Artykuł metodologiczny

In vitro Test SUMOylacji do badania aktywności ligazy SUMO E3

DOI:

10.3791/56629

⸱

29 stycznia 2018

 ,  ,  , 
1Institute of Microbiology and Immunology, National Yang-Ming University, 2UC Davis Cancer Center, University of California, Davis, 3Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of California, Davis, 4Institute for Translational Medicine, College of Medical Science and Technology, Taipei Medical University, 5Division of Molecular and Genomic Medicine, National Health Research Institutes, 6Center for Infectious Disease and Cancer Research, Kaohsiung Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W przeciwieństwie do ligaz ubikwityny, zidentyfikowano kilka ligaz E3 SUMO. Ten zmodyfikowany protokół SUMOylacji in vitro jest w stanie zidentyfikować nowe ligazy SUMO E3 za pomocą testu rekonstytucji in vitro.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacja modyfikatora podobnego do ubikwityny (SUMO) jest ważną modyfikacją potranslacyjną (PTM), która pośredniczy w transdukcji sygnału głównie poprzez modulowanie oddziaływań białko-białko. Podobnie jak modyfikacja ubikwityny, SUMOylacja jest kierowana przez sekwencyjną kaskadę enzymów, w tym enzym aktywujący E1 (SAE1 / SAE2), enzym koniugacyjny E2 (Ubc9) i ligazę E3 (tj. Rodzina PIAS, RanBP2 i Pc2). Jednak w odróżnieniu od ubikwitynacji, ligaza E3 nie jest niezbędna do reakcji, ale zapewnia precyzję i skuteczność koniugacji SUMO. Białka zmodyfikowane przez SUMOylację można zidentyfikować za pomocą testu in vivo poprzez immunoprecypitację z przeciwciałami specyficznymi dla substratu i immunoblotting z przeciwciałami specyficznymi dla SUMO. Jednak wykazanie aktywności ligazy białkowej SUMO E3 wymaga odtworzenia in vitro testów SUMOylacji przy użyciu oczyszczonych enzymów, substratów i białek SUMO. Ponieważ w reakcjach in vitro, zwykle same SAE1/SAE2 i Ubc9, są wystarczające do koniugacji SUMO, wzmocnienie SUMOylacji przez przypuszczalną ligazę E3 nie zawsze jest łatwe do wykrycia. W tym miejscu opisujemy zmodyfikowany protokół SUMOylacji in vitro, który konsekwentnie identyfikuje modyfikację SUMO przy użyciu systemu odtworzonego in vitro. Przedstawiono również krok po kroku protokół oczyszczania katalitycznie aktywnej K-bZIP, wirusowej ligazy SUMO-2/3 E3. Aktywność SUMOylacji oczyszczonego K-bZIP jest pokazana na p53, dobrze znanym celu SUMO. Protokół ten może być stosowany nie tylko do wyjaśnienia nowych ligaz SUMO E3, ale także do ujawnienia ich specyficzności paralogicznej SUMO.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacja SUMO została początkowo zidentyfikowana jako odwracalna modyfikacja potranslacyjna (PTM), która reguluje stabilność białka1. Oprócz bezpośredniej koniugacji, SUMO może być również przyłączone do białka poprzez oddziaływanie niekowalencyjne przez motywy interakcji SUMO (SIM)2. Podobnie jak w przypadku wiązania fosforylacji tyrozylu przez cząsteczki zawierające domeny homologii Src 2 (SH2) lub domeny wiążące fosfotyrozynę (PTB)3,4, modyfikacja SUMO zapewnia dodatkową platformę interakcji do selektywnej rekrutacji białek efektorowych zawierających SIM5,6. Oprócz regulacji transdukcji sygnału, SUMOylacja czynników transkrypcyjnych i cząsteczki remodelujące chromatynę służą do modulowania ekspresji genów7,8. Badania wzorców SUMOylacji w całym genomie wykazały, że modyfikacja SUMO jest związana z regulacją transkrypcji positive9,10 lub negative10,11,12 regulacja transkrypcji, częściowo ze względu na specyficzność paralogu SUMOylacji.

