Nowatorski test obrazowania na żywo in vitro fagocytozy za pośrednictwem astrocytów przy użyciu synaptosomów sprzężonych ze wskaźnikiem pH

Komórki glejowe, które odnoszą się do niepobudliwych komórek w mózgu, są głównym typem komórek w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Wcześniej komórki glejowe były uważane za zwykłe komórki podporowe, które odgrywają głównie pasywną rolę w utrzymaniu przetrwania neuronów i podstawowych właściwości synaptycznych. Jednak pojawiające się dowody ujawniły, że komórki glejowe odgrywają bardziej aktywną rolę w różnych aspektach neurobiologii, takich jak utrzymanie homeostazy mózgu, pośredniczenie w tworzeniu synaps^1,2,3 i eliminacja synaps^4,5 oraz modulowanie plastyczności synaptycznej^6,7. Komórki glejowe w OUN obejmują astrocyty, mikroglej i oligodendrocyty. Wykazano, że wśród tych komórek astrocyty i mikroglej odgrywają role fagocytarne, pochłaniając synapsy^4,5, komórki apoptotyczne⁸, neuromal debris⁹ oraz białka chorobotwórcze, takie jak blaszki beta amyloidu^10,11. W rozwijającym się mózgu astrocyty eliminują synapsy w grzbietowym jądrze kolankowatym bocznym (dLGN) poprzez fagocytozę zależną od MERTK i MEGF10⁴. Podobnie, mikroglej eliminuje również synapsy pokryte C1q na etapach rozwoju poprzez klasyczną kaskadę dopełniacza⁵. Co ciekawe, zasugerowano, że defekty w przycinaniu synaps mogą być jednym z inicjatorów kilku zaburzeń neurologicznych. Na przykład wykazano, że mutacje w składniku dopełniacza 4 (C4), które zwiększają przycinanie synaps za pośrednictwem dopełniacza przez mikroglej, są silnie związane z występowaniem schizofrenii u ludzi¹². Niedawny artykuł wykazał również, że klasyczny szlak dopełniacza jest hiperaktywowany w początkowych stadiach choroby Alzheimera i indukuje wczesną utratę synaps w tej chorobie¹³.

W porównaniu z fagocytozą za pośrednictwem mikrogleju, mniej jasne jest, czy fagocytoza za pośrednictwem astrocytów przyczynia się do inicjacji i progresji różnych zaburzeń neurologicznych. Jednak niedawny artykuł sugeruje, że czynniki, które zmieniają tempo normalnego przycinania synaps przez astrocyty, mogą zakłócać homeostazę mózgu i przyczyniać się do podatności i patologii na AD¹⁴. Szybkość przycinania synaps przez astrocyty jest silnie kontrolowana przez izomery ApoE, przy czym allel ochronny dla AD (ApoE2) silnie zwiększa częstość, a allel ryzyka dla AD (ApoE4) znacznie obniża tempo. Co więcej, myszy transgeniczne wykazujące ekspresję ApoE4 zgromadziły znacznie więcej synaptycznego C1q niż myszy kontrolne lub ApoE2¹⁴. Dane te sugerują, że upośledzona fagocytoza za pośrednictwem astrocytów we wczesnym mózgu AD może indukować akumulację starzejących się synaps pokrytych C1q / szczątków synaptycznych, które aktywują fagocytozę mikrogleju za pośrednictwem dopełniacza, prowadząc do degeneracji synaptycznej. Upośledzona zdolność fagocytarna astrocytów u nosicieli ApoE4 może również przyczyniać się do niekontrolowanej akumulacji blaszek beta amyloidu w mózgach dotkniętych chorobą Alzheimera.

Ponadto, wykazano, że komórki glejowe w mózgu starzejącego się Drosophila tracą swoją zdolność fagocytarną z powodu zmniejszonej translacji Drapera, homologu Megf10, którego astrocyty używają do fagocytozy synaps. Przywrócenie poziomów Drapera uratowało zdolność fagocytarną komórek glejowych, które skutecznie usuwały uszkodzone szczątki aksonów w starzejącym się mózgu w podobnym stopniu, jak w młodym mózgu, co wskazuje, że wywołane starzeniem się zmiany w zdolności fagocytarnej astrocytów mogą przyczyniać się do zakłócenia homeostazy mózgu¹⁵.

