Artykuł metodologiczny

Szybkie wykrywanie fenotypów neurorozwojowych w ludzkich neuronalnych komórkach prekursorowych (NPC)

DOI:

10.3791/56628

⸱

2 marca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 2Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 3The Child Health Institute of NJ, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Services, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4The Child Health Institute of NJ, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 5Department of Genetics, Rutgers University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procesy neurorozwojowe, takie jak proliferacja, migracja i rozrost neurytów, są często zaburzone w chorobach neuropsychiatrycznych. W związku z tym przedstawiamy protokoły szybkiej i powtarzalnej oceny tych procesów neurorozwojowych u ludzkich NPC pochodzących z iPSC. Protokoły te pozwalają również na ocenę wpływu odpowiednich czynników wzrostu i terapii na rozwój NPC.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój ludzkiego mózgu przebiega poprzez szereg precyzyjnie zaplanowanych procesów, z wcześniejszymi etapami wyróżniającymi się proliferacją, migracją i wzrostem neurytów; a późniejsze etapy charakteryzujące się wzrostem aksonów/dendrytów i tworzeniem synaps. W zaburzeniach neurorozwojowych często jeden lub więcej z tych procesów jest zakłóconych, co prowadzi do nieprawidłowości w tworzeniu i funkcjonowaniu mózgu. Wraz z pojawieniem się technologii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC), naukowcy mają teraz obfity zapas ludzkich komórek, które można różnicować w praktycznie każdy typ komórek, w tym neurony. Komórki te mogą być wykorzystywane do badania zarówno prawidłowego rozwoju mózgu, jak i patogenezy choroby. Wiele protokołów wykorzystujących hiPSC do modelowania chorób neuropsychiatrycznych wykorzystuje terminalnie zróżnicowane neurony lub wykorzystuje systemy hodowli 3D zwane organoidami. Chociaż metody te okazały się nieocenione w badaniu patogenezy chorób u ludzi, istnieją pewne wady. Różnicowanie hiPSC w neurony i generowanie organoidów to długotrwałe i kosztowne procesy, które mogą mieć wpływ na liczbę eksperymentów i zmiennych, które można ocenić. Ponadto, podczas gdy postmitotyczne neurony i organoidy umożliwiają badanie procesów związanych z chorobą, w tym wzrostu dendrytów i synaptogenezy, wykluczają badanie wcześniejszych procesów, takich jak proliferacja i migracja. W zaburzeniach neurorozwojowych, takich jak autyzm, liczne dowody genetyczne i pośmiertne wskazują na defekty we wczesnych procesach rozwojowych. Neuronalne komórki prekursorowe (NPC), wysoce proliferacyjna populacja komórek, mogą być odpowiednim modelem do zadawania pytań dotyczących procesów ontogenetycznych i inicjacji choroby. Teraz rozszerzamy metodologie zdobyte podczas badań nad rozwojem w kulturach kory mózgowej myszy i szczurów na ludzkich NPC. Wykorzystanie NPC pozwala nam w ciągu zaledwie kilku dni zbadać fenotypy związane z chorobą i określić, w jaki sposób różne zmienne (np. czynniki wzrostu, leki) wpływają na procesy rozwojowe, w tym proliferację, migrację i różnicowanie. Ostatecznie ten zestaw narzędzi może być wykorzystywany w powtarzalny i wysokoprzepustowy sposób do identyfikacji specyficznych dla choroby mechanizmów i fenotypów w zaburzeniach neurorozwojowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użycie prostszych organizmów i modeli mysich wyjaśniło mechanizmy podstawowego rozwoju mózgu, jak również patogenezę chorób. Pomimo tych postępów, etiologia wielu zaburzeń neuropsychiatrycznych pozostaje nieuchwytna, ponieważ nie wszystkie odkrycia dotyczące prostszych organizmów są bezpośrednio związane ze złożonymi aspektami chorób ludzkich. Co więcej, większa złożoność ludzkiego mózgu często utrudnia modelowanie rozwoju i zaburzeń u zwierząt. Wraz z ewolucją i postępem technologii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC), komórki somatyczne mogą być przeprogramowywane w komórki macierzyste, a następnie różnicowane w komórki neuronalne w celu badania chorób ludzkich. Postępy w dziedzinie hiPSC i technologii "omicznych" (genomika, transkryptomika, proteomika, metabolomika) mogą zrewolucjonizować zrozumienie rozwoju ludzkiego mózgu. Technologie te umożliwiają obecnie podejście "medycyny precyzyjnej" do charakterystyki chorób neuropsychiatrycznych w poszczególnych przypadkach.

Obecnie podstawowym elementem modelowania choroby hiPSC jest różnicowanie komórek w określone podtypy neuronów w jednej warstwie lub użycie systemu hodowli 3D zwanego organoidem do podsumowania aspektów rozwoju mózgu1,2,3. Systemy te okazały się niezwykle cenne w badaniu i odkrywaniu unikalnych aspektów rozwoju i chorób człowieka4,5,6,7. Jednak zarówno hodowle neuronów, jak i organoidy często wymagają od tygodni do miesięcy w hodowli, zanim będą gotowe do badania. Czasochłonny charakter tych protokołów i ilość zasobów potrzebnych do utrzymania tych systemów hodowli często ogranicza liczbę eksperymentów, które można przeprowadzić, oraz liczbę zmiennych (takich jak czynniki wzrostu lub leki), które można przetestować. Co więcej, wiele badań wykorzystujących postmitotyczne neurony i organoidy koncentrowało się na procesach takich jak rozrost dendrytów lub tworzenie synaps, które zachodzą w późniejszym okresie rozwoju. Chociaż procesy te są związane z patologią zaburzeń rozwojowych, takich jak autyzm i schizofrenia, wcześniejsze zdarzenia rozwojowe, które występują przed ostatecznym różnicowaniem neuronów, są również ważne dla patogenezy choroby8,9,10,11,12,13. Rzeczywiście, ostatnie badania genomiczne pokazują, że okres środkowego okresu płodowego, który składa się z proliferacji, procesu rozrostu i migracji, jest szczególnie ważny w patogenezie autyzmu11,14. Dlatego ważne jest, aby badać populacje neuronalnych komórek macierzystych i progenitorowych, aby lepiej zrozumieć te wcześniejsze procesy. Systemy organoidowe, które są uważane za lepiej podsumowujące rozwój ludzkiego mózgu ze względu na ich naturę 3D i zorganizowaną strukturę, zawierają pulę progenitorów, która została wykorzystana do badania niektórych z tych wcześniejszych wydarzeń. Jednak populacja progenitorów w organoidach jest często rzadka i bardziej przypomina promieniste komórki glejowe niż nerwowe komórki macierzyste lub progenitorowe5,15. W związku z tym korzystne byłoby posiadanie metody o wysokiej przepustowości do badania wczesnych etapów rozwoju neurologicznego w aktywnie proliferacyjnej populacji komórek.