W komórkach ssaków obecne są trzy główne izoformy SUMO do koniugacji białek; są to SUMO-1 oraz wysoce homologiczne SUMO-2 i SUMO-3 (określane jako SUMO-2/3)13. SUMO jest zwykle sprzężone z resztą lizyny (K) w motywie konsensusu ψKxD/E w białku docelowym. Karta SIM w ligazach SUMO E3 jest odpowiedzialna za specyficzność paralogu14. W przeciwieństwie do szlaków ubikwitynacji zawierających setki ligaz E3, zidentyfikowano tylko kilka ligaz SUMO E315. Ligazy SUMO E3 są definiowane przez właściwości, w tym ich zdolność do (i) wiązania Ubc9, (ii) wiązania ugrupowania SUMO za pośrednictwem domeny SIM oraz (iii) zwiększania transferu SUMO z Ubc9 na substrat. Ligaza E3 nie jest absolutnie wymagana do koniugacji SUMO16, ale zapewnia specyficzność substratu i paralogu SUMO. Ponieważ zwykle tylko niewielka część całkowitego białka substratowego jest modyfikowana przez SUMO, wykrywanie białek SUMOylowanych in vivo jest zawsze wyzwaniem. Dlatego potrzebne są dokładne i powtarzalne testy, aby wyjaśnić dokładną funkcję modyfikacji SUMO.

Test in vitro SUMOylacji, który ocenia zdolność oczyszczonego Ubc9 do katalizowania SUMOylacji białek substratowych, jest dobrze akceptowanym testem do badania modyfikacji SUMO17. Jednak aktywność ligazy SUMO E3 w większości przypadków nie może być wykryta lub może być wykryta tylko za pomocą zmutowanej ligazy SUMO o wysokiej aktywności ligazy SUMO E3 i niskiej specyficzności substratowej według standardowego protokołu ze względu na obecność dużej ilości Ubc918. Ogólny sukces tego testu zależy w dużej mierze od starannego miareczkowania oczyszczonego Ubc9. Opisany tutaj test SUMOylacji in vitro jest zmodyfikowany w stosunku do standardowego protokołu SUMOylacji (patrz Tabela materiałów). Obserwacja zwiększonej globalnej modyfikacji SUMO podczas reaktywacji herpeswirusa związanego z mięsakiem Kaposiego (KSHV) skłoniła nas do zidentyfikowania wirusowej ligazy SUMO E3, która może być odpowiedzialna za regulację w górę SUMOylacji. Po przeprowadzeniu na małą skalę badań przesiewowych białek oddziałujących z ligazą wirusa SUMO E3 K-bZIP, p53 zidentyfikowano jako nowy substrat. W tym protokole szczegółowo pokazujemy w komórkach owadów etapy związane z ekspresją i oczyszczaniem K-bZIP typu dzikiego, wirusowej ligazy SUMO E3 o swoistości SUMO-2/3. Zdolność oczyszczonego K-bZIP do zwiększania SUMOylacji p53, dobrze znanego substratu SUMO, jest oceniana w obecności zmniejszonych ilości enzymów E1 i E2. Korzystając z tego zmodyfikowanego testu SUMOylacji, naukowcy mogą wiarygodnie określić zdolności ligazy SUMO E3 do SUMOylacji nowych lub znanych substratów, co jest podstawowym krokiem w badaniu SUMOylacji białek. Co więcej, metoda ta pomaga zidentyfikować nowe ligazy SUMO E3 o niskiej aktywności ligazy, ale wysokiej specyficzności substratowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie konstrukcji ekspresji bakulowirusa