Na podstawie tych nowych odkryć, modulowanie zdolności fagocytarnej astrocytów może być atrakcyjną strategią terapeutyczną w celu zapobiegania i leczenia różnych zaburzeń neurologicznych. W związku z tym podjęto kilka prób zwiększenia zdolności fagocytarnej astrocytów, na przykład poprzez indukowanie zakwaszenia lizosomów kwaśnymi nanocząstkami¹⁶ i nadekspresyjnym czynnikiem transkrypcyjnym EB (TFEB), co może zwiększyć biogenezę lizosomów¹⁷. Pomimo tych prób nadal nie jest jasne, w jaki sposób astrocyty i komórki mikrogleju różnią się kinetyką fagocytarną i czy powinniśmy zwiększać, czy zmniejszać ich zdolności fagocytarne w różnych chorobach.

W tym artykule prezentujemy nowatorski test in vitro do wykrywania zdolności fagocytarnej astrocytów w czasie rzeczywistym. Dane wskazują na różną kinetykę pochłaniania i degradacji w astrocytach i mikrogleju. Pożywka kondycjonowana astrocytami (ACM), która zawiera czynniki wydzielane z astrocytów, jest niezbędna do efektywnej fagocytozy zarówno astrocytów, jak i mikrogleju. Co więcej, Megf10, receptor fagocytarny w astrocytach i homolog Ced-1 i Drapera, odgrywa kluczową rolę w fagocytozie, w której pośredniczy astrocyty^8,18.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Koreański Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Koreańskim Instytucie Nauki i Technologii (IACUC), KA2016-08.

1. Oczyszczanie synaptosomów

UWAGA: Te procedury są zaadaptowane z wcześniej opublikowanego artykułu¹⁹ z kilkoma modyfikacjami w celu poprawy wydajności oczyszczonych synaptosomów (Rysunek 1).