W laboratorium stworzyliśmy protokół, który wykorzystuje neuronalne komórki prekursorowe (NPC) pochodzące z hiPSC, mieszaną populację nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych, która jest wysoce proliferacyjna, do badania procesów neurorozwojowych, takich jak proliferacja, migracja komórek i początkowe rozszerzenie procesu (neuryt). Testy te zostały opracowane na podstawie technik stosowanych w naszym laboratorium od dziesięcioleci, aby z powodzeniem badać rozwój neurologiczny w kulturach korowych szczurów i myszy16,17,18,19,20,21,22,23. Co ważne, wykazano również, że fenotypy i sygnały regulacyjne zdefiniowane w systemach hodowli szczurów i myszy są wysoce predykcyjne w stosunku do mechanizmów aktywnych in vivo, co wskazuje na wartość tych technik16,17,18,19,24. Po wstępnym zróżnicowaniu hiPSC do NPC, metody te pozwalają nam badać ważne procesy rozwojowe w ciągu kilku dni. Metody te mają wiele zalet: (1) wymagają niewielkiego stopnia zaawansowania sprzętu i są łatwe do wdrożenia, (2) w krótkim czasie można przeprowadzić wiele powtórzeń eksperymentalnych, co pozwala na szybkie potwierdzenie odtwarzalności wyników, oraz (3) zmienne hodowlane, takie jak matryce powlekające, wpływ czynników wzrostu i aktywność leków, można szybko i tanio przetestować. Ponadto wykorzystujemy dobrze ugruntowaną rolę zewnątrzkomórkowych czynników wzrostu jako krytycznych regulatorów różnych procesów rozwojowych. NPC byli narażeni na wybrane sygnały rozwojowe, które bezpośrednio stymulują zdarzenia, takie jak proliferacja, wzrost neurytów i migracja komórek, i odkryli, że zwiększają zdolność do identyfikowania defektów, które nie są widoczne w warunkach kontrolnych19,25,26,27,28. Podobnie, łatwość oceny leków stanowi potężną drogę do zastosowania technik medycyny precyzyjnej w celu przetestowania skuteczności różnych interwencji terapeutycznych. W związku z tym protokół ten ułatwia wysokowydajną, powtarzalną i prostą metodologię badania wczesnego rozwoju mózgu, patogenezy choroby oraz potencjalnego korzystnego wpływu czynników wzrostu i leków na fenotypy neurorozwojowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Procedury bezpieczeństwa i konserwacja szafy bezpieczeństwa biologicznego

  1. Procedury bezpieczeństwa bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2 (BSL-2)
    1. Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi pracy z materiałami BSL-2. Materiały BSL-2 należy utylizować zgodnie z praktykami instytucji. Wskaż pomieszczenia i sprzęt, które są używane do materiałów BSL-2. Nosić wszystkie środki ochrony osobistej (PPE), w tym fartuch laboratoryjny i rękawice.
  2. Konserwacja szafy bezpieczeństwa biologicznego
    1. Używaj komory bezpieczeństwa biologicznego certyfikowanej do stosowania materiałów na poziomie BSL-2.
    2. Włącz światło UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego na co najmniej 15 minut, a następnie spryskaj powierzchnie 10% roztworem wybielacza. Pozostaw roztwór wybielacza na 15 minut, wytrzyj szafkę i włącz przepływ powietrza przed użyciem.
  3. Procedury bezpieczeństwa radioaktywnego trytiowanego [3H]-tymidyny (trytu)
    UWAGA: Tryt jest źródłem promieniotwórczym kategorii 5, kategorii "najprawdopodobniej nie jest niebezpieczne". Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi pracy z promieniotwórczością. Niektóre instytucje mogą wymagać certyfikatów lub pozwoleń na obchodzenie się z trytem.
    1. Weź udział w szkoleniu prowadzonym przez instytucję na temat prawidłowego obchodzenia się z trytem i jego utylizacji. Odpady radioaktywne należy utylizować w odpowiednich pojemnikach, zgodnie z polityką instytucji. Podczas pracy z trytem należy nosić środki ochrony indywidualnej.

2. Indukcja neuronalna z iPSC

UWAGA: Aby stworzyć NPC, zastosowano nieco zmodyfikowaną wersję protokołu, który towarzyszy dostępnemu na rynku zestawowi do indukcji neuronowej. Zestaw składa się z pożywki Neurobaseal (NB) i 50x suplementu do indukcji neuronalnej (NIS), który służy do wykonania 1x pożywki do indukcji neuronalnej (NIM). NIS jest również używany do produkcji 100% nośnika rozszerzeń (patrz sekcja 3.1). Link do protokołu znajduje się w sekcji Materiały i sprzęt oraz referencje43.

