Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znacznika dimetylacji histonu 3 lizyny 79

7.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56631

⸱

26 stycznia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy skuteczną i powtarzalną metodę izolacji i hodowli nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnej i postnatalnej tkanki mózgowej do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) histonu 3 lizyny 79 dimetylacji (H3K79me2) - znacznika histonowego znajdującego się w domenie globularnej histonu 3.

Streszczenie

Rozwój mózgu to złożony proces, który jest kontrolowany w sposób czasowo-przestrzenny przez gradienty morfogenów i różne programy transkrypcyjne. Ponadto modyfikacje chromatyny epigenetycznej, takie jak metylacja histonów, odgrywają ważną rolę w ustalaniu i utrzymywaniu określonych losów komórek w tym procesie. Zdecydowana większość metylacji histonów zachodzi na elastycznym ogonie histonowym, który jest dostępny dla modyfikatorów histonów, gumek i białek czytnika histonów. Natomiast metylacja H3K79 znajduje się w domenie kulistej histonu 3 i bierze udział w różnych funkcjach rozwojowych. Metylacja H3K79 jest ewolucyjnie konserwatywna i można ją znaleźć u wielu gatunków, od Homo sapiens po Saccharomyces cerevisiae. Modyfikacja zachodzi w różnych populacjach komórek w organizmach, w tym w progenitorach nerwowych. Lokalizacja metylacji H3K79 w domenie globularnej histonu 3 utrudnia jego ocenę. W tym artykule przedstawiono metody izolacji i hodowli komórek progenitorowych kory mózgowej (CPC) z embrionalnej tkanki mózgowej kory mózgowej (E11.5-E14.5) lub progenitorów neuronów ziarnistych móżdżku (CGNP) z tkanki postnatalnej (P5-P7) oraz skutecznego immunoprecypitacji H3K79me2 do ilościowego PCR (qPCR) i sekwencjonowania całego genomu.

Wprowadzenie

Funkcje sensoryczne, motoryczne i poznawcze mózgu są bardzo złożone i podatne na zmiany fizyczne i środowiskowe. Mózg składa się z trzech głównych części: tylnej, środkowej i przedniej części mózgu, które są głęboko połączone. W obrębie przodomózgowia kresomózgowie można podzielić na kresomózgowie grzbietowe (DT) i kresomózgowie brzuszne (VT). DT myszy składa się z sześciu warstw korowych, które są utworzone między E11.5 a E18.5 w sposób "na lewą stronę"1. VT obejmuje rozwijające się wypukłości zwojowe, które później tworzą zwoje podstawy2,3. W ośrodkowym układzie nerwowym ssaków można sklasyfikować kilka typów komórek, takich jak neurony, astrocyty lub oligodendrocyty4, które rozwijają się w sposób czasowo-przestrzenny5. Po pierwsze, neuronalne komórki progenitorowe (NPC) dają początek różnym rodzajom neuronów, interneuronów w VT i neuronów projekcyjnych w DT, a następnie komórkom glejowym (np. astrocyty6). Podczas rozwoju kory mózgowej najpierw tworzy się najbardziej powierzchowna warstwa (warstwa I), która zawiera komórki Cajal-Retzius. Następnie, między E12.5 a E14.5, NPC generują głębsze warstwy neuronów (VI, V), podczas gdy między 14,5 a 16,5 progenitorami powstają neurony górnej warstwy (IV-II) 7,8. Tożsamość neuronalna jest określana przez różne czasowo-przestrzenne programy transkrypcyjne indukowane morfogenem oraz dodatkowo przez programy epigenetyczne2.

Móżdżek, który jest zaangażowany w koordynację ruchową, znajduje się w tyłomózgowiu i rozwija się między E10 a mniej więcej P20 u myszy9. Zawiera korę móżdżku i jądra móżdżku10. Dorosła kora móżdżku składa się z trzech warstw, najbardziej zewnętrznej warstwy molekularnej, warstwy komórek Purkinjego i najbardziej wewnętrznej warstwy ziarnistej zawierającej ziarniste neurony10. Komórki ziarniste móżdżku są najmniejszymi neuronami i reprezentują około 80% wszystkich neuronów w mózgu kręgowców11. Rozwijają się z prekursorów znajdujących się w zewnętrznej strefie rozrodczej i migrują przez warstwę komórek Purkinjego do miejsca docelowego12. Podobnie jak w kresomózgowiu, rozwój móżdżku jest regulowany przez kilka ważnych morfogenów, które mają określone funkcje zależne od czasu i przestrzeni oraz inicjują określone programy transkrypcyjne10.