1. Przygotuj podłoże o nieciągłej gęstości gradientowej.
   1. Umieść na lodzie: 3%, 10% i 23% roztwory gradientu gęstości w buforze gradientowym (doprowadzić do 250 ml wody z 109,54 g sacharozy, 606 mg Tris i 5 ml 0,2 M EDTA, pH 7,4); bufor homogenizujący (dodać 25 ml 4x buforu gradientowego i 500 μL 50 mM DTT do 74,5 ml wody); moździerz homogenizatora i tłuczek.
      UWAGA: Roztwór gradientu gęstości i przygotowanie przedstawiono w Tabeli 1. Aby przygotować roztwory gradientu gęstości 3%, 10% i 23%, użyj roztworu gradientu gęstości surowej.
   2. Przygotuj sześć ultra przezroczystych probówek wirówkowych na trzy dorosłe myszy.
   3. Dodać 3 ml roztworu o gradiencie gęstości 23% na dno każdej probówki wirówkowej za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Następnie powoli ułóż warstwę z 3 ml roztworu o gradientzie gęstości 10% na wierzchu roztworu gradientu gęstości 23% za pomocą pipety pastwiskowej i pipety 1 ml. Na koniec dodaj 3 ml 3% roztworu gradientu gęstości na wierzch. Na tym etapie należy zachować ostrożność, aby uniknąć wprowadzania bąbelków.
   4. Przykryj probówki wirówkowe folią spożywczą i trzymaj probówki na lodzie.
2. Schłodzić wirówkę szybkoobrotową i ultrawirówkę do temperatury 4 °C.
3. Sterylizuj sprzęt chirurgiczny (nożyczki operacyjne, nożyczki sprężynowe Castroviejo i zakrzywione kleszcze) 70% etanolem. Przygotować małą szklaną zlewkę z 25 ml buforu homogenizującego na lodzie i zważyć zlewkę.
4. Wyodrębnij mózgi trzech dorosłych (w wieku około 12 tygodni) samców myszy.
   1. Zwichnąć kręg szyjny i przeciąć szyję nożyczkami operacyjnymi. Zdejmij skórę głowy i czaszki wzdłuż linii środkowej za pomocą nożyczek operacyjnych i zakrzywionych kleszczy. Wytnij opuszki węchowe i móżdżek za pomocą nożyczek sprężynowych Castroviejo.
5. Włóż pozostałe mózgi do zlewki za pomocą zakrzywionych kleszczy i zważ mózgi. Przepłucz mózgi kilka razy lodowatym buforem homogenizującym, aby usunąć krew z powierzchni mózgu.
   UWAGA: Wcześniej zalecano 9 ml buforu homogenizującego na 1 g tkanek mózgowych.
6. Dodać 4 ml buforu homogenizującego i 1 g tkanek mózgowych do moździerza homogenizatora. Podczas homogenizacji mózgów dodaj bufor homogenizujący do 8 ml.
7. Podzielić homogenat na dwie probówki wirówkowe o pojemności 50 ml o dużej prędkości. Umyć zaprawę 1 ml świeżego buforu homogenizującego i dodać do probówek.
   Ostrzeżenie: Wykonaj kroki 1.3-1.7 tak szybko, jak to możliwe. Zalecane jest mniej niż 20 minut.
8. Odwirować homogenaty w probówkach wirówek o dużej prędkości 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C z wolniejszymi hamowaniami.
   UWAGA: Ustaw wskaźnik opóźnienia (hamowania) na dwa lub trzy, gdy maksymalna prędkość opóźnienia wynosi dziewięć.
9. Ostrożnie dodać supernatant do nowej probówki o pojemności 50 ml i dodać do 12 ml buforu homogenizującego.
10. Ostrożnie i powoli odpipetować pipetą 2 ml rozcieńczonego supernatantu na 3% roztworze gradientu gęstości za pomocą pipety o pojemności 1 ml i umieścić probówki na lodzie.
11. Wirować przy 31 000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C bez hamulców.
    UWAGA: Ustaw szybkość zwalniania na jeden (zero) lub wybieg.
12. Umieść probówki na lodzie i zbierz frakcję synaptosomu między 23% roztworem gradientu gęstości a 10% roztworem gradientu gęstości za pomocą pipety o pojemności 2 ml do probówki o pojemności 50 ml. Dodaj lodowaty bufor sacharozy/EDTA do 80 ml i podziel go na cztery 50-mililitrowe probówki wirówkowe o dużej prędkości.
    UWAGA: Zobacz Rysunek 3 dla frakcjonowanych synaptosomów z oznaczonymi gradientami.
13. Wirować przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C z mniejszą liczbą przerw.
    UWAGA: Ustaw szybkość zwalniania na dwa lub trzy, gdy maksymalna szybkość zwalniania wynosi dziewięć.
14. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml, ponownie zawiesić osad synaptosomu z 1 ml izotonicznego buforu fizjologicznego (140 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM MgCl₂, 1,2 mM NaH₂PO₄, 10 mM HEPES i 10 mM glukozy, pH 7,4)²⁰. Dodać 1 ml 10% DMSO do izotonicznego buforu fizjologicznego (końcowe stężenie DMSO: 5%) i zebrać synaptosomy do jednej 50-mililitrowej probówki wirówkowej o dużej prędkości
.
15. Podaniec 1 ml do probówek o pojemności 1,5 ml. Zmierz stężenie białka w synaptosomach za pomocą testu Bradforda.
16. Szybko zamroź probówki i przechowuj je w zamrażarce o temperaturze -80 °C do momentu koniugacji wskaźnika pH.