  1. Przejście iPSC, gdy stają się zlewające w 70 - 80%.
  2. Umieść 300 000 iPSC w 1 dołku na 6-dołkowej płytce pokrytej kwasem 6-dołkowym pokrytym macierzą zewnątrzkomórkową z kwalifikacjami ESC (żel naśladujący ECM) zawierającą 2 ml pożywki iPSC bez podawania z 5 μM inhibitora ROCK. Patrz sekcja 3.2 w celu uzyskania instrukcji dotyczących powlekania studzienek żelem naśladującym ECM.
  3. Dzień później usuń pożywkę iPSC + inhibitor ROCK i umyj iPSC raz 1x PBS. Dodać 2 ml NIM do iPSCs.
    UWAGA: 50 ml NIM wytwarza się przez dodanie 1 ml 50x NIS i 250 μL (50 jednostek/mL, 5 μL/ml) penicyliny/streptomycyny (P/S) do 49 ml pożywki NB.
  4. Zmieniaj pożywkę indukcji neuronalnej co 2 dni, odsysając zużytą pożywkę i zastępując ją 2 ml NIM, aż komórki staną się zlewające (około 4 - 5 dni). Zmieniaj podłoże codziennie, gdy komórki się zlewają.
  5. Komórki pasażowe po 7 dniach w NIM i płytce do 6-dołkowej płytki pokrytej żelem ECM, zawierającej 2 ml 100% pożywki eksplatacyjnej i inhibitora 5 μM ROCK. Komórki są w tym momencie uważane za NPC Passage 0 (P0). Zapoznaj się z sekcją 3.1 poniżej, aby uzyskać instrukcje dotyczące tworzenia 100% nośników rozszerzeń.
  6. Komórki pasażowe przy użyciu metod opisanych w sekcji 3.4. Poczekaj, aż komórki osiągną P2 i zlewają się, zanim rozdzielą się na barwienie dla markerów NPC i posiew do eksperymentów (Rysunek 1).

3. Pożywki hodowlane, powlekanie i pielęgnacja NPC

  1. Przygotowanie mediów do konserwacji NPC (100% Expansion Media):
    1. Przygotuj 50 ml 100% pożywki rozszerzającej, łącząc 24,5 ml DMEM/F12 z 24,5 ml NB.
    2. Dodaj 1 ml 50x NIS do roztworu DMEM/F12 + NB. Dodać 250 μl roztworu P/S do pożywki.
      UWAGA: Media można przechowywać w lodówce (4 °C) i używać do 2 tygodni. Mniejsze objętości pożywki można uzyskać, dostosowując objętości DMEM/F12+ NB+NIS przy użyciu tych samych proporcji, co dla objętości 50 ml.
  2. Przygotowanie płytki hodowlanych pokrytych żelem ECM do konserwacji NPC
    1. Podwielokrotność żelu naśladującego ECM w objętości potrzebnej do wytworzenia 6 ml roztworu roboczego. Obliczyć podwielokrotną objętość, patrząc na arkusz świadectwa analizy, ponieważ współczynnik rozcieńczenia żelu naśladujący ECM różni się w zależności od partii i partii.
    2. Rozmrozić podwielokrotność żelu naśladującego ECM na lodzie i rozpuścić w 6 ml zimnej pożywki DMEM/F12.
    3. Dodać 1 ml roztworu żelu naśladującego ECM/DMEM/F12 do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Inkubować 6-dołkową płytkę z roztworem żelu naśladującym ECM przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Po 30 minutach inkubacji odessać roztwór żelu naśladującego ECM i zastąpić go 100% podłożem rozprężnym lub płytkami chłodniczymi (4 °C, do 1 tygodnia) bez zasysania roztworu żelu naśladującego ECM.
  3. Utrzymanie NPC
    1. Umieść NPC o gęstości 1,5 miliona komórek w studzience pokrytej żelem naśladującym ECM, zawierającej 2 ml 100% podłoża ekspandacyjnego.
    2. Inkubować NPC w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku z 5% CO2 .
    3. Dodaj 5 μM inhibitora ROCK do pożywki dla NPC o stężeniu P3 lub niższym lub dla rozmrożonych NPC, aby zapobiec nadmiernej śmierci komórek. Zmień podłoże po 24 godzinach, aby usunąć inhibitor ROCK.
    4. Przenikanie komórek co 4 - 9 dni, w zależności od tego, kiedy zaczynają się zlewać. Komórki uważa się za zlewające się, gdy stają się gęsto upakowaną monowarstwą pokrywającą całe dno powierzchni naczynia.
    5. Płytki NPC o gęstości od 1 do 1,5 miliona komórek na jeden dołek na płytce 6-dołkowej (patrz sekcja 3.4). Usuwaj zużyte nośniki co 48 godzin i zastąp je 2 ml 100% nośnika rozszerzającego.
  4. Podnoszenie, dysocjacja i granulowanie NPC w celu konserwacji i/lub poszycia w warunkach eksperymentalnych
    1. Odessać pożywkę, przemyć komórki raz 1x PBS. Odessać PBS i dodać 500 μl 1x roztworu do odrywania komórek do 1 studzienki z napływającymi NPC. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Dodać 500 μl PBS o temperaturze pokojowej (RT) i umyć studzienkę za pomocą pipety P-1000, aby zapewnić usunięcie komórek. Zebrać komórki + roztwór PBS do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Ponownie umyj płytkę 1 ml PBS i dodaj płyn do probówki.
    3. Wiruj komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut, aby ogranulować.
    4. Usuń supernatant z osadu komórkowego i ponownie zawieś komórki w 1-5 ml wstępnie podgrzanego podłoża DMEM/F12. Rozcieńczyć komórki do gęstości od 1 do 4 milionów komórek/ml pożywki. Określ ilościowo komórki za pomocą hemocytometru.
    5. Na płytce należy podać wymaganą liczbę komórek, specyficzną dla utrzymania NPC (sekcja 3.3) lub dla indywidualnego przeprowadzanego testu (więcej informacji można znaleźć w kolejnych sekcjach).
    6. Dostosuj objętość zawiesiny komórek za pomocą pożywki tak, aby na każdą studzienkę/naczynie użyto od 15 do 100 μl komórek. Ta mała objętość posiewu zapewnia równomierne rozmieszczenie komórek i że czynniki wzrostu, leki lub substraty w pożywce nie są rozcieńczane.
    7. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C. Zmieniać pożywkę co 48 godzin w celu konserwacji NPC lub zapoznać się ze szczegółami dotyczącymi poszczególnych testów.
  5. przygotowanie podłoża do warunków eksperymentalnych (30% podłoża ekspandacyjnego)
    1. Rozcieńczyć 100% pożywkę eksplatacyjną o 70% (zwaną 30% ekspansją), dodając roztwór 1:1 DMEM/F12 + NB, aby uzyskać pożywkę do warunków eksperymentalnych.
    2. Przygotować 20 ml 30% pożywki eksplatacyjnej, dodając 6 ml 100% pożywki eksplatacyjnej i rozcieńczając 7 ml pożywki NB i 7 ml pożywki DMEM/F12. Dodać 5 μl/ml roztworu P/S.
      UWAGA: Jeśli 100% pożywki zawiera już P/S, dodaj 5 μL/ml dla połączonego DMEM/F12+ NB= (14 mL) x (5 μL/mL) = 70 μL P/S zamiast 100 μL.
    3. Dodać podłoża powlekające i czynniki wzrostu w żądanych stężeniach do 30% podłoża rozprężnego.