  1. Oczyść ligazę SUMO E3 K-bZIP, klonując cDNA K-bZIP19 do wektora bakulowirusa o podwójnej ekspresji (patrz tabela materiałów) z N-końcowym znacznikiem epitopu. Odnieśliśmy sukces przy użyciu znacznika oktapeptydu (oznaczonego w całym protokole jako vector-tag-K-bZIP).
    UWAGA: Matryca DNA do klonowania reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) K-bZIP to odwrotna transkrypcja cDNA z RNA wyizolowanego z komórek TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 po leczeniu doksycykliną20.
    1. Przenieś pełnowymiarowy CDNA19 do wektora podwójnej ekspresji z miejscami klonowania CpoI. CpoTrawię produkt PCR i 1 μg wektora podwójnej ekspresji w temperaturze 37 °C przez 3 h21.
    2. Oddziel i wyekstrahuj strawione DNA po elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym22. Związać wkładkę (K-bZIP) i wektor za pomocą ligazy DNA T4 w temperaturze 16 °C przez 30 minut zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
    3. Dodać 5 μl DNA do 50 μl kompetentnych komórek E. coli "A" (patrz tabela materiałów) w probówce o pojemności 1,5 ml. Kładziemy na lodzie na 30 min. Następnie inkubować probówkę o pojemności 1,5 ml w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 45 s i natychmiast umieścić probówkę na lodzie na 3 minuty.
    4. Dodać 600 μL S.O.C. (0,5% (w/v) ekstraktu drożdżowego, 2% (w/v) tryptonu, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mMMgSO4 i 4% (w/v) glukozy) do probówki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Następnie odwirować probówkę w temperaturze pokojowej przez 3 minuty przy 600 x g.
    5. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad z 60 μl pożywki Luria-Bertani (LB; 1% (w/v) tryptonu, 0,5% (w/v) ekstraktu drożdżowego i 85 mM NaCl) i rozprowadzić na płytkach agarowych LB zawierających 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować płytkę agarową w temperaturze 37 °C przez 16 h23,24.
    6. Wybierz 1 kolonię do zaszczepienia w pożywce 5 ml LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i hoduj w temperaturze 37 °C przez 16 godzin z wytrząsaniem 250 obr./min. Następnie wyekstrahuj plazmid, vector-tag-K-bZIP, za pomocą zestawu do ekstrakcji plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
  2. Wygeneruj rekombinowany bakmid zawierający znacznik-K-bZIP poprzez przekształcenie wektora-znacznika-K-bZIP w kompetentne komórki E. coli "B" (patrz Tabela materiałów).
    1. Wymieszaj 0,2 μg plazmidu vector-tag-K-bZIP i 100 μl właściwego E. komórki coli "B" w probówce o pojemności 1,5 ml i umieścić na lodzie na 30 minut. Inkubować probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 45 s i natychmiast umieścić probówkę na lodzie na 3 minuty.
    2. Dodać 900 μl pożywki S.O.C. do probówki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny, obracając się z prędkością 50 obr./min. Następnie weź 10 μl pożywki, dodaj dodatkowe 50 μl pożywki S.O.C. do rozprowadzenia na płytkach agarowych LB zawierających 50 μg/ml kanamycyny, 7 μg/ml gentamycyny, 10 μg/ml tetracykliny, 100 μg/ml substratu galaktozydazy i 40 μg/ml izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG), i inkubować płytki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.
    3. Zaszczepić jedną białą kolonię w pożywce o pojemności 5 ml LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny, 7 μg/ml gentamycyny i 10 μg/ml tetracykliny. Inkubować w temperaturze 37 °C z prędkością 250 obr./min, wytrząsając przez 16 godzin.
    4. Wyizoluj rekombinowany bakmidowy DNA zawierający znacznik K-bZIP, określ ilościowo i ponownie zawiesij w stężeniu 1 μg/μL25.
  3. Generowanie rekombinowanych bakulowirusów wykazujących ekspresję tag-K-bZIP poprzez transfekcję 1 μg rekombinowanego bakmidowego DNA zawierającego tag-K-bZIP do komórek Sf9 w jednym dołku płytki 6-dołkowej.
    1. Wysiewaj 2 x 106 komórek Sf9 (patrz Tabela materiałów) w 2 ml pożywki Grace's Insect Medium zaopatrzonej w 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% gentamycyny w każdym dołku na 6-dołkowej płytce, a następnie inkubuj w temperaturze 27 °C przez 1 godzinę.
    2. Utrzymuj hodowlę komórek Sf9 w fazie logarytmicznej komórek Sf9 w pożywce dla owadów Grace zaopatrzonej w 10% FBS, 1% gentamycyny i 1% detergentu C (patrz Tabela Materiałów) w temperaturze 27 °C w zawiesinie orbitalnej przy 140 obr./min. Policz komórki za pomocą hemocytometru i barwienia błękitem trypana; Żywotność komórek powinna przekraczać 95%. Utrzymuj komórki, stosując stosunek subhodowli 1:3 co 2-3 dni (minimalna gęstość ~0,5 x 106 komórek/ml).
    3. Dodać 2 μl bakmidowego DNA (1 μg/μl) i 98 μl zredukowanej pożywki surowicy (patrz tabela materiałów) do probówki o pojemności 2 ml. Następnie dodać 4 μl odczynnika do transfekcji (patrz Tabela Materiałów) do probówki i dobrze wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    4. Dodać tę mieszaninę transfekcji (104 μl) do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 27 °C przez 12-16 godzin.
    5. Usuń wyczerpaną pożywkę za pomocą delikatnego zasysania i zastąp ją 2 ml świeżej pożywki dla owadów Grace's Insect Medium zawierającej 10% FBS i 1% gentamycyny. Komórki Sf9 luźno przylegają do powierzchni płytki i nie zostaną naruszone przy delikatnym zasysaniu.
  4. Zebrać rekombinowanego bakulowirusa po transfekcji i amplifikować bakulowirusa w celu uzyskania zapasów o wysokim mianie (P1) do dalszych eksperymentów.
    1. Po 72 godzinach od zmiany pożywki zeskrobać komórki Sf9 za pomocą sterylnego podnośnika komórek, zebrać supernatant z każdej studzienki do probówki o pojemności 1,5 ml i wirować przez 10 s.
    2. Wirować w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 150 x g. Zebrać supernatant jako bakulowirus P0 i podwielokrotność w probówkach o pojemności 1,5 ml (1 ml bakulowirusa w każdej probówce). Przechowywać w temperaturze -80 °C.
    3. Wysiew 1 x 107 komórek Sf9 w 10 ml pożywki dla owadów Grace's Insect Medium dostarczanej z 10% FBS i 1% gentamycyny na 10 cm szalce Petriego i inkubuj w temperaturze 27 °C przez 1 godzinę.
    4. W celu amplifikacji rekombinowanych bakulowirusów wykazujących ekspresję tag-K-bZIP dodać 0,5 ml bakulowirusa P0 do wysianych komórek Sf9 i inkubować w temperaturze 27 °C przez 48 godzin.
    5. Zebrać supernatant jako bakulowirus P1 w probówce o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.

