 1) i intensywnie mielić przez kilka minut, aż nie pozostaną żadne duże kawałki tkanki.
- Wstępnie zwilżyć 4 warstwy materiału filtracyjnego (wielkość porów 22 - 25 μm) środkiem mielącym i przefiltrować przez 4 warstwy materiału filtracyjnego przez plastikowy lejek do stożkowej kolby o pojemności 500 ml.
- Zmiel pozostałą połowę tkanki z kolejnymi 75 ml środka do mielenia.
- Połącz homogenaty w materiałach filtracyjnych i przefiltruj jak najwięcej homogenacji.
- Pozostałą tkankę pozostałą na materiale filtracyjnym ponownie zmielić z pozostałymi 150 ml pożywki mielącej, ponownie przefiltrować do kolby stożkowej o pojemności 500 ml.
- Przefiltrowany homogenat należy odwirować w 8 wstępnie schłodzonych probówkach wirówkowych z tworzywa sztucznego o pojemności 50 ml o pojemności 2 500 x g w temperaturze 4 °C w wirniku o stałym kącie przez 5 minut.
- Wlać supernatant do czystych probówek wirówkowych (50 ml; nie naruszyć zielonego osadu) i odwirować przy 17 500 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut w wirniku o stałym kącie.
- Wyrzucić wszystko, z wyjątkiem <3 ml supernatantu przez aspirację (lub delikatnie odlać, nie naruszając osadu). Delikatnie zawiesić osad w pozostałym supernatancie za pomocą małego drobnego pędzla.
- Dodaj 10 ml 1x buforu do płukania do każdej probówki i połącz 4 probówki w 1 czystą probówkę wirówkową (tj. w wyniku 2 probówek).
- Napełnij te probówki 1x buforem do płukania do 50 ml i powtórz kroki 2.7 - 2.9.
- Zbierz surowe granulki mitochondrialne w 1 probówce za pomocą zakraplacza i równomiernie rozprowadź drobnym pędzlem (można użyć niewielkiej ilości buforu do mycia, ale końcowa objętość musi być mniejsza niż 3 ml, aby zmieściła się na wierzchu gradientu). Delikatnie nałożyć zawiesinę mitochondrialną za pomocą zakraplacza na 2 ciągłe gradienty PVP od 0 do 4,4 % (w/v).
- Zrównoważyć probówki wagowo (używając 1x buforu do płukania) i odwirować przy 40 000 x g w temperaturze 4 °C przez 40 minut. Upewnij się, że przerwa jest wyłączona. Mitochondria będą migrować do pasma w pobliżu dna probówki lub mogą być obecne w ciężkim roztworze na dnie probówki (identyfikowane przez mętny, żółtawy pasek; Rysunek 2).
- Ostrożnie usunąć górne 5 cm roztworu powyżej pasma mitochondrialnego przez aspirację.
- Rozprowadź pozostały roztwór zawierający mitochondria do 2 czystych probówek i napełnij 1x buforem do płukania. Równomiernie rozprowadź gradient gęstości koloidalnej i mitochondria, pokrywając ujście rurki plastikową folią parafinową i kilkakrotnie odwracając. Wirować przez 15 min przy 31 000 x g w temperaturze 4 °C z powolnym hamowaniem.
UWAGA: Przed odwirowaniem upewnij się, że mitochondria i pozostały gradient gęstości koloidalnej są równomiernie rozłożone. W przeciwnym razie gradient gęstości koloidalnej może koncentrować się na dnie probówki i uniemożliwiać granulowanie mitochondriów. - Usunąć supernatant przez aspirację, napełnić probówkę 1x buforem do płukania do 50 ml i ponownie odwrócić, aby zapewnić wymieszanie. Wirować przez 15 minut przy 31 000 x g w temperaturze 4 °C z powolnym hamowaniem.
- Odessać supernatant i zebrać granulki mitochondrialne w jak najmniejszej objętości (~500 μL) za pomocą pipety ze zmodyfikowanymi końcówkami o pojemności 200 μl (końcówkę należy odciąć nieco powyżej jej końca, aby zwiększyć jej otwór). Umieść mitochondria w probówce o pojemności 1,5 ml i przechowuj na lodzie do natychmiastowego użycia lub przechowuj w temperaturze -80 °C.