4. Ocena syntezy DNA, wejścia w fazę S i liczby komórek NPC

  1. Przygotowanie do syntezy DNA, wejścia do fazy S i oznaczania liczby komórek
    1. Przygotować roztwór podstawowy poli-D-lizyny (PDL) o stężeniu 1 mg/ml w dH2O i wysterylizować filtrem. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 w dH2O, aby uzyskać roztwór PDL o stężeniu 0,1 mg/ml i dodać 300 μl do każdego dołka na płytce 24-dołkowej lub 1 ml do naczynia o średnicy 35 mm. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Przemyć studzienki PDL 3 razy przez 5 minut za pomocą dH2O. Odessać dH2O i dodać 300 μl / studzienkę lub 1 ml / miskę lamininy (5 μg / ml) rozcieńczonej w 1x PBS. Przykryj płytki parafilmem i przechowuj w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego przez noc w temperaturze pokojowej (12 do 24 godzin).
    3. Przygotować 30% pożywkę rozszerzającą (patrz sekcja 3.5) po 12 do 24 godzinach. Dodać nośniki, czynniki wzrostu lub leki o pożądanym stężeniu w objętościach mniejszych niż 10% całkowitego roztworu, aby uniknąć rozcieńczania NIS w 30% pożywce rozszerzającej.
    4. Umyć każdą studzienkę 24-dołkowej płytki dwukrotnie 1x PBS (5 min każdy). Odessać 1x PBS i dodać 450 μl pożywki (bez lub z lekami/czynnikami wzrostu). Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 15 minut przed posiewem komórek.
    5. Dla każdego eksperymentu ustaw 2-3 dołki lub naczynia na warunek.
    6. Płytowe postacie niezależne (patrz sekcja 3.4):
    7. Test syntezy DNA NPC: 100 000 komórek / dołek w płytce 24-dołkowej
    8. Wejście fazy S: 500 000 ogniw/czasza 35 mm
    9. Test liczby komórek: 50 000 komórek / studzienkę w 24-dołkowej płytce
  2. Test syntezy DNA neuronalnych komórek prekursorowych
    1. Umieść 100 000 komórek / basenie na 24-dołkowej płytce i oceń w trzech egzemplarzach/warunkach.
    2. Dodać radioaktywną, trytytowaną [3H]-tymidynę do pożywki hodowlanej (1,5 μCi/ml) w każdym dołku po 46 godzinach w hodowli. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 h.
      UWAGA: W przypadku korzystania z materiałów radioaktywnych należy przejść szkolenie w swojej instytucji, przestrzegać protokołów bezpieczeństwa radioaktywnego i wyrzucać materiały radioaktywne do odpowiednio wyznaczonych pojemników na odpady.
    3. Po 2 godzinach usunąć i odpowiednio zutylizować pożywki radioaktywne. Dodać 300 μl wstępnie podgrzanej 0,25% trypsyny-EDTA (0,5 mM) do każdej studzienki i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Włącz kombajn do kombajnów (patrz rozdział Materiały i sprzęt) oraz pompę i upewnij się, że ciśnienie pompy jest poniżej 200 PSI. Umieść bibułę filtracyjną w przestrzeni w kombajnie kombajnowym i oderwij prawy róg, aby zaznaczyć orientację papieru.
    5. Umieść rurki zbiorcze kombajnu komórkowego w pustej "czystej" tacy i naciśnij pranie wstępne, aby zwilżyć bibułę filtracyjną. Umieścić probówki zbiorcze w dołkach na próbki i uruchomić (rozpocząć).
    6. Gdy kombajn komórkowy zakończy pobieranie próbek, podnieś zacisk i przesuń bibułę filtracyjną, aby powtórzyć tę czynność dla wszystkich zestawów próbek. Zawsze pierz wstępnie na pustym, "pustym" talerzu.
    7. Wysuszyć bibułę filtracyjną pod źródłem światła i umieścić odpowiednie fiolki na tacy. Wybij papierowe płytki do fiolek i dodaj 2 ml płynnego koktajlu scyntylacyjnego do każdej fiolki. Fiolki z nakrętką i etykietą.
    8. Inkubować fiolki w płynnym koktajlu scyntylacyjnym przez co najmniej 1 godzinę przed odczytaniem liczby na minutę (CPM) na maszynie scyntylacyjnej.
  3. Test wejścia NPC w fazie S
    1. Patrz sekcja 3.4, aby zapoznać się z krokami podnoszenia, dysocjacji, osadzania i ponownego zawieszania komórek.
    2. Umieść 500 000 komórek na naczyniu w szalkach o średnicy 35 mm przygotowanych w sekcji 4.1, tylko 1 naczynie/warunek na tym etapie.
    3. Mieszaj naczynia tam iz powrotem we wszystkich kierunkach, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 46 godzin.
    4. Przygotuj trzy płytki 35 mm pokryte PDL/Laminin na każdy warunek po 24 godzinach. Na przykład, jeśli istnieje jedna szalka 35 mm z 30% podłożem rozszerzającym i jedna szalka 35 mm z 30% podłożem rozszerzającym + FGF (10 ng / ml), pokryj 6 płytek PDL/Laminin do użycia następnego dnia.
    5. Dodać 2 μl/ml 5 mM EdU do kultur po 46 godzinach. Inkubować przez 2 godziny.
    6. Oddzielić komórki i rozdzielić je na osady (patrz punkt 3.4). Ponownie zawiesić osad komórkowy w 3 ml 30% podłoża rozprężającego lub 3 ml 30% podłoża rozprężnego + pożądane czynniki wzrostu/leki.