Rozwój warstw korowych i móżdżkowych jest kontrolowany przez transkrypcyjną ekspresję określonych morfogenów, a tym samym przez stan chromatyny DNA. W uproszczonym ujęciu stany chromatyny można podzielić na euchromatynę jako aktywną transkrypcyjnie i heterochromatynę jako obszary ciche transkrypcyjnie. Nukleosom jako podstawowa jednostka chromatyny zawiera dwie kopie każdego histonu rdzeniowego H2A, H2B, H3 i H4, otoczone 147 parami zasad klasy DNA13. Histony są silnie modyfikowane potranslacyjnie przez metylację, acetylację, fosforylację, ubikwitynację, sumoilację, ADP-rybozylację, deaminację i izomeryzację proliny14,15. Metylacja lizyny histonów jest uważana za najbardziej stabilną modyfikację histonów, która kontroluje transkrypcję, replikację, rekombinację16, odpowiedź na uszkodzenie DNA17 i imprinting genomowy18. Lizyny mogą być mono-, di- lub trimetylowane19 i pojawiają się nie tylko na dostępnych ogonach histonów, ale także w domenie globularnej histonów20. Specyficzne metylacje w H3K4 i H3K36 są głównie związane z euchromatyną, specyficzne metylacje w H3K9, H3K27 lub H4K20 występują głównie w regionach heterochromatycznych, chociaż wszystkie reszty znajdują się w ogonie histonowym14,19,21. Metylacja H3K79 znajduje się w domenie globularnej histonów i jest związana z aktywnością transkrypcyjną, ale także z obojętnymi transkrypcyjnie regionami genomu22. Modyfikacja jest ewolucyjnie zachowana, ponieważ zaobserwowano ją u drożdży, grasicy cielęcej, kurczaka i human23. H3K79 mono, di i trimetylacja (H3K79me1, me2, me3) są katalizowane przez metylotransferazy histonowe DOT1L24,25 i Nuclear SET Domain-Containing Protein 2 (Nsd2)26. DOT1L bierze udział w proliferacji, naprawie DNA i przeprogramowaniu komórek27. Utrata Dot1l u myszy prowadzi do śmierci prenatalnej w okolicach etapu rozwojowego E10.528,29. Podczas rozwoju serca i różnicowania miokardiocytów, DOT1L jest niezbędny do regulacji ekspresji genów30. W ośrodkowym układzie nerwowym funkcja DOT1L może być zaangażowana w rozwój cewy nerwowej31, bierze udział w tłumieniu ekspresji Tbr1 podczas rozwoju przodomózgowia32, i może działać w regulacji genów odpowiedzi na stres ER33. Zależne od kontekstu aktywujące lub tłumiące działanie H3K79me, szczególnie w sytuacjach in vivo, takich jak rozwój ośrodkowego układu nerwowego, jest do tej pory tylko częściowo zrozumiałe32. Ponieważ metylacja H3K79 znajduje się w domenie globularnej histonu 3, jest sterycznie mniej dostępna w porównaniu z modyfikacjami elastycznych ogonów histonów23. Aby zrozumieć funkcję metylacji H3K79, potrzebne są wiarygodne i powtarzalne metody analizy w celu określenia jego lokalizacji i środowiska genomowego. W niniejszej pracy przedstawiono metody izolacji różnych neuronalnych komórek progenitorowych (CPC dla kory mózgowej i CGNP dla móżdżku), skuteczne leczenie inhibitorem DOT1L oraz metodę ChIP do analizy metylacji H3K79 za pomocą qPCR lub sekwencjonowania w różnych punktach czasowych rozwoju kory mózgowej i móżdżku. Aby zapoznać się z przeglądem protokołu i jego możliwościami, zobacz Rysunek 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Komitety ds. dobrostanu zwierząt Uniwersytetu we Fryburgu Bryzgowijskim i lokalne władze zatwierdziły wszystkie eksperymenty na zwierzętach (G12/13, G16/11) wymienione w poniższym protokole.