UWAGA: Jeśli mitochondria będą używane do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), BN-PAGE lub analizami immunoblot, należy użyć 1x buforu do płukania bez BSA do końcowych płukań (tj. krok 2.15 i 2.16). - Określ stężenie białka w mitochondriach metodą Bradforda.
UWAGA: W przypadku BN-PAGE należy odwirować porcje w temperaturze 4 °C i przechowywać osad w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Do pomiarów zużycia tlenu można używać tylko świeżo wyizolowanych mitochondriów.
3. Pomiary zużycia tlenu
UWAGA: Zużycie tlenu przez świeżo wyizolowane mitochondria roślinne może być analizowane za pomocą elektrody tlenowej typu Clark, co umożliwia określenie nienaruszoności mitochondriów, aktywności szlaku cytochromu c i aktywności alternatywnego szlaku.
- Instalacja oprogramowania
- Zainstaluj licencjonowane oprogramowanie do monitorowania tlenu na komputerze używanym do pomiarów zużycia tlenu.
- Przygotowanie medium oddechowego, substratów, chemicznych roztworów podstawowych i elektrody tlenowej typu Clark
- Przygotować pożywkę oddechową (300 mM sacharozy, 10 mM NaCl, 5 mM KH2PO4, 2 mMMgSO4, 0,1 % (m/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 10 mM TES (pH 7,2)) używanej do oznaczania zużycia tlenu.
- Przygotuj substraty, inhibitory i efektory używane do pomiaru oddychania mitochondrialnego (Tabela 2). Można je przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze -20 °C.
UWAGA: Przed użyciem zneutralizować pH kwaśnych roztworów, takich jak kwasy organiczne, do pH 7,0 za pomocą NaOH. - Podgrzać pożywkę oddechową do tej samej temperatury, co komora testowa (25 °C).
- Zamontuj elektrodę tlenową typu Clark zgodnie z opisem w protokole producenta.
- Umieścić 1 ml wody nasyconej powietrzem (wodę nasyconą powietrzem uzyskuje się przez energiczne wytrząsanie niewielkiej ilości wody dejonizowanej w dużej stożkowej kolbie) w komorze pomiarowej. Aby włączyć mieszadło, kliknij przycisk "Prędkość mieszadła". Kliknij przycisk "Włącz" i ustaw prędkość mieszadła na 65 obr./min. Kliknij "OK", aby kontynuować. Ciągle mieszać wodę w temperaturze 25 °C.
- Kalibracja elektrody tlenowej
- Podgrzej wodę, która będzie używana do kalibracji, do tej samej temperatury, co komora testowa (25 °C).
- Poczekaj, aż prąd się ustabilizuje i skalibruj elektrodę tlenową.
- Aby rozpocząć kalibrację elektrody tlenowej, kliknij przycisk "Kalibruj", wybierz "Kalibracja fazy ciekłej", a następnie "Woda nasycona powietrzem".
- Otworzy się nowe okno (Kalibracja tlenu (faza ciekła) - Krok 1 z 5). Wybierz kanał do kalibracji (kanał, do którego podłączona jest skrzynka sterująca elektrodą) i wprowadź zmienne (ustaw "Temperaturę komory" na 25 °C i "Ciśnienie atmosferyczne" na 101.32 kPa). Kliknij "OK", aby kontynuować.
- W następnym kroku (Krok 2 z 5) ustaw prędkość mieszadła (65 obr./min) i kliknij "OK", aby kontynuować.
- W kroku 3 z 5 poczekaj, aż sygnał osiągnie plateau. W polu pojawi się termin "Osiągnięto plateau, naciśnij OK, aby kontynuować". Kliknij "OK", aby kontynuować.
- W kroku 4 z 5 ustal zero tlenu w komorze, dodając 5 mg ditionitianu sodu. Kliknij "OK", aby kontynuować.
UWAGA: Spadek stężenia tlenu powinien być widoczny w śladzie i powinien osiągnąć 0. - W ostatnim kroku kalibracji (Krok 5 z 5) poczekaj, aż sygnał osiągnie plateau. W polu pojawi się termin "Osiągnięto plateau, naciśnij OK, aby kontynuować". Kliknij "OK", aby kontynuować.