    7. Talerz 1 ml na naczynie na wstępnie powlekanych naczyniach PDL/Laminin. Mieszaj naczynia tam iz powrotem we wszystkich kierunkach, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, aby komórki przylgnęły do naczynia. Zobacz Rysunek 2 dla uproszczonego harmonogramu.
  4. Analiza wejścia w fazę S
    1. Utrwal naczynia lodowatym 4% paraformaldehydem (PFA w 1x PBS) przez 20 minut. Następnie umyj naczynia 3 razy przez 5 minut za pomocą 1x PBS.
    2. Dodaj 1 ml 1x PBS z 0,05% azydkiem sodu, aby zapobiec rozwojowi bakterii i grzybów. Komórki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy, jeśli naczynia (uszczelnione parafilmem) są przechowywane w roztworze PBS + Azydek Sodu, chociaż nie wszystkie antygeny immunologiczne są dobrze zachowane po długich opóźnieniach w analizie.
    3. Oznaczanie komórek przy użyciu komercyjnego zestawu reakcyjnego EdU (patrz protokół producenta). Wybarwić komórki za pomocą DAPI lub innego markera jądrowego i obrazować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
    4. Oceń proporcję komórek dodatnich EdU w stosunku do całkowitej liczby żywych komórek (całkowita liczba komórek) ślepych w 10 systematycznie losowych polach (10x). Nie należy uwzględniać martwych komórek w analizie.
    5. Wykorzystaj zarówno obrazy kontrastu fazowego, jak i obrazy fluorescencyjne, aby określić dodatnie barwienie EdU i ustalić, które komórki są żywe lub martwe (Rysunek 3).
    6. Policz wszystkie komórki, które mają zarówno gładką, jak i równą błonę komórkową w ustawieniach kontrastu fazowego oraz duże nierozdrobnione jądro za pomocą fluorescencyjnego barwienia jądrowego DAPI, ponieważ te komórki są żywe (Rysunek 3A-B).
    7. Wyklucz wszystkie komórki, które są jasne fazowo, mają uszkodzoną nierówną błonę komórkową i mają małe, skondensowane jądro, jak pokazano za pomocą obrazowania fluorescencyjnego DAPI, ponieważ te komórki są martwe (Rysunek 3A-B). Oceń żywe komórki pod kątem ekspresji EdU, identyfikując komórki, które mają jasne fluorescencyjne zabarwienie EdU pokrywające całe jądro lub nakrapiane barwienie fluorescencyjne w jądrze (Rysunek 3C).
  5. Test liczby komórek NPC
    1. Po 2 dniach w hodowli oznaczyć i przygotować 1,5 ml probówek do mikrowirówek i 0,5 ml probówek do mikrowirówek. Do każdej probówki o pojemności 0,5 ml dodaj 5 μl błękitu trypanowego.
    2. Do każdego dołka z 24-dołkowej płytki usunąć pożywkę i dodać 200 μl 1x roztworu do odrywania komórek i umieścić w inkubatorze na 10 do 15 minut.
    3. Po wyznaczonym czasie, gdy komórki się podniosą, dodaj żądaną ilość 1x PBS do każdego dołka.
      UWAGA: Zazwyczaj, w dniu 2, dodać 300 μl 1x PBS do komórek zawierających studzienkę plus 200 μl roztworu oddzielającego, aby uzyskać całkowitą objętość 500 μL. Przy dodatkowym czasie inkubacji hodowli, gdy komórki stają się bardziej zlewne, w razie potrzeby zwiększ objętość rozcieńczenia. Na przykład w dniu 4 dodaj 500 μl 1x PBS, a w dniu 6 dodaj 800 μL 1x PBS. Całkowite objętości wynoszą odpowiednio 700 μl i 1 ml.
    4. Używając pipety P-1000, pipetuj w górę i w dół w każdym dołku 4 do 5 razy, aby usunąć komórki. Zbadaj płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że wszystkie komórki się odłączyły. Przenieś komórki do probówek o pojemności 1,5 ml.
    5. Odwróć probówki o pojemności 1,5 ml z rozcieńczonymi komórkami 2 do 3 razy. Następnie pobrać 50 μl porcji komórek ze środka probówki i dodać do probówek o pojemności 0,5 ml z błękitem trypanowym (patrz 4.5.1).
    6. Pipetować roztwór kuwety w górę i w dół 2 do 3 razy. Dodaj komórki do hemocytometru i natychmiast przeanalizuj. Odczekanie dłużej niż 10 minut może zwiększyć śmierć komórek lub obecność komórek, które wchłonęły błękit trypanowy.
    7. Ostrożnie dodaj 10 μl mieszaniny komórek + błękitu trypanowego z każdej strony hemocytometru, aby przeprowadzić powtórzone zliczenia. Policz komórki za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym. Nie należy liczyć martwych komórek ani ciemnoniebieskich komórek, które wchłonęły błękit trypanowy.
    8. Aby uzyskać całkowitą liczbę komórek, użyj średniej liczby komórek liczonej od 4 rogów hemocytometru i zastosuj następujące równanie:
      Średnia liczba komórek x objętość pożywki (ml) x 10 000 = całkowita liczba komórek/studzienka
    9. Zassać i powtórzyć procedurę na pozostałych studzienkach. Zmieniaj nośniki w komórkach, które nie są zliczane, co 48 godzin. Powtórz test w dniach 4 i 6.