2. Oczyszczanie K-bZIP

  1. Utrzymuj hodowlę komórek Sf9 w fazie logarytmicznej komórek Sf9 w pożywce dla owadów Grace's Insect Medium dostarczanej z 10% FBS, 1% gentamycyny i 1% detergentu C w temperaturze 27 °C w zawiesinie orbitalnej przy 140 obr./min, jak opisano w kroku 1.3.2.
  2. W dniu transdukcji dodać 1 ml supernatantu (P1) zawierającego bakulowirusa do 250 ml komórek Sf9 o gęstości 2 x 106 komórek/ml.
  3. Inkubować komórki Sf9 przez 72 godziny w temperaturze 27 °C na wytrząsarce orbitalnej z wytrząsaniem 140 obr./min, a następnie zbierać przez odwirowanie w temperaturze 2,740 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Usunąć supernatant i granulki komórek lizy w 10 ml buforze do lizy (20 mM HEPES pH 7,9, 0,5 M NaCl, 1% detergentu A (patrz tabela materiałów), 2% glicerolu, koktajlu inhibitorów proteazy) i obracać z prędkością 50 obr./min za pomocą mieszadła zawiesinowego w temperaturze 4 °C przez 30 min.
  5. Odwirować lizat komórkowy przy 15 000 x g przez 15 minut w celu zebrania supernatantu.
  6. Aby oczyścić znacznik K-bZIP, należy inkubować lizaty komórkowe (10 ml) z 50 μl kulek magnetycznych znakowanych przeciwciałami w probówkach polipropylenowych o pojemności 14 ml i obracać z prędkością 50 obr./min przez 3 godziny w temperaturze 4 °C za pomocą mieszadła zawiesinowego. Po wychwyceniu białka granulki należy osadzać w wirowaniu 800 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C. Usunąć większość supernatantu, ponownie zawiesić kulki w pozostałej objętości około 1 ml i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml w celu przemycia.
  7. Przemyj wychwycone białko, umieszczając probówkę zawierającą kulki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant, gdy kulki magnetyczne całkowicie przylgną do boku probówki.
  8. Umyj kulki buforem do lizy cztery razy.
    1. Dodaj 1 ml buforu do lizy do probówek o pojemności 1,5 ml i odwróć probówki 10 razy. Umieścić probówkę o pojemności 1,5 ml na stojaku magnetycznym i usunąć supernatant zgodnie z opisem w ppkt 2.7.
    2. Powtórz poprzedni krok jeszcze 3 razy.
  9. Umyj kulki jednorazowo solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
    1. Dodaj 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4) do probówek 1,5 ml i odwróć probówki 10 razy.
    2. Umieść probówkę o pojemności 1,5 ml na stojaku magnetycznym, a następnie usuń supernatant.
  10. Elute białko tag-K-bZIP z kulek magnetycznych znakowanych przeciwciałami przez dodanie 100 μl oktapeptydu 150 μg/ml rozcieńczonego w PBS do probówki o pojemności 1,5 ml. Obracać rurkę przez 10 minut przy 50 obr./min za pomocą mieszadła zawiesinowego w temperaturze pokojowej. Następnie umieść probówkę z powrotem na stojaku magnetycznym i zbierz supernatant zawierający K-bZIP w czystej probówce o pojemności 1,5 ml.
  11. Przeanalizuj 1-5 μl oczyszczonego białka tag-K-bZIP za pomocą SDS-PAGE, a następnie Coomassie blue staining26. Załadować 2 μg, 1 μg i 0,5 μg próbek albuminy surowicy bydlęcej (BSA) na ten sam żel i użyć go do oznaczania ilościowego za pomocą programu do przetwarzania obrazu, takiego jak ImageJ. Oszacuj stężenie K-bZIP przez porównanie z normami BSA.
  12. Oczyszczony K-bZIP jest teraz gotowy do użycia w każdym teście SUMOylacji. Rozcieńczyć K-bZIP w PBS do końcowego stężenia 100 ng/μl i przechowywać w małych porcjach w temperaturze -80 °C.