- Kliknij "Zapisz kalibrację", aby zapisać kalibrację. Otworzy się nowe okno. Kliknij "OK", aby potwierdzić zapisanie nowej kalibracji dla skrzynki kontroli tlenu.
UWAGA: Po pomyślnej kalibracji na osi y pojawi się oznaczenie "Tlen (nmol/mL)". - Po kalibracji wyczyść komorę pomiarową, spłukując ją wodą (co najmniej 5 - 10 razy), aby zapewnić prawidłowe czyszczenie. Umieścić 1 ml medium oddechowego w komorze pomiarowej i pozostawić membranę do zrównoważenia przez kilka minut, aż ślad zużycia tlenu stanie się liniowy.
- Dostosuj skalę śladu zużycia tlenu, aby uzyskać dobry widok nachylenia. Kliknij "Zoom XY" i wprowadź zmienne (ustaw "Tlen" na 0 - 300, a "Oś czasu" na 0 - 45 min).
- Oznaczanie integralności mitochondriów
- Przy otwartym tłoku dodać 970 μl nasyconego powietrzem medium oddechowego do komory reakcyjnej.
- Dodać 30 μl wyizolowanych mitochondriów lub 150 μg całkowitego białka mitochondrialnego, oznaczonego po izolacji mitochondriów (całkowita zawartość białka musi być następnie uwzględniona w obliczeniach) do komory reakcyjnej za pomocą pipety z naciętą końcówką.
- Mieszać zawiesinę mitochondrialną w sposób ciągły za pomocą mieszadła magnetycznego (65 obr./min) w temperaturze 25 °C, aby nasycić roztwór powietrzem.
- Uszczelnij komorę tłokiem, kliknij "Rozpocznij nagrywanie", aby zarejestrować zużycie tlenu i poczekaj, aż ślad zużycia tlenu ustabilizuje się (1 - 2 min).
- Określ szybkość zużycia tlenu ręcznie po dodaniu 10 mM askorbinianu i 25 μM cytochromu c przez 5 minut, aby uzyskać szybkość "przed detergentem".
UWAGA: Aby oznaczyć dodanie substratów, inhibitorów i efektorów bezpośrednio w ścieżce, kliknij przycisk "Dodaj znacznik zdarzenia" i wprowadź odpowiednie oznaczenie etykiety. Kliknij "OK", aby kontynuować. - Określ szybkość zużycia tlenu ręcznie przez 3 minuty po dodaniu 0.05% (v/v) detergentu, aby uzyskać szybkość "po debiorcie". Kliknij "Zatrzymaj nagrywanie".
- Kliknij przycisk "Tabela stawek zmian". 2 kursory pojawią się jako pionowe linie na ekranie wykresu. Kliknij i przeciągnij parę kursorów stawki do wymaganych pozycji w śladzie, aby zdefiniować interwał stawki. Przesuń interwał szybkości wzdłuż ścieżki za pomocą lewego kursora szybkości. Ustaw sam przedział kursu za pomocą prawego kursora kursu. Oprogramowanie do monitorowania tlenu automatycznie rysuje linię najlepszego dopasowania między dwoma kursorami, jednocześnie przesuwając kursory interwału szybkości wzdłuż ścieżki.
- Po zdefiniowaniu żądanego przedziału kursu i pozycji, wprowadź kurs do tabeli, klikając prawym przyciskiem myszy na 1 z 2 kursorów i wybierz "Dodaj stawkę do tabeli". Kliknij przycisk "Dodaj", aby potwierdzić wyświetlenie stawki w głównej tabeli stawek.
- Oblicz integralność mitochondriów, dzieląc wskaźnik "przed detergentem" przez wskaźnik "po detergentze", wyrażony w procentach, i odejmij go od 100.
- Oznaczanie oddychania mitochondrialnego
- Przy otwartym tłoku dodać 970 μl nasyconego powietrzem medium oddechowego do komory reakcyjnej. Dodać 500 μM ATP i 30 μl wyizolowanych mitochondriów lub 150 μg całkowitego białka mitochondrialnego za pomocą pipety z naciętą końcówką do pożywki oddechowej w komorze reakcyjnej.