5. Test neurytu NPC

  1. Przygotowanie naczyń i pożywek do oznaczania neurytów
    1. Przygotować roztwór podstawowy poli-d-lizyny (PDL) o stężeniu 1 mg/ml w dH2O i wysterylizować filtrem. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 w dH2O, aby uzyskać roztwór PDL o stężeniu 0,1 mg/ml i dodać 1 ml do każdej płytki o średnicy 35 mm. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    2. W międzyczasie należy przygotować 30% pożywkę ekspandacyjną (patrz sekcja 3.5) i dodać do pożywki 5 μg/ml (5 μl/ml) roztworu fibronektyny (1 mg/ml bulionu).
    3. Po przygotowaniu pożywki dodaj nośniki, czynniki wzrostu lub leki o pożądanych stężeniach.
      UWAGA: Najlepiej jest dodawać nośnik, czynniki wzrostu lub leki w objętościach <10% całkowitego roztworu, aby uniknąć rozcieńczania fibronektyny i innych składników w 30% pożywce ekspandcyjnej.
    4. Po 20 minutach umyj naczynia PDL 3 razy przez 5 minut za pomocą dH2O, aby usunąć nadmiar PDL. Upewnij się, że naczynia są suche przed dodaniem podłoża.
    5. Umieść 1 ml pożywki (z lekami/czynnikami wzrostu lub bez) + roztwór fibronektyny w każdym naczyniu pokrytym PDL.
    6. Inkubować szalki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut przed posiewem komórek, aby zapewnić prawidłowe przyłączenie fibronektyny do PDL.
    7. Dla każdego eksperymentu ustaw od 2 do 3 szalek na każdy warunek (np. 3 naczynia zawierające pojazd, 3 naczynia zawierające lek).
  2. Posiewanie NPC do testu neurytowego
    1. Patrz sekcja 3.4, aby zapoznać się z krokami podnoszenia, dysocjacji, osadzania i ponownego zawieszania komórek.
    2. Umieść 50 000 komórek na naczyniu w naczyniach przygotowanych w sekcji 5.1. Mieszaj naczynia tam iz powrotem we wszystkich kierunkach, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek.
    3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
  3. Analiza neurytów
    1. Po inkubacji komórek przez 48 godzin, odessać pożywkę i utrwalić naczynia lodowatym 4% PFA przez 20 minut.
    2. Po 20 minutach umyj naczynia 3 razy przez 5 minut za pomocą 1x PBS. Po ostatnim umyciu dodaj 1 ml 1x PBS z 0,05% Azide Sodu.
    3. Analizuj szalki na ślepo w mikroskopie z kontrastem fazowym przy 32X. Policz całkowitą liczbę komórek i komórek z neurytami w 3, 1 cm rzędach, wybranych w losowych, ale powtarzalnych pozycjach. Policz co najmniej 150 komórek na szalkę, aby zapewnić odpowiednie pobieranie próbek.
      UWAGA: Neuuryt definiuje się jako przedłużenie (proces) od ciała komórki o długości >2 średnicy ciała. W przypadku komórek z wieloma procesami kryterium brany jest pod uwagę najdłuższy proces. Komórki z procesami o długości ciała komórki <2 nie są uwzględniane (Rysunek 4).
    4. Dodaj do siebie całkowitą liczbę komórek i całkowitą liczbę komórek z neurytami w każdym naczyniu. Oblicz % komórek z neurytami. Uśrednij procent komórek z neurytami w replikowanych naczyniach. Pewność odtwarzalności doświadczalnej jest ustalana, gdy wszystkie rzędy w każdej daszce są podobne, a średnie między potrawami są bardzo podobne, z błędem standardowym średniej (SEM) <10%.
    5. Alternatywnie można przeanalizować neuryty, przeprowadzając immunocytochemię dla markerów, takich jak beta-III-tubulina (TUJ1) lub MAP2. Po barwieniu w poszukiwaniu interesującego Cię markera wykonaj 10 systematycznie losowych obrazów pod mikroskopem fluorescencyjnym z powiększeniem 10X. Obraz co najmniej 200 komórek. W takim przypadku uzyskaj obrazy nie zbyt blisko krawędzi naczynia. Przeanalizuj procent komórek z neurytami TUJ1 lub MAP2+ (patrz Rysunek 10 dla przykładu).