3. Test sumoylacyjny

  1. Dodać 3 μl 100 ng/μl oczyszczonego tag-K-bZIP do mieszaniny głównej każdej reakcji sumoylacji in vitro. Składniki mieszanki głównej zawierają 1 μl buforu białkowego, 1x bufor SUMOylacyjny, 0,5 μl białka p53 (0,5 mg/mL), 25 nM enzymu aktywującego E1 (stężenie wyjściowe: 1 μM), 50 nM enzymu sprzężającego E2 (stężenie podstawowe: 10 μM) i 250 nM każdy z peptydów SUMO (SUMO-1, SUMO-2 lub SUMO-3; zawartość magazynowa: 5 μM) do końcowej objętości 17 μl.
  2. Delikatnie wymieszać zawartość i inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 3 godziny. Zatrzymać reakcję przez dodanie 20 μL 2x buforu ładującego SDS-PAGE (100 mM Tris-HCL pH 6,8, 4% dodecylosiarczan sodu, 0,2% (w/v) błękit bromofenolowy, 20% (v/v) glicerol i 200 mM β-merkaptoetanolu) i denaturować próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
  3. Oddziel próbki na SDS-PAGE, przenieś oddzielone białka na błonę PVDF za pomocą półsuchego aparatu do transferu elektroforetycznego i przeanalizuj za pomocą Western blot przy użyciu przeciwciała anty-p53.
    1. Ustawić aparat żelowy jak w kroku 2.11 i załadować 20 μl próbki do studzienek żelowych.
    2. Uruchom 10% żel w stałym prądzie o napięciu 80 V przez około 120 minut (do momentu, gdy pasmo barwnika dotrze do dna żelu). Po zakończeniu elektroforezy wyłącz zasilanie.
    3. Odłączyć aparat żelowy i kasety z żelem, aby wyjąć żel, a następnie umieścić żel w półsuchym buforze transferowym (48 mM Tris-HCl, 39 mM glicyna, 20% metanolu) na 5 minut.
    4. Weź inny pojemnik i namocz membranę PVDF w metanolu na 1 minutę. Następnie wyjmij PVDF z metanolu i umieść w półsuchym buforze transferowym. Delikatnie mieszaj membranę przez 5 minut.
    5. Zdjąć pokrywę zabezpieczającą półsuchego aparatu elektroforetycznego.
    6. Wstępnie zwilż bibułę filtracyjną i przygotuj warstwę żelu na dolnej anodzie platynowej w następujący sposób: bibuła filtracyjna, membrana PVDF, żel i bibuła filtracyjna.
    7. Zabezpiecz płytkę katodową i osłonę bezpieczeństwa, a następnie uruchom blot przy stałym prądzie 15 V przez 90 minut. Wyłącz zasilanie, odłącz urządzenie półsuche i wyjmij membranę PVDF.
    8. Blokuj membranę PVDF z buforem blokującym (5% beztłuszczowego mleka w buforze TBST (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, 0,1% detergentu B (patrz tabela materiałów), pH 7,6)) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z 30 obr./min, wytrząsając wytrząsarką orbitalną.
    9. Hybrydyzować membranę PVDF z przeciwciałem anty-p53 rozcieńczonym (1:1 000) w buforze blokującym przez 12-16 godzin w temperaturze 4 °C z wytrząsaniem 30 obr./min przy użyciu mieszalnika zawiesinowego.
    10. Wyjmij membranę PVDF do pojemnika i włóż do TBST. Przepłukać membranę PVDF za pomocą TBST jeszcze dwukrotnie.
    11. Namocz membranę PVDF w TBST na 30 minut, wstrząsając 45 obr./min wytrząsaniem za pomocą wytrząsarki orbitalnej.
    12. Hybrydyzować błonę PVDF z przeciwciałem anty-króliczym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) rozcieńczoną (1:4 000) w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem 30 obr./min przy użyciu mieszalnika zawiesinowego.
    13. Umyć membranę PVDF TBST 3 razy, jak opisano w kroku 3.4.10.
    14. Namocz membranę PVDF w TBST na 30 minut, wstrząsając 45 obr./min za pomocą mieszadła do zawiesiny. Usunąć TBST i dodać PBS, aby zachować membranę PVDF w temperaturze 4 °C przez okres do 12 godzin.
    15. Zmieszać odczynnik 1 i 2 (1:1) wzmocnionego substratu chemiluminescencyjnego (substratu ECL) (patrz tabela materiałów). Usuń membranę PVDF z PBS, krótko osusz ręcznikiem papierowym lub lekką wycieraczką, aby wchłonąć nadmiar wilgoci, a następnie natychmiast dodaj 400 μl odczynnika ECL na powierzchnię każdej membrany na 3-5 minut. Usunąć nadmiar odczynnika ECL przez krótkie osuszenie, ale nie dopuścić do całkowitego wyschnięcia membrany.