- Mieszać zawiesinę mitochondrialną w sposób ciągły za pomocą mieszadła magnetycznego (65 obr./min) w temperaturze 25 °C.
- Zamknij tłok, kliknij "Rozpocznij nagrywanie", aby zarejestrować zużycie tlenu i poczekaj 1-2 minuty, aż zużycie tlenu się ustabilizuje (gdy ślad zużycia tlenu jest liniowy). Dodać 5 mM bursztynianu. Zapisuj szybkość zużycia tlenu przez około 2 min.
UWAGA: Aby oznaczyć dodanie substratów, inhibitorów i efektorów bezpośrednio w ścieżce, kliknij przycisk "Dodaj znacznik zdarzenia" i wprowadź odpowiednie oznaczenie etykiety. Kliknij "OK", aby kontynuować. - Dodać 1 mM difosforanu adenozyny (ADP). Kontynuuj rejestrowanie szybkości zużycia tlenu przez 2 minuty.
- Dodaj 1 mM NADH. Rejestruj szybkość zużycia tlenu przez 4 - 8 minut. Ta szybkość to zdolność oddychania przez oksydazę cytochromową.
- Dodać 1 mM cyjanku potasu (KCN) (lub 2,5 μM myksotiazolu lub 5 μM antymycyny A) w celu zahamowania szlaku cytochromu c i kontynuować rejestrację przez około 2 minuty, aby obserwować zużycie tlenu za pośrednictwem alternatywnej oksydazy.
- Dodać 5 mM ditiotreitolu (DTT) i 10 mM pirogronianu, aby w pełni aktywować alternatywną oksydazę. Kontynuuj nagrywanie przez 5 - 7 minut: Jest to pojemność alternatywnej oksydazy.
- Dodać 500 μM galusanu n-propylu (nPG) i nagrywać przez 2 minuty. Ocenia to wskaźnik zużycia tlenu resztkowego, którego nie można chemicznie zahamować. Odejmij ten wskaźnik od innych zarejestrowanych wskaźników, ponieważ jest mało prawdopodobne, aby był on pochodzenia mitochondrialnego. Jest bardzo prawdopodobne, że zużycie tlenu nadal występujące po zahamowaniu szlaku cytochromu c i AOX (przez KCN i nPG) pochodzi z peroksydaz obecnych jako zanieczyszczenia w izolowanych mitochondriach9.
- Kliknij "Zatrzymaj nagrywanie".
- Kliknij przycisk "Tabela stawek zmiany" i wprowadź stawkę do tabeli, klikając prawym przyciskiem myszy na jeden z dwóch kursorów, a następnie wybierz "Dodaj stawkę do tabeli". Kliknij przycisk "Dodaj", aby potwierdzić wyświetlenie stawki w głównej tabeli stawek.
UWAGA: Podczas dodawania efektorów rozpuszczonych w rozpuszczalnikach organicznych (np. antymycyna A, nPG, myksotiazol), komorę i tłok należy przepłukać etanolem, a następnie wodą, aby zapewnić prawidłowe czyszczenie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Stosując ten protokół, udało nam się wykryć różne białka mitochondrialne za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingu. Jak pokazano na Rysunku 3A, białko wyizolowane z tkanki hodowli wodnej jest wystarczające do wykrycia słabej prągi (2 µg). Intensywność sygnału wzrasta proporcjonalnie do ilości naniesionego materiału. W przypadku mitochondriów wyizolowanych z tkanek hodowanych na płytkach (Rysunek 3B), odpowiedź na stres wywołany silnym...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zazwyczaj izolacja mitochondriów z liści rzodkiewnika daje 3 mg mitochondriów z około 80 - 100 3-4-tygodniowych roślin, chociaż plony większe niż 5 mg można często osiągnąć przy dokładnym zmieleniu. Plon zmienia się w zależności od warunków wzrostu i drastycznie spada wraz ze starzeniem się liści, chociaż struktura mitochondriów wydaje się być dobrze zachowana podczas starzeniasię 9. Jedną z najważniejszych cech pozwalających uzyskać dobry plon, jest metoda mielenia w celu lizy komórek w celu uwol...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Centrum Doskonałości w Biologii Energii Roślin CE140100008 Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych, stypendium Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (FT130100112) dla MWM oraz stypendium badawcze im. Feodora Lynena (Fundacja Alexandra von Humboldta, Niemcy) dla JS.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemiczny |
| antymycyna A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemiczny, rozpuszcza się w etanolu |
| przeciwciało AOX | od Toma Elthona | Elthona i wsp., 1989 | |
| Askorbinian | Sigma-Aldrich | A0157 | Oksydaza askorbinianowa z Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemiczna |
| albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Przejrzystość chemiczna |
| zachodni substrat ECL | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Kryterium chemiczne |
| Bezplamiste żele prefabrykowane 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | |
| Cyjanek | Sigma-Aldrich | 60178 | chemiczny |
| Cytochrom c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemiczny |
| Difco Agar, granulowany | BD Biosciences | 214530 | Chemiczny |
| Ditiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemiczny |
| EDTA Sól disodowa | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemiczny |
| Gamborg B-5 Podłoże bazowe | Austratec | G398-100L | Chemiczny |
| Gamborg Witamina Roztwór (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemiczny |
| Kozioł Anty-Mysi IgG (H + L)-HRP Koniugat | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | |
| Chemiczny Kozioł Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Sprzężony | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemiczny |
| L-Cysteina | Sigma | C7352-100G | Chemiczny |
| siarczan magnezu | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, rozpuszczać w etanolu |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemiczne |
| przeciwciało Ndufs4 | od Etienne Meyer | Meyer i wsp., 2009 | |
| galusan n-propylu | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemiczny, rozpuszczać w etanolu |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemiczny, koloidalny gradient gęstości |
| Poliwinylopirolidon (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemiczny |
| cyjanek potasu | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemiczny |
| fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemiczny |
| pirogronian | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemiczny |
| chlorek sodu | Chem-Supply | SA046 | Chemiczny |
| Ditionit sodu | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemiczny |
| L-askorbinian sodu | Sigma | A4034-100G | Chemiczny |
| bursztynian | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemiczny |
| Sacharoza | Chem-Supply | SA030 | Chemiczny |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemiczny |
| pirofosforan tetrasodowy (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemiczny |
| zestaw transferowy nitrocelulozy Trans-Blot Turbo RTA Midi | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemiczny, detergentowy |
| odczynnik Western Blocking | Sigma | 11921681001 | Równowaga chemiczna |
| Mettler Toledo | XS204 | Sprzęt | |
| Zlewki | Isolab | 50 mL | |
| Wirówka | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Sprzęt |
| Probówki wirówkowe | Nalgene | 3117-9500 | |
| Cyrkulator | Julabo | 1124971 | Dołączony do komora elektrody tlenowej |
| Kolba stożkowa | Isolab | 500 ml | |
| Zakraplacz | 3 ml | ||
| Rotor o stałym kącie | Beckman Coulter | JA25.5 | Sprzęt |
| Lejek | Per Alimenti | 14 cm | Do filtrowania |
| Nalewak | gradientowy Bio-Rad | 165-4120 | Do przygotowania gradientów |
| Mieszadło magnetyczne ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Sprzęt |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Materiał filtracyjny |
| Moździerz i tłuczek | Jamie Oliver | Granit, 6 cali | Sprzęt |
| O2view | Hansatech Instruments | Oprogramowanie do monitorowania tlenu | |
| System Oxygraph Plus Instrumenty | Hansatech | 1187253 | Elektroda tlenowa typu Clark |
| Pędzel | Artysta pierwszego wyboru | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastikowa folia parafinowa |
| Pompa perystaltyczna | Gilson | F155001 | Do przygotowania gradientów |
| Rurki perystaltyczne | PVC Gilson | F117930 | Do przygotowania gradientów |
| Kąpiel wodna | VELP Scientifica | OCB | Sprzęt |
Bibliografia
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
- Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
- Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
- Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
- Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code - Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
- Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
- Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
- Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
- Lee, C. P., Eubel, H., O'Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
- Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
- Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
- Peters, K., et al. Complex I - complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
- Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
- Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