6. Test migracji neurosfery NPC

  1. Powstawanie neurosfery
    1. Dodaj 1 ml 100% podłoża rozprężnego do 35-milimetrowego naczynia bez podłoża powlekającego. Inkubować szalki przez co najmniej 15 minut w temperaturze 37 °C przed posiewem NPC. Przygotuj 2-3 szalki, aby upewnić się, że będzie wystarczająco dużo neurosfer do testu migracji komórek.
      UWAGA: Brak podłoża powlekającego zapewnia, że NPC pozostają zawieszone w pożywce, co jest niezbędne do tworzenia neurosfery. Powlekanie naczyń zapobiegnie tworzeniu się neurosfery.
    2. Patrz Sekcja 3.4 na temat kroków do podnoszenia, dysocjacji i osadzania komórek. Zawiesić osad komórkowy w 2-5 ml wstępnie podgrzanego 100% podłoża rozprężnego. Umieść 1 milion NPC w każdej 35-milimetrowej naczyniu przygotowanym w sekcji 6.1.1.
    3. Inkubuj NPC w temperaturze 37 °C przez 48 do 96 godzin, aby umożliwić NPC agregację i tworzenie neurosfer. Oceń rozmiar kuli za pomocą linijki na żywo w mikroskopie z kontrastem fazowym. Poczekaj, aż większość kul osiągnie przybliżoną średnicę 100 μm (± 20 μm) (Rysunek 5). Mniejsze kule całkowicie rozproszą się i rozpadną podczas testu migracji.
  2. Przygotowanie płytek do oznaczania migracji neurosfery
    1. Podwielokrotności żelu naśladującego ECM (patrz sekcja 3.2) rozpuścić w 6 ml 30% pożywki eksplatacyjnej. Po przygotowaniu roztworu żelu naśladującego ECM/30% podłoża ekspandacyjnego dodaj nośniki, czynniki wzrostu lub leki o pożądanych stężeniach.
      UWAGA: Stężenia nośnika, leku i czynnika wzrostu należy zwiększyć, aby uwzględnić dodanie 200 μl neurosfer w sekcji 6.3.
    2. Płytka 1 ml żelu naśladującego ECM / 30% roztworu pożywki ekspancyjnej (± nośniki, czynniki wzrostu lub leki) do jednego dołka na płytce 6-dołkowej. Wykonaj 2 - 3 dołki na warunki eksperymentalne. Alternatywnie można użyć szalek 35 mm. Inkubować płytki przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: NIE WOLNO zasysać roztworu żelu naśladującego ECM/30% pożywki ekspansywacyjnej do tego testu. Powlekanie kulek na zasysanym żelu ECM-Mimic doprowadzi do szybkiej i nadmiernej migracji.
  3. Poszycie neurosfer
    1. Zbierz neurosfery utworzone w sekcji 6.1 i umieść je w stożkowej rurce. Umyj naczynia o średnicy 35 mm 1 ml 1x PBS, aby upewnić się, że wszystkie neurosfery zostały zebrane. Obracaj zebrane neurosfery w tempie 100 x g przez 5 minut.
    2. Ponownie zawiesić neurosfery w 1 - 3 ml wstępnie podgrzanego 30% podłoża rozprężnego. Jeśli zbierze się 1 miskę neurosfer, 1 ml pożywki jest używany do ponownego zawieszenia kulek. Jeśli zostaną zebrane 2 szalki, dodaje się 2 ml pożywki w celu ponownego zawieszenia kulek itp. Delikatnie pipetuj i używaj tylko P-1000, aby upewnić się, że kulki nie są uszkodzone.
    3. Umieścić 200 μl zawieszonych neurosfer w żelu naśladującym ECM/30% roztworze ekspandującym wykonanym w sekcji 6.2. Płyty skalne we wszystkich kierunkach, aby równomiernie rozprowadzić neurosfery. Inkubować płytki przez 48 godzin w temperaturze 37°C.
    4. Usuń żel naśladujący ECM/30% roztwór podłoża eksplatacyjnego i napraw komórki w 4% PFA, umyj i utrzymuj komórki w 1x PBS + 0,05% Azide Sodu.
  4. Analiza neurosfer
    1. Uzyskuj obrazy całych neurosfer przy użyciu ustawień kontrastu fazowego na 10x. Upewnij się, że sfery nie stykają się ze sobą. Zmierz średnią migrację za pomocą oprogramowania ImageJ.
    2. Obrysuj zewnętrzny kontur neurosfery za pomocą narzędzia do rysowania linią odręczną. Dostęp do linii odręcznej można uzyskać, klikając prawym przyciskiem myszy ikonę linii prostej. Ręczne śledzenie za pomocą myszy.
    3. Użyj funkcji miary, aby obliczyć powierzchnię śladu. Upewnij się, że "obszar" jest wybrany jako odczyt w oknie "Ustaw pomiary" znajdującym się w zakładce Analiza. Zobacz Rysunek 6 dla śladu zewnętrznego konturu w kolorze niebieskim.
    4. Śledź wewnętrzną masę komórkową kuli i zmierz powierzchnię. Zobacz Rysunek 6 dla śladu wewnętrznego konturu w kolorze czerwonym. Określ ilościowo średnią migrację, odejmując wewnętrzną masę komórki od całkowitego obszaru neurosfery.
    5. Zmierz neurosfery, które wykazują gęsto upakowaną wewnętrzną masę komórkową z komórkami migrującymi jako ciągły dywan (Rysunek 6).
    6. Nie uwzględniaj komórek znajdujących się na zewnątrz dywanu lub odłączonych od neurosfery do pomiaru. Zobacz Rysunek 6 zawiera przykłady komórek (zakreślonych na biało), które są wyłączone z zewnętrznego pomiaru dywanu. Przeanalizuj co najmniej 20 neurosfer dla każdego stanu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z celów tych badań jest określenie aktywności proliferacyjnej NPC, czyli wzrostu liczby komórek. Osiąga się to poprzez ocenę syntezy DNA całej populacji komórek, podejście wysokoprzepustowe, które mierzy włączenie radioaktywnej tymidyny znacznikowej do ekstraktów komórkowych i odzwierciedla wszystkie komórki zaangażowane w fazę S, niezależnie od tego, czy syntetyzują przez 5 minut, czy przez całe dwie godziny. Dodatkowo testy te pozwalają określić proporcję komórek, które wchodzą w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione tutaj protokoły ilustrują szybkie i proste metody badania podstawowych procesów neurorozwojowych oraz testowania czynników wzrostu i leków przy użyciu nerwowych komórek prekursorowych pochodzących z hiPSC. Technologia hiPSC zrewolucjonizowała badania nad patogenezą chorób neurorozwojowych, zapewniając nam bezprecedensowy dostęp do żywych ludzkich komórek neuronalnych od osób dotkniętych chorobą. Rzeczywiście, przeprowadzono liczne badania hiPSC zaburzeń neurorozwojowych, w tym zespołu Retta, zespołu Timothy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Radę Gubernatora New Jersey ds. Badań Medycznych i Leczenia Autyzmu (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie Marks Family Foundation, Mindworks Charitable Lead Trust oraz Jewish Community Foundation of Greater MetroWest NJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Medium do indukcji neuronalnej PSC:
Link do protokołu: https://goo.gl/euub7a 		ThermoFischer ScientificA1647801Jest to zestaw, który składa się z pożywki Neurobaseal (NB) i 50-krotnego suplementu indukcji neuronalnej (NIS). NIS służy do wytwarzania 1X Neural Induction Medium i 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 MediumThermoFischer Scientific12634-010Składnik 100% Expansion
Medium NeurobasalThermoFischer Scientific21103049Składnik zarówno NIM, jak i 100% Expansion Medium 
Matrigel Corning354277kwalifikacją hESC żel naśladujący macierz zewnątrzkomórkową z kwalifikacją hESC (żel naśladujący ECM) 
Y-27632 (2HCl), 1 mgStem Cell Technologies72302ROCK inhibitor
6-dołkowe płytkiCorningCOR-3506Polistyrenowe płytki używane do konserwacji NPC i do testu migracji neurosfery 
Płytki 24-dołkoweThermoFischer Scientific2021-05Płytki polistyrenowe: Używane do testu syntezy DNA NPC
Szalki 35 mmThermoFischer Scientific2021-01Płytki polistyrenowe: Używane do wprowadzania fazy S NPC i oznaczania neurytów
Naturalna mysz LamininInvitrogen23017-015Podłoże do powlekania płytek: Służy do syntezy DNA NPC, wprowadzania fazy S i oznaczania
liczby komórekFibronectinSigmaF1141Podłoże do powlekania płytek: Służy do oznaczania neurytów 
Poly-D-LysineSigmaP0899Podłoże do powlekania płytek
Penicylina/StreptomycynaThermoFischer Scientific15140122Antybiotyk, składnik NIM, 100% Expansion i 30% Expansion Media 
StemPro AccutaseGibcoA11105-011X Roztwór do odłączania komórek 
2,5% Trypsyna (10X)Gibco15090-04610X roztwór enzymatyczny
0,5 MEDTA ThermoFischerScientific AM9261stosowany w roztworze trypsyny do podnoszenia komórek do oznaczania syntezy DNA
tritiowany [3H]-tymidynaPerkinElmerNET027E001Radioaktywny tryt, tymidyna
Fisherbrand 7 ml HDPE Fiolki scyntylacyjneFisherbrand03-337-1Fiolki do zliczania płynów scyntylacyjnych
EcoLite(+)MP Biomedicals0188247501 Płynny koktajl scyntylacyjny
LS 6500 wielofunkcyjny licznik scyntylacyjny cieczyBeckman Coulter8043-30-1194Licznik scyntylacji cieczy
Skatron Półautomatyczny kombajn komórkowy Typ 11019Urządzenia molekularne i Skatron Instruments, Inc.Półautomatyczny kombajn komórkowy
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Zestaw do obrazowaniaThermoFisher ScientificC10337EdU i zestaw do barwienia do testu wejścia fazy S
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%ThermoFisher Scientific15250061Ocena żywotności komórek
Bibuła filtracyjna klasy GF/CGE Healthcare Life Sciences, Whatman1822-849Bibuła filtracyjna z włókna szklanego
Ludzki podstawowy czynnik wzrostu FGF-2Peprotech100-18B
Przysadkowy polipeptyd aktywujący cyklazę adenylanową (PACAP-38)neuropeptydBACHEMH-8430
z