    16. Naświetl plamę za pomocą systemu obrazowania luminescencyjnego lub filmu autoradiograficznego27.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z informacjami dostarczonymi przez producenta, standardowa ilość enzymu E1 i E2 w teście SUMOylacji wynosi odpowiednio 50 nM i 500 nM. Minimalna ilość enzymu sprzężającego E2 Ubc9, który jest zdolny do SUMOylacji p53, została najpierw określona za pomocą testu SUMOylacji in vitro. Zaledwie jedna piąta ilości Ubc9 użytej w standardowym protokole testu SUMOylacji in vitro była w stanie skutecznie SUMOylate p53 (Rysunek 1A). W zw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół SUMOylacji in vitro jest rutynowo stosowany do ustalenia statusu SUMOylacji zidentyfikowanych substratów Ubc9. Głównym ograniczeniem przy użyciu standardowego protokołu do badania funkcji SUMOylacji ligazy SUMO E3 jest obfitość enzymów aktywujących SUMO E1 i sprzężonych z E2 Ubc9, które maksymalizują koniugację SUMO w systemach in vitro . Biorąc pod uwagę to wyzwanie, uważamy, że miareczkowanie ilości enzymów SUMO E1 i E2 do poziomu, na którym ledwo można wykryć ich aktywność w SU...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie ujawniają potencjalnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST, 105-2320-B-010-007-MY3 dla PCC), z National Health Research Institute (NHRI-EX105-10215BC dla PCC), z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST 105-2314-B-400-019 dla HJK) oraz z National Health Research Institute (NHRI MG-105-SP-10, NHRI MG-106-SP-10 dla HJK). Prace te były również częściowo wspierane przez Narodowy Uniwersytet Yang-Ming w zakresie publikacji manuskryptów na PCC. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub naprawie manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pFastBacInvitrogen10359-016wektor bakulowirusa o podwójnej ekspresji
wektor pCR2.1-TOPO wektorInvitrogenPCR
kompetentna komórka  E. coli DH5αYeastern BiotechFYE678-80VLkompetentny E. komórki A
E. coli DH10BacInvitrogen10359-016kompetentny E. komórki B
FugeneHDRoche04709705001odczynnik do transfekcji
Opti-MEMGibco31985062zredukowana pożywka surowicy
Ligaza T4NOWA Anglia BioLabsM0202S
CpoI (RsrII)Thermo ScientificER0741
Bluo-galThermo ScientificB1690substrat galaktozydazy
IPTGSigma-AldrichI6758-1G
Grace' s Pożywka dla owadówGibco11605094
Płodowa surowica bydlęcaGibco10082147
GentamycynaThermo Fisher15750060
AmpicylinaSigma-AldrichA9393-25G
KanamycynaSigma-AldrichK0254-20ML
gentamycynaGibco15710-064
tetracyklinaSigma-Aldrich87128-25G
LB BulionMerk1.10285.0500
HEPESSigma-AldrichH4034-100G
NaClSigma-AldrichS9888-5KG
KClMerk1.04936.1000
Na2HPO4Sigma-AldrichS5136-500G
KH2PO4J.T.Baker3246-01
dodecylosiarczan soduMerk1.13760.1000
β-merkaptoetanolBio-Rad161-0710
TRIS (Base)J.T.Baker4109-06
Mleko beztłuszczoweFonterra
glicerolJ.T.Baker2136-01
Triton X-100Amresco0694-1Ldetergent A
Tween 20Amresco0777-500MLdetergent B
Poloxamer 188 roztwórSigma-AldrichP5556-100MLdetergent C
Inhibitor proteazy Tabletka koktajlowaRoche04 693 132 001
3x Peptyd flagowySigmaF4799
anty-FLAG m2 Koraliki magnetyczneSigma-AldrichM8823koraliki magnetyczne znakowane przeciwciałami
SUMOlink SUMO-1 KitActive Motif40120standardowy protokół SUMOylacji 
SUMOlink SUMO-2/3 KitActive Motif40220standardowy protokół SUMOylacji 
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquickQIAGEN28704
QIAGEN Plasmid Mini KitZestaw do ekstrakcji plazmiduQIAGEN12123
Rurki polipropylenoweFalcon352059
Petri Dish351029
Podnośnik komórekCorningCNG3008
Końcówka ładującaSorenson BioScience28480
PVDFPerkinElmerNEF1002
Bibuła filtracyjnaBio-Rad1703932
Mini aparat do żelu do bloczków (Bio-Rad Mini Protean II Cell)Bio-Rad1658001 EDU
Trans-Blot SD Półsucha elektroforetyczna komórka transferowaBio-Rad1703940
Pierce ECL Western BlottingThermo32106ECL mieszalnik zawiesiny odczynnika
Przyrządy laboratoryjne Digisystem  Inc.SM-3000
Kansin instruments Co.OS701
ImageQuant LAS 4000
obrazowanie biomolekularne		GE Healthcare28955810
Sf9Thermo ScientificB82501
anty-p53Sygnalizacja komórkowa#9282
przeciwciało anty-króliczeGE HealthcareNA934-1ML
produktu Falcon Wytrząsarka orbitalna przeciwciało