1. Przygotowania

  1. Przygotowania do izolacji CPC
    1. Ustaw krycie w czasie, aby uzyskać zarodki na różnych etapach rozwoju kory mózgowej (między E11.5 a E14.5). Użyj myszy szczepu NMRI (Naval Medical Research Institute), które mają co najmniej 8 tygodni. Po kryciu rozważ dodatni czop dopochwowy na poziomie E0,5.
    2. Aby mieć wystarczającą ilość materiału, użyj jednego miotu myszy NMRI na jeden H3K79me2 ChIP z kory E12.5 lub E14.5. W późniejszych stadiach zarodkowych należy użyć jednego miotu do większej liczby analiz ChIP (średnia wielkość miotu NMRI: 10 zarodków).
    3. Wstępnie schłodzić zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) i sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do 4 °C (długotrwałe przechowywanie w temperaturze pokojowej).
    4. Zrównoważyć zmagazynowaną w 4 °C trypsynę-EDTA (0,05 % w/v) do 37 °C.
    5. Przygotuj pożywkę dla komórek korowych (CCM): Uzupełnij pożywkę dla neuronów (patrz tabela materiałów) końcowymi stężeniami 2% (v/v) suplementu B-27, 5 μg/ml apo-transferyny, 1 μg/ml glutationu, 0,5 mM L-glutaminy, 0,8 μg/ml dysmutazy ponadtlenkowej i 1% (v/v) mieszaniny antybiotyków penicylina-streptomycyna-neomycyna. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Na potrzeby eksperymentu należy zrównoważyć podłoże do 37 °C.
    6. Rozmrozić płodową surowicę cielęcą (FCS), podaszkować ją (po 50 ml każda) i zrównoważyć jedną porcję do 37 °C (długotrwałe przechowywanie w temperaturze -20 °C).
    7. Przygotować zapasy DNAzy 1 (10 mg/ml) wH2Odo hodowli komórkowej. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
    8. W razie potrzeby rozpuść specyficzne inhibitory DOT1L EPZ-5676 lub SGC0946 w DMSO do stężenia podstawowego 100 mM. Zastosuj końcowe stężenie 1-5 μM do komórek w dniu 0 i ponownie nakładaj inhibitor co dwa dni.
    9. W przypadku hodowli CPC należy pokryć płytki hodowli komórek (6 dołków lub 12 dołków) bromowodorkiem poli-L-ornityny (1 mg/ml w 150 mM kwasie borowym o pH 8,4) przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie z lamininą (1 mg/ml) w pożywce CCM w temperaturze 37 °C przez noc.
  2. Preparaty do izolacji CGNP
    1. Zorganizuj odpowiednie krycie myszy, aby wygenerować zwierzęta P5-P7 do izolacji móżdżku (3-5 zwierząt na ChIP i warunek).
    2. Przygotować HBSS/glukozę, dodając 6 mg/ml glukozy do buforu HBSS.
    3. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych CGNP (CGM), dodając do DMEM-F12 1 % (v/v) suplementu N2, 1 % (v/v) penicyliny-streptomycyny-neomycyny, 25 mM KCl i 10 % FCS. Do uprawy CGNP należy przygotować podłoże CGM bez FCS, ale zawierające 0,6 μg/ml sonic hedgehog (SHH) (CGM-SHH) i w razie potrzeby zrównoważyć je do 37 °C.
    4. Pokryj 6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych 100 μg/ml poli-D-lizyny przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej w celu usunięcia komórek glejowych. Następnie umyć dwukrotnie sterylnym ddH2O i pozostawić płytki do wyschnięcia. Płytki należy przechowywać maksymalnie przez tydzień w temperaturze 4 °C.
    5. W przypadku hodowli CGNP należy pokryć 6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych poli-L-ornityną (0,1 mg/ml) w temperaturze 4 °C przez noc. Następnie przemyć dwukrotnieH2Odla hodowli komórkowych i pozostawić płytki do wyschnięcia.
      UWAGA: Płytki można przechowywać maksymalnie przez tydzień w temperaturze 4 °C.
    6. Przygotować 0,025 % trypsyny (w/v) w HBSS/glukozie i w razie potrzeby zrównoważyć ją do 37 °C.
  3. Preparaty do ChIP H3K79me2
    1. Przygotować PFA (1 % w PBS, pH 8) świeżo przed sieciowaniem chromatyny. Aby przygotować PFA, podgrzej 50 ml PBS w kuchence mikrofalowej do maksymalnej temperatury 65 °C. Podczas ciągłego mieszania dodać 0,5 mg PFA do PBS. Następnie dodać 50 μl 10 M NaOH i poczekać, aż PFA się rozpuści. Następnie dodaj 42,5 μl HCl (37% v/v), aby uzyskać pH 8. Ponownie sprawdzić pH, a następnie pozwolić, aby 1 % roztwór PFA osiągnął RT.
    2. Przygotować zapasy RNazy (1 mg/ml) i proteinazy K (20 μg/μl) oddzielnie w sterylnym ddH2O. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
    3. Przygotować następujące i odczynniki: PBS zawierający 0,02% Tween, bufor do lizy, glicyna, bufor rozcieńczający, bufor ChIP 1, bufor ChIP 2, bufor ChIP 3 i bufor TE i przechowywać je w temperaturze 4 °C. Za każdym razem przygotowywać bufor elucyjny na świeżo.
      1. Przygotować PBS zawierający 0,02% Tween. Przechowywać maksymalnie przez tydzień w temperaturze 4 °C.
      2. Przygotuj bufor do lizy przy użyciu 50 mM Tris o pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% (w/v) dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 1x inhibitora proteazy.
      3. Przygotuj 2,5 M glicyny.
      4. Przygotować bufor rozcieńczający przy użyciu 20 mM Tris o pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, 0,25% (w/v) SDS i 1x inhibitora proteazy.
      5. Przygotuj bufor ChIP 1 przy użyciu 20 mM Tris o pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100 i 0,2% (w/v) SDS.
      6. Przygotuj bufor ChIP 2 przy użyciu 20 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100 i 0,2% (w/v) SDS.
      7. Przygotuj bufor ChIP 3 przy użyciu 20 mM Tris pH 8,0, 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) NP-40 i 1% (w/v) SDS.
      8. Przygotować bufor TE, używając 20 mM Tris pH 8,0 i 2 mM EDTA.
      9. Przygotować świeży bufor elucyjny zawierający 1% (w/v) SDS, 100 mM NaHCO3.