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  2. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  3. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  4. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  5. Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449 (2017).
  6. Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
  7. Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1355-1363 (2011).
  8. Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320 (5875), 539-543 (2008).
  9. Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66 (9), 947-956 (2009).
  10. Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94 (5), 677-694 (2014).
  11. Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155 (5), 1008-1021 (2013).
  12. Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171 (7), 758-767 (2014).
  13. Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474 (7351), 380-384 (2011).
  14. Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155 (5), 997-1007 (2013).
  15. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  16. Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33 (9), 3865-3878 (2013).
  17. Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139 (3), 475-487 (2012).
  18. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21 (8), 1840-1856 (2011).
  19. Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29 (3), 775-788 (2009).
  20. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72 (6), 821-842 (2012).
  21. Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26 (2-4), 197-207 (2004).
  22. Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3357-3362 (1997).
  23. Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66 (6), 1054-1063 (2001).
  24. Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90 (4), 743-750 (2012).
  25. Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5 (1), 9(2014).
  26. Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33 (3), 289-296 (1997).
  27. Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39 (3), 511-520 (2009).
  28. Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10 (3), 381-391 (2000).
  29. Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47 (6), 421-430 (2013).
  30. Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 123-124 (2001).
  31. Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2637-2642 (2005).
  32. Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539 (7628), 242-247 (2016).
  33. Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23 (15), 1777-1787 (2014).
  34. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  35. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20 (3), 361-368 (2015).
  36. Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. , (2016).
  37. Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45 (1), 69-75 (2012).
  38. Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15 (7), 507-516 (2014).
  39. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
  40. Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
  41. Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1 (1), 10(2011).
  42. Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5 (5), 749-762 (2010).
  43. ThermoFisher. GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017).
  44. ThermoFisher. Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neural Precursor CellsProliferation AssayMigration AssayNeurosphere FormationEdU LabelingPhase Contrast ImagingImmunocytochemical StainingCell DetachmentTrypan Blue CountingECM Mimic Gel

Powiązane artykuły