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).
  2. Lin, D. Y., et al. Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors. Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).
  3. Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells. J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).
  4. Huang, W. Q., et al. Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis. Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).
  5. Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin. Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).
  6. Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).
  7. Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex. Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).
  8. Lyst, M. J., Stancheva, I. A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation. Biochem Soc Trans. 35, Pt 6 1389-1392 (2007).
  9. Liu, H. W., et al. Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes. Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).
  10. Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast. Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).
  11. Chang, P. C., et al. The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi's sarcoma associated herpesvirus reactivation. BMC Genomics. 14, 824(2013).
  12. Neyret-Kahn, H., et al. Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation. Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).
  13. Tatham, M. H., et al. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).
  14. Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson. World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).
  15. Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
  16. Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
  17. Knipscheer, P., et al. Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination. Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).
  18. Vethantham, V., Manley, J. L. In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121(2009).
  19. Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus. J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).
  20. Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation. PLoS Pathog. 11 (7), 1005051(2015).
  21. Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. RsrII--a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site. Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).
  22. Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).
  23. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
  24. Gingold, E. B. Bacterial transformation. Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).
  25. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  26. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  27. Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rekonstytucja in vitrooczyszczanie K bZIPsumoilacja p53enzym Ubc9analiza SDS PAGEWestern blottingkulki magnetyczneekspresja bakulowirusowa

Powiązane artykuły