2. Izolacja neuronalnego progenitora tkanki mózgowej

  1. Izolacja i fakultatyczna uprawa CPC
    1. Poddaj ciężarne zwierzęta eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy i przenieś zarodki do lodowatego HBSS.
    2. Usuń czaszkę nożyczkami i odizoluj mózg, a następnie usuń opony mózgowe, jeśli to dotyczy, za pomocą małych kleszczy i wyizoluj korę (całą, DT lub VT) obu półkul, usuwając wszystkie inne części mózgu pod lunetą lornetkową za pomocą małych kleszczy i, jeśli to konieczne, małych nożyczek. Przechowywać wyizolowane kory w 5 ml buforze HBSS w temperaturze 4 °C w probówce o pojemności 15 ml.
    3. Odwirować wyizolowany materiał mózgu przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g i temperaturze 4 °C.
    4. Umyj korki 5 ml lodowatego HBSS i homogenizuj je za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml, pipetując w górę iw dół. W razie potrzeby odetnij końcówkę końcówki pipety.
    5. Odwirować homogenizowaną próbkę przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g i temperaturze 4 °C. Wyjąć HBSS.
    6. Dodać 3 ml trypsyny i inkubować próbkę przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    7. Dodać 1 ml FCS, 5 ml CCM i 30 μl DNazy 1 do próbki i homogenizować próbkę za pomocą szklanej pipety o pojemności 5 ml, ostrożnie pipetując w górę i w dół.
    8. Odwirować wyizolowane komórki przez 5 minut w temperaturze 1000 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, dodać 5 ml CCM i ponownie homogenizować próbkę.
    9. Rozcieńczyć podwielokrotność próbki i policzyć ją w komorze liczącej Neubauera. Oczekuje się, że na zarodek przypadnie średnio 4,5 x 106 komórek. W przypadku hodowli izolowanych CPC należy postępować zgodnie z etapem 2.1.10. W przypadku ChIP natychmiast przejdź do kroku 3.
    10. Do hodowli należy ułożyć CPC na szalkach pokrytych poli-L-ornityną (0,1 mg/ml) i lamininą (1 mg/ml) o gęstości między 8 x 104 a 2,5 x 105 komórek/cm2 w pożywce CCM i inkubować je w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności względnej 100%.
    11. Ponieważ CPC zaczynają różnicować się w neurony w hodowli komórkowej (po około 4 dniach), należy traktować datę sekcji jako dzień in vitro 0 (dzień 0). W przypadku dłuższych okresów uprawy należy wymieniać połowę podłoża co czwarty dzień na świeże podłoże CCM.
    12. Zastosuj 1-5 μM SGC0946 lub EPZ5676 rozpuszczony w DMSO w dniu 0 (4-5 godzin po izolacji komórek) i odświeżaj co drugi dzień. Stosuj DMSO jako leczenie kontrolne. W razie potrzeby należy sprawdzić skuteczność leczenia inhibitorami za pomocą standardowych metod immunoblot.
  2. Izolacja i fakultatyczna uprawa CGNP
    1. Eutanazja zwierząt P5-7 przez ścięcie głowy za pomocą nożyczek. Usuń skórę głowy, otwórz czaszkę i usuń mózg za pomocą małych nożyczek i kleszczy. Odizoluj móżdżek i przenieś go do lodowatego HBSS/Glukoza. Usuń wszystkie opony mózgowe i naczynia krwionośne i przenieś móżdżek do 15 ml probówek wypełnionych zimnym HBSS/Glukozą.
    2. Przemyć móżdżek trzykrotnie 10 ml lodowatego HBSS/glukozy (zebrać je przez odwirowanie w temperaturze 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C), a następnie homogenizować móżdżek, delikatnie pipetując w górę i w dół pipetą o pojemności 1 ml (maksymalnie 2-3 razy), aby uzyskać 0,5-1 mm3 fragmenty.
    3. Dodać 5 ml 0,025% trypsyny do HBSS/glukozy i inkubować tkankę pod ciągłym mieszaniem w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut. Zatrzymać trawienie przez dodanie 5 ml CGM i zebrać tkankę przez odwirowanie w temperaturze 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Usunąć supernatant i rozprowadzić tkankę za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml w 1 ml CGM i przenieść ją do nowej probówki o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Ważne jest, aby unikać pęcherzyków powietrza.
      1. Dodać 5 ml CGM i inkubować mieszaninę przez 2 minuty na lodzie, aby osadzić resztki tkanek. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj 2 ml CGM do pozostałej tkanki i powtórz procedurę rozcierania.
    5. Zebrać supernatanty (bez resztek tkanek, łącznie około 10 ml) i odwirować przy 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania komórek móżdżku. Zawiesić osad w 10 ml CGM.
    6. Ponieważ astrocyty szybciej i silniej przylegają do poli-D-lizyny niż CGNP, umieść komórki na 6-dołkowych płytkach pokrytych poli-D-lizyną o stężeniu 100 μg/ml (do 4 ml na dołek) i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 °C w celu usunięcia astrocytów.
    7. Wstrząsnąć płytką i zebrać supernatant. Następnie odwirować w probówce o pojemności 15 ml przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 10 ml CGM i policzyć komórki za pomocą komory liczącej Neubauera.
      UWAGA: CGNP są okrągłe, małe i pokazują aureolę podczas obrazowania za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym.
    8. W razie potrzeby wysiać komórki w 37 °C, wstępnie ogrzanym CGM na płytkach pokrytych poli-L-ornityną (3 x 10 6 komórek na 6 dołków) i inkubować je w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności względnej 100%.
      UWAGA: Jeśli wysiewanie nie zostanie wykonane, przejdź do kroku 3.1.
      1. Po 6-12 godzinach wymień pożywkę na CGM-SHH. Izolowane CGNP należy traktować przez 6 godzin (lub przy zmianie na CGM-SHH) po izolacji inhibitorem DOT1L i kontrolą DMSO i odnawiać co drugi dzień (porównać z 2.1.12). W razie potrzeby należy przetestować skuteczność leczenia inhibitorami za pomocą standardowych metod immunoblot. W przypadku ChIP przejdź do kroku 3.3.
        UWAGA: Pozostawienie CGM na płytkach (a wraz z nim FBS) spowoduje różnicowanie CGNP w neurony ziarniste móżdżku (CGN).

3. Utrwalanie komórek i ścinanie chromatyny

UWAGA: Wykonaj kroki 3.1 i 3.2, jeśli komórki nie są hodowane, jeśli są hodowane, przejdź do kroku 3.3.