2. Koniugacja wskaźnika pH

1. Odwirować probówki o pojemności 1,5 ml z synaptosomami o stężeniu 21 092 x g przez 3-4 minuty w temperaturze 4 °C.
2. Usunąć sklarowany nad osadem, dodać 200 μl roztworu 0,1 M Na₂CO₃ i dobrze wymieszać pipetując.
   UWAGA: Na₂CO₃ dodano w celu podniesienia pH, ponieważ ester sukcynimidylowy najskuteczniej reaguje z aminami pierwszorzędowymi przy lekko zasadowym pH.
3. Dodać 2 μl wskaźnika pH do probówki i delikatnie zwirować.
   Uwaga: Użyj 1 μl wskaźnika pH na 0,3 mg roztworu synaptosomu.
4. Zminimalizuj ekspozycję na światło, przykrywając probówki folią aluminiową i inkubuj je przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej (RT) w wytrząsarce typu twist z delikatnym mieszaniem przy 30-40 obr./min.
5. Przestań mieszać i dodaj 1 ml DPBS.
6. Odwirować probówki o masie 21 092 x g przez 1-2 minuty.
7. Usunąć supernatant i dodać 1 ml DPBS w celu ponownego zawieszenia osadu przez delikatne pipetowanie.
8. Powtórz kroki 2.6-2.7 co najmniej siedem razy, aby usunąć niezwiązany wskaźnik pH.
9. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad z 200 μl DPBS z 5% DMSO.
   UWAGA: W tym momencie wszystkie synaptosomy są niefunkcjonalne. Potwierdziliśmy, że fosfatydyloseryna (PS) została wystawiona na działanie zewnętrznej błony synaptosomów, która działa jako sygnał "zjedz mnie" (Ryc. 4).

3. Astrocyty i oczyszczanie mikrogleju

UWAGA: Ten protokół oczyszczania astrocytów jest zaadaptowany z wcześniej opublikowanego artykułu²¹. W tym protokole opisano oczyszczanie astrocytów szczurów i mikrogleju. W notatkach opisano również szczegółowe procedury oczyszczania astrocytów myszy i mikrogleju.