  1. Zebrać komórki przez odwirowanie przez 4 minuty przy 1,000 x g i dodać 1,3 ml PBS. Przenieść próbkę do probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować przez 4 minuty w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4°C. Przemyć próbkę dwukrotnie 1,3 ml PBS.
  2. Etap krytyczny: Dodać 350 μl 1% PFA do próbki i inkubować przez 5 minut w temperaturze 22 °C. Aby zatrzymać reakcję, dodaj 18,4 μl glicyny i 1 ml PBS. Odwirowywać próbkę przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C.
    1. Przemyć próbkę dwukrotnie lodowatym PBS. Zebrać utrwalone komórki przez odwirowanie przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g i temperaturze 4 °C. Od tej pory próbki należy przechowywać na lodzie.
      UWAGA: Czas utrwalenia musi wynosić dokładnie 5 minut, aby uzyskać optymalne wyniki. Różne numery komórek mogą wymagać adaptacji czasowej.
  3. Etap krytyczny: Do hodowanych CGNP (lub CPC) dodaj do 1 ml 1% PFA bezpośrednio do studzienek na płytce do hodowli komórkowych. Po 5 minutach inkubacji w temperaturze 22 °C dodać odpowiednią ilość glicyny i PBS i zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek.
    1. Przenieść komórki do probówek o pojemności 1,5 ml i odwirować próbkę przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g i temperaturze 4 °C. Dwukrotnie przemyć próbkę lodowatym PBS. Zebrać utrwalone komórki przez odwirowanie przez 5 minut przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C. Od tej pory próbki należy przechowywać na lodzie.
  4. Etap krytyczny: Dodać 700 μl buforu do lizy (+ inhibitor proteazy) i inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Wirować próbkę co 5 minut. Ścinać chromatynę lizowanych komórek 3 x 10 min w sonikatorze (30 s impuls, 30 s przerwy) przy maksymalnej mocy.
    1. Upewnij się, że objętość nie przekracza 350 μl na probówkę. Próbki należy mieszać co 10 minut. Sprawdzić lizat pod kątem pozostałych jąder za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym.
      UWAGA: Ważne jest, aby uzyskać optymalne wyniki ścinania (porównaj z Rysunek 1B) do późniejszej analizy. W przypadku stosowania innych metod ścinania chromatyny, należy zoptymalizować ścinanie do fragmentów chromatyny o wielkości 200-500 pz.
  5. Resztki komórek osadu przez 10 minut, 13 000 x g, 4 °C. Użyć supernatantu do etapu wstępnego oczyszczania 5.2. W razie potrzeby zamrozić próbkę w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.

4. Przygotowanie koralików i wstępne oczyszczanie

  1. Umyj 45 μl kulek magnetycznych białka A/ChIP i 20 μl kulek magnetycznych/próbkę 1 ml lodowatego PBS zawierającego 0,02% Tween trzykrotnie za pomocą podstawki magnetycznej. Następnie dodaj 1 ml lodowatego PBS do kulek.
  2. Do 1 ml lodowatego PBS i 45 μl kulek/ChIP dodać 3 μg przeciwciała/ChIP (H3K79me2 lub króliczej IgG). Inkubować próbki przez 2 godziny w temperaturze 4 °C na rotatorze w celu związania przeciwciał z kulkami. W zależności od przeciwciała należy użyć ~3 μg przeciwciała/ChIP.
  3. Umyj kulki związane z przeciwciałami trzykrotnie 1 ml lodowatego PBS zawierającego 0,02% Tween. Dodać odpowiednią objętość kulki (początkową objętość użytych kulek magnetycznych) lodowatego PBS do przemytych kulek sprzężonych z przeciwciałami.
  4. Dodać 600 μl buforu rozcieńczającego i 20 μl przemytych kulek magnetycznych do próbki w celu wstępnego oczyszczania (całkowita objętość 1,320 μl) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C na rotatorze. Usuń koraliki za pomocą stojaka magnetycznego. Pobrać 5% (33 μl) lizatów jako próbki wejściowe i zamrozić je w temperaturze -20 °C.

5. Immunoprecypitacja chromatyny

  1. Podzielić wstępnie oczyszczony ekstrakt na dwie probówki (około 643,5 μl), dodać taką samą objętość buforu rozcieńczającego i kulki związane z przeciwciałami (45 μl/próbkę; H3K79me2 lub królicza IgG). Próbki należy inkubować w temperaturze 4 °C przez noc na rotatorze.
  2. Przemyć kulki lodowatym buforem ChIP 1, buforem ChIP 2 i buforem ChIP 3 przez 10 minut każdy w temperaturze 4 °C na rotatorze. Następnie przemyć trzykrotnie buforem TE przez 5 minut w temperaturze 4 °C na rotatorze.
  3. Eluować kulki za pomocą buforu elucyjnego przez 1 godzinę przy 1 400 obr./min w wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
  4. Dodać 10 μg RNazy (1 mg/ml) na próbkę ChIP i 5 μg do próbek wejściowych i inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze 37 °C (1 400 obr./min).
  5. Dodać 100 μg proteinazy K (20 μg/μl) na próbkę ChIP i 50 μg na wejście, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 65 °C przy 1 400 obr./min.

6. Oczyszczanie próbek ChIP

  1. Oczyść ChIP i wprowadź próbki za pomocą zestawu do oczyszczania DNA (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcją. Używaj więcej kolumn oczyszczających, gdy spodziewane jest więcej niż 5 μg DNA. Eluować próbkę za pomocą 2 x 15 μl buforu elucji DNA dostarczonego w zestawie.
  2. Przeprowadzić oznaczanie ilościowe próbek (użyć 1 μl) przy użyciu fluoroforu wizualizującego i fluorospektrometru (patrz tabela materiałów).

7. Analiza próbek ChIP za pomocą qPCR

  1. Aby zaprojektować starter do analizy qPCR, pobierz interesujące sekwencje genomowe z przeglądarki Integrative Genomics Viewer (IGV) browser34. Zaprojektuj startery wokół miejsca rozpoczęcia transkrypcji (TSS) genu, ponieważ H3K79me2 prawdopodobnie tam się znajduje. Jako kontrolę należy wziąć pod uwagę niekodujące regiony genomu lub regiony około 10 Kb przed TSS lub 10 Kb za końcowym miejscem transkrypcji (TES).
    1. Wytwarzaj podkłady za pomocą https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/, używając produktu o wielkości od 70 do 200 pz i optymalnej temperaturze ustawionej na 60 °C. Do celów próbnych należy użyć starterów dla regionów genomu Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3 i Npm1 wymienionych w tabeli 1.
  2. Przetestuj nowo zaprojektowane startery z następującym programem qPCR, mieszanką wzorcową i gradientem temperatury wyżarzania w zakresie od 58 °C do 63 °C, a następnie wybierz temperaturę wyżarzania z najwyższą ilością i jakością produktu.
    1. Zastosuj elektroforezę w żelu DNA, aby kontrolować oczekiwany rozmiar produktu. Do analizy qPCR należy użyć systemu wykrywania PCR w czasie rzeczywistym (patrz tabela materiałów).
    2. Przygotować mieszankę główną, używając 10 μl mieszaniny głównej polimerazy DNA, 0,5 μl startera do przodu (10 μM), 0,5 μl startera do tyłu (10 μM), 4 μl wody wolnej od nukleaz i 5 μl DNA (1 ng/μL).
    3. Użyj 2-etapowego programu qPCR w następujący sposób: 5 minut w 95 °C, 50x (30 s w 95 °C, 30 s w 58 °C-63 °C) i gradient denaturacji stale w 4 °C.
  3. Stwórz serię rozcieńczeń genomowych, ściętych, oczyszczonych próbek DNA (2 ng/μL, 1 ng/μL, 0,5 ng/μL, 0,25 ng/μL i 0,125 ng/μL) i użyj 5 μL do testu wydajności za pomocą qPCR. Określ nachylenie krzywej standardowej i oblicz wydajność podkładu według następującego wzoru:
    Wydajność (%) = (10^(-1/nachylenie)-1)*100.
    1. W idealnym przypadku należy stosować podkłady o sprawności od 90% do 105% lub przynajmniej o sprawności od 85% do 115%.
  4. Aby przeanalizować ChIP i próbki wejściowe, należy zastosować 0,1-1 ng DNA ChIP zmieszanego z odpowiednim starterem do przodu i do tyłu, wodą wolną od nukleaz i mieszanką główną polimerazy DNA w końcowej objętości 20 μl dla każdej reakcji qPCR.
  5. Określ wartości cyklu progowego (CT) dla ChIP i próbek wejściowych i znormalizuj wartości próbki Ct do Ct danych wejściowych, aby obliczyć wzbogacenie (% danych wejściowych) za pomocą następującego wzoru. Użyj wartości Ct uzyskanych z kontroli IgG, aby określić poziom tła.
    % wejścia = 100-2^(norm. wejście − norm. ChIP)
    norm. wejście = Ct (wejście) − log2 (współczynnik rozcieńczenia)
    norm. ChIP = Ct (ChIP) − log2 (współczynnik rozcieńczenia)
    UWAGA: norm. = znormalizowany

8. Analiza próbek ChIP za pomocą sekwencjonowania

  1. Przenieść próbki ChIP (wejściową i immunoprecypitowaną próbkę DNA) do zakładu sekwencjonowania.
  2. Aby wcześniej przygotować bibliotekę, należy użyć odpowiedniego zestawu do przygotowania biblioteki (patrz Spis Materiałów) i przekonwertować 2 ng wejściowego DNA i całość DNA immunoprecypitowanego na zindeksowane biblioteki do sekwencjonowania multipleksowego nowej generacji na wskazanej platformie (patrz Spis Materiałów).
  3. Krytyczny krok: Postępując zgodnie z instrukcjami zestawu, podwiązaj adaptery do sekwencjonowania (o stężeniu roboczym 15 μM), aby zakończyć naprawione i dA-tailed fragmenty DNA. Do sekwencjonowania adaptorów i starterów PCR należy stosować odpowiednie olikleotydaże (patrz Tabela materiałów). W przypadku takiej ilości wejściowego DNA należy użyć 6-9 cykli PCR, aby wzbogacić fragmenty DNA ligowane adaptorowo.
    UWAGA: Zwykle nie jest konieczne dokonywanie selekcji rozmiaru DNA ligowanego adaptorowo. Najlepiej jest stosować jak najmniej cykli PCR, ponieważ wiele cykli amplifikacji PCR skutkuje duplikatami PCR i dużym odchyleniem GC.
  4. W celu ostatecznego sprawdzenia biblioteki należy pobrać 0,5 μl całkowitej reakcji do analizy, aby zobrazować rozkład wielkości na odpowiednim urządzeniu (patrz Tabela materiałów). Do oceny ilościowej należy użyć barwnika wizualizującego w połączeniu z fluorospektrometrem lub innymi metodami (patrz Tabela materiałów).
  5. Ponieważ H3K79me2 wydaje się być modyfikacją histonów, która jest szeroko rozłożona na większe regiony genomu, sekwencjonuj próbki sparowanymi końcami z długością odczytu 50 pz i głębokością sekwencjonowania 75 odczytów Mio.
  6. Analizuj dane ChIP-seq za pomocą serwera Galaxy/Uni Freiburg (galaxy.uni-freiburg.de).
  7. Przeprowadź kontrolę jakości za pomocą uzyskanych ChIPseq z FastQC i, jeśli to konieczne, zmapuj je bezpośrednio za pomocą Bowtie2 w wersji 2.2.035 z przycinaniem lub bez. Jako referencyjny zestaw genomu użyj mm9 lub najnowszej wersji mm10; oraz jako adnotacja referencyjna Ensembl FTP release 79.
  8. Opcjonalnie: Usuń odczytane duplikaty za pomocą Picard MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) przed szczytowym wywołaniem.
  9. Wywołaj szczyty za pomocą MACS2 w wersji 2.1.036 przy użyciu opcji "broad" dla H3K79me2.
  10. Aby uzyskać stosunek log2 między ChIP a próbką wejściową, log2 liczby odczytów współczynnika odczytów obu próbek używa BamCoverage i BamCompare.
  11. Do wszystkich innych dogłębnych analiz specyficznych dla ChIP-seq należy zastosować deepTools2 w wersji 2.3.5 lub 2.4.137, tj. do generowania plików śledzenia zasięgu (bamCoverage tylko dla ChIP, bamCompare do porównania ChIP z danymi wejściowymi), do oszacowania wydajności ChIP użyj plotFingerprint i do wygenerowania ogólnego przeglądu użyj computeMatrix, plotHeatmap. Wybierz grupowanie K-średniej podczas procesu computeMatrix, aby grupować regiony genomu zgodnie z rozkładem H3K79me2.
  12. Wykorzystanie opublikowanych danych ChIP-seq jako H3K79me2 E14.5 DT zdeponowanego w NCBI do celów próbnych (numer dostępu: SRP057733).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ogólny schemat izolacji progenitorów neuronalnych, hodowli, ChIP H3K79me2 oraz metod analizy ChIP: Rysunek 1 przedstawia schemat blokowy przeprowadzania ChIP H3K79me2 w komórkach progenitorowych kory w różnych punktach czasowych podczas embrionalnego rozwoju mózgu lub w progenitorach neuronów ziarnistych móżdżku w etapach postnatalnych. W pierwszym kroku należy wyizolować mózg i pobrać telencefalon (między E11.5 a E14.5) lub móżdżek (P5-P7). ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istnieją dwa główne sposoby przeprowadzania immunoprecypitacji chromatyny w celu wykrycia genomowego zajętości modyfikacji histonów, czynników transkrypcyjnych, czytników kodów histonów, programów zapisujących lub gumek. Jedną z nich jest natywna metoda ChIP wykorzystująca trawioną nukleazą, natywną chromatynę do immunoprecypitacji, a druga to prezentowana metoda wykorzystująca utrwaloną, ścinaną chromatynę utrwaloną PFA, w której nukleosomy i inne białka przyłączone do DNA są kowalencyjnie związane z DNA

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych

Podziękowania

Dziękujemy Henriette Bertemes za pomoc w ustanowieniu protokołu uprawy CGN w laboratorium. Ta praca metodyczna była wspierana przez finansowaną przez DFG CRC992 Medical Epigenetics poprzez finansowanie dla TV. Autorzy dziękują za wsparcie zespołu z Freiburg Galaxy: Pavankumar Videm, Björn Grüning i prof. Rolf Backofen, Bioinformatyk, Uniwersytet we Freiburgu, Niemcy, ufundowane przez Collaborative Research Centre 992 Medical Epigenetics (grant DFG SFB 992/1 2012) oraz niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań (grant BMBF 031 A538A RBC (de. NBI)).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anty-GAPDHAbcamab8245Kategoria: Przeciwciało
Skrót/Komentarz: Rozcieńczenie immunoblot 1:5000
Anty-H3Abcamab1791Kategoria: Przeciwciało
Skrót/Komentarz: Rozcieńczenie immunoblot 1:3000
Diagenodaanty-H3K79me2pAb-051-050Kategoria: Przeciwciało
Skrót/Komentarz: Przeciwciało ChIP
Anti-H3K79me2Abcamab-051-050Kategoria: Przeciwciało
Skrót/Komentarz: Rozcieńczenie immunoblot 1:1000
Anty-królicze IgGDiagenodeC15410206Kategoria: Przeciwciało
Skrót/Komentarz: ChIP Ctrl przeciwciało
Antytubulina alfaAbcamab108629Kategoria: Przeciwciało
Skrót/Komentarz: Rozcieńczenie immunoblot 1:3000
Apo-Transferyna (1 mg / ml)Sigma-AldrichT1147Kategoria: Hodowla komórkowa
Skrót/Komentarz: Dla
suplementu CCM B27 (50x)Life Technologies17504044Kategoria: Hodowla komórkowa
Skrót/Komentarz: Dla CCM
BioanalyzerAgilent technologiesG2940CAKategoria: ChIP
Skrót/Komentarz: Do analizy chromatyny ścinanej
Bioruptor NextGenDiagenodeB01020001Kategoria: ChIP
Skrót/Komentarz: Ultrasonics
Kwas borowy pH 8,4Sigma AldrichB6768Kategoria: Hodowla komórkowa
Skrót/Komentarz: Do hodowli CPC
CFX Connect RT PCR System wykrywaniaBio-Rad1855201Kategoria: Analiza ChIP
Skrót/Komentarz: System detekcji qPCR
DMEM-F12Life Technologies11320-033Kategoria: Hodowla komórkowa
Skrót/Komentarz: Dla CGM
Dynabeads Protein AInvitrogen10001DKategoria: ChIP
Skrót/Komentarz: Koraliki magnetyczne, do ChIP
EPZ-5676SelleckchemS7062Kategoria: Hamowanie DOT1L
Skrót/Komentarz: Do hamowania DOT1L w hodowli komórkowej
Kwas etylenodiaminotetraoctowySERVA39760.01Kategoria: ChIP
Skrót/Komentarz:
Płodowa surowica bydlęca EDTA 10% (v / v)Gibco10082147Kategoria: Hodowla komórkowa
Skrót/Komentarz: Do izolacji CPC i CGM
GlukozaSigma-AldrichG5767Kategoria: Hodowla komórkowa
Skrót/Komentarz: Do izolacji CGNP
Glutation (1,25 mg/ml)Sigma-AldrichG4251Kategoria: Hodowla komórkowa
Skrót/Komentarz: Dla CCM
GlycineCarl Roth3187Kategoria: ChIP
Skrót/Komentarz: Do utrwalania komórek
GoTaq mastermixPromegaA6002Kategoria: Analiza ChIP
Skrót/Komentarz: Główna mieszanka polimerazy DNA do qPCR
Hank' s Balanced Salt SolutionLife Technologies14025-100Kategoria: Hodowla komórkowa
Skrót/Komentarz: HBSS
L-glutamina (200 mM)Life Technologies25030081Kategoria: Hodowla komórkowa
Skrót/Komentarz: Dla CCM
LamininSigma-AldrichL2020Kategoria: Hodowla komórkowa
Skrót/Komentarz: Do hodowli CPC
Chlorek lituSigma-AldrichL4408Kategoria: ChIP
Skrót/Komentarz: Suplement LiCl
N2Life Technologies17502048Kategoria: Hodowla komórkowa
Skrót/Komentarz: Dla CGM
NanoDrop 3300Thermo Fisher3300Kategoria: ChIP
Skrót/Komentarz: Fluorospektrometr do kwantyfikacji DNA
NEB Next Ultra Zestaw do przygotowania biblioteki dla IlluminaNEBE7645SKategoria: ChIP Analysis
Skrót/Komentarz: Zestaw do przygotowania biblioteki
NEBNext Multiplex Oligos dla IlluminaNEBE7335Kategoria: Analiza ChIP
Skrót/Komentarz: Oligotypy do przygotowania biblioteki
Pożywka neuropodstawowaGibco21103049Kategoria: Hodowla komórkowa
Skrót/Komentarz: Dla CCM
NP-40 AlternatywnyCalbiochem492016Kategoria: ChIP
Skrót/Komentarz: Dla bufora ChIP
ParaformaldehydCarl Roth335Kategoria: ChIP
Skrót/Komentarz: PFA, do utrwalania komórek
Penicylina-Streptomycyna-Neomycyna 1% (v/v)Life Technologies15640055Kategoria: Hodowla komórkowa
Skrót/Komentarz: PSN, dla CCM i CGM
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemLife Technologies10010023Kategoria: Hodowla komórkowa
Skrót/Komentarz: PBS, do izolacji CPC
PicoGreen KitThermo FisherP11496< silny>Kategoria: Analiza ChIP
Skrót/Komentarz: Wizualizacja barwnika do kwantyfikacji DNA
Poli-D-lizynaSigma-AldrichP6407Kategoria: Hodowla komórkowa
Skrót/Komentarz: Do izolacji CGNP
Bromowodorek poli-L-ornitynySigma AldrichP3655Kategoria: Hodowla komórkowa
Skrót/Komentarz: Do hodowli CPC
Chlorek potasuThermo FisherAM9640GKategoria: Hodowla komórkowa
Skrót/Komentarz: KCl, dla
inhibitora proteazyRoche4693159001Kategoria: ChIP
Skrót/Komentarz: Dla Proteinazy
ChIP KSigma-Aldrich3115879001Kategoria: ChIP
Skrót/Komentarz: Dla ChIP
Qiagen MinEluteQiagen28004Kategoria: ChIP
Skrót/Komentarz: Zestaw do oczyszczania DNA
RNAseSigma-AldrichR6513Kategoria: ChIP
Skrót / komentarz: Dla ChIP
SGC0946SelleckchemS7079Kategoria: Inhibicion DOT1L
Skrót/Komentarz: Do hamowania DOT1L w hodowli komórkowej
Wodorowęglan soduCarl Roth8551.1Kategoria: ChIP
Skrót/Komentarz: dla buforu elucyjnego
Chlorek soduCarl Roth9265Kategoria: ChIP
Skrót/Komentarz: NaCl, dla buforu ChIP
Deoksycholan soduSigma-Aldrich30970Kategoria: ChIP
Skrót/Komentarz: Dla
ChIP Sodium dodecylosiarczanCarl Roth183Kategoria: ChIP
Skrót/Komentarz: SDS, dla ChIP
Sonic hedgehock (SHH)Sigma-AldrichSRP6004Kategoria: Hodowla komórkowa
Skrót/Komentarz: Do izolacji CGNP
Dysmutaza ponadtlenkowa (1mg/ml)Sigma-AldrichS7571Kategoria: Hodowla komórkowa
Skrót/Komentarz: Dla CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneCarl Roth9090Kategoria: ChIP
Skrót/Komentarz: TRIS, dla bufora ChIP
Triton X-100Carl RothX100Kategoria: ChIP
Skrót/Komentarz: Dla bufora ChIP
Trypsyna-EDTA 0,05% (w/v)Sigma Aldrich59417CKategoria: Hodowla komórkowa
Skrót/Komentarz: Do izolacji CPC
Tween20Carl Roth28320Kategoria: ChIP
Skrót/Komentarz: Do przygotowania koralików
Inne urządzenia laboratoryjne: Komora licząca Neubauera, Inkubator, Rotator, Wytrząsarka, Zestaw do rozwarstwiania, Kąpiel
CCM: Pożywka
CGM: Pożywka
CGM wodnadla komórek korowych do hodowli komórkowych CGNP

Bibliografia

  1. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
  2. Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
  3. Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327(2005).
  4. Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
  5. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
  6. Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
  7. McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
  8. Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
  9. Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
  10. Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
  11. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  14. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  15. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  16. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
  17. Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
  18. Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
  19. Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
  20. Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
  21. Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
  22. Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
  23. Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
  24. van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
  25. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190(2008).
  26. Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485(2015).
  27. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
  28. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190(2008).
  29. Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
  30. Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
  31. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  32. Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
  33. Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
  34. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  35. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
  36. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137(2008).
  37. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
  38. Roidl, D. Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
  39. Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , Institut national de la santé et de la recherche médicale. (2001).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

progenitory neurony ziarniste m d kukom rki progenitorowe korytrawienie tkanekhodowla kom rkowacytometria przep ywowaWestern blotanaliza qPCR
Izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znacznika dimetylacji histonu 3 lizyny 79
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.