1. Dzień przed oczyszczeniem
   1. Przygotuj wstępnie powlekane naczynia i roztwory do hodowli komórkowych.
   2. Przygotuj pięć szalek Petriego o wymiarach 145 mm x 20 mm z 25 ml 50 mM Tris-HCl (pH 9,5). Pierwotne lub wtórne leczenie przeciwciałami należy umieścić oddzielnie na szalkach Petriego, jak opisano poniżej. Inkubuj naczynia w zamrażarce przez noc.
      Naczynie BSL-1: 20 μL 5 mg/ml BSL-1 (lektyna Griffonia simplicifolia)
      Danie tylko dodatkowe: 60 μl 2,4 mg/ml koziego przeciwciała anty-mysiego IgG+IgM (H+L)
      Naczynie CD45: 60 μL 2,4 mg / ml koziego anty-mysiego IgG+IgM (H+L)
      Naczynie O4: 60 μl 2,4 mg/ml koziej anty-mysiej IgM (specyficznej dla łańcucha μ)
      Naczynie Itgb5 (integryna β5) dla astrocytów szczurów: 60 μL 2,4 mg / ml koziego anty-mysiego IgG+IgM (H+L)
      UWAGA: Aby przymocować przeciwciało wtórne do hydrofobowej powierzchni szalki Petriego, zaleca się powolne przyłączanie w niskich temperaturach. Możliwe jest jednak powlekanie szalki Petriego przeciwciałami drugorzędowymi przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Przeciwciała do płukania astrocytów są stosowane w różny sposób w zależności od gatunku zwierzęcia; na przykład miska HepaCAM dla astrocytów myszy: 60 μL 2,4 mg / ml koziego anty-mysiego IgG+IgM (H+L)
2. Dzień Oczyszczenia
   1. Przygotuj się do immunopłukania.
   2. Przygotuj probówki o pojemności 50 ml i dodaj do nich buliony. Szczegółowe przygotowanie roztworu podstawowego przedstawiono w Tabeli 1.
      1. Przygotuj probówkę 1 (enzym): 22 ml bulionu enzymatycznego (zapas enzymu: 1x zrównoważony roztwór soli Earle'a (EBSS) + 0,46% D(+)-glukozy + 26 mM NaHCO₃ i_{0,5 mM EDTA).}
      2. Przygotuj probówkę 2 (Low Ovo): 42 ml zapasu inhibitora (zapas inhibitora: 1x EBSS+0,46% D(+)-glukozy+26 Mm NaHCO₃).
      3. Przygotuj probówkę 3 (High Ovo): 10 ml wywaru inhibitora.
   3. Podłącz filtry strzykawkowe 0,22 μm do końcówek pipet 2 ml podłączonych do zbiornika CO₂ (95%_O2 i 5% CO_{2 ).} Bąbelki CO₂ do probówek 1-3. Przestań bulgotać, gdy roztwory zmienią kolor na pomarańczowy.
   4. Uzupełnij rozwiązania.
      Uwaga: Uzupełnić i inkubować roztwór w probówce 1 w temperaturze 34 °C przez 15 minut przed użyciem do aktywacji enzymu.
      1. Przygotuj probówkę 1 (enzym): 22 ml bulionu enzymatycznego + 180 j. papainy + 0,004 g L-cysteiny.
      2. Przygotuj probówkę 2 (Low Ovo): 42 ml preparatu inhibitora + 3 ml Low Ovo + 200 μl DNazy.
      3. Przygotuj probówkę 3 (High Ovo): 10 ml preparatu inhibitorowego + 2 ml roztworu High Ovo + 20 μl DNazy.
      4. Przygotuj probówkę 4 (0,2% BSA): 19 ml 1X DPBS + 1 ml 4% BSA + 8 μL DNazy.
      5. Przygotuj probówkę 5 (0,02% BSA): 45 ml 1X DPBS + 5 ml probówki 4 + 50 μL DNazy.
   5. Podgrzej łaźnię wodną i blok grzewczy w temperaturze 34 °C.
3. Wyodrębnij korę szczura.
   1. Wysterylizuj sprzęt chirurgiczny 70% etanolem i przygotuj 100-milimetrowe szalki Petriego za pomocą DPBS.
   2. Przygotuj akrylowe pudełko. Umieść dwie do trzech warstw chusteczek na dnie pudełka i dodaj 1 ml izofluranu do pudełka.
   3. Znieczulaj szczenięta przez 20-40 s w pudełku i potwierdź znieczulenie, szczypiąc stopę kleszczami. Wystaw heart²² i przelej szczenięta za pomocą strzykawki 10 ml z DPBS.
      UWAGA: Perfuzję stosuje się w celu uniknięcia zanieczyszczenia komórek krwi na etapie płukania mikrogleju.
   4. Przetnij górną linię szyjki szyi szczeniaka nożyczkami operacyjnymi i naciąć skórę głowy wzdłuż linii środkowej. Wykonaj nacięcie na czaszce wzdłuż linii środkowej i otwórz czaszkę zakrzywionymi kleszczami.
   5. Wytnij móżdżek za pomocą nożyczek sprężynowych Castroviejo. Wyjmij pozostały mózg i umieść go na 100-milimetrowej szalce Petriego wypełnionej DPBS.
   6. Usuń inne obszary, takie jak śródmózgowie i hipokamp z kory mózgowia za pomocą nożyczek sprężynowych Castroviejo pod mikroskopem. Usuń opony mózgowe za pomocą cienkich kleszczy.
   7. Przenieś korę do nowej 60-milimetrowej płytki i usuń pozostały DPBS z naczynia. Posiekaj tkankę ostrzem nr 10.
4. Dysocjacja kory mózgowej na zawiesinę pojedynczej komórki
   1. Przefiltrowany roztwór z probówki 1 wlać do naczynia o średnicy 60 mm i dodać 50 μl DNazy1. Zamieszaj roztwór w naczyniu.
      UWAGA: DNaza służy do hamowania agregacji DNA z pękniętych komórek.
   2. Umieść naczynie w bloku grzewczym o temperaturze 34 °C i przykryj je pokrywką z otworem pośrodku. Użyj lutownicy, aby zrobić otwór w pokrywie szalki Petriego o średnicy 60 mm.
   3. Podłącz filtry strzykawkowe 22 μm do rurki zbiornika CO₂ i umieść końcówkę filtra w otworze.
   4. Inkubować naczynie w temperaturze 34 °C przez 45 minut. Mieszać roztwór w naczyniu co 10 do 15 minut.
5. Zakończ przygotowywanie potraw do smażenia.
   1. Wyjmij naczynia do garnkowania, które zostały pokryte wtórnymi przeciwciałami, z zamrażarki dzień wcześniej. Pozostaw szalkę BSL-1 i naczynie zawierające tylko przeciwciała wtórne w RT.
   2. Umyj pozostałe naczynia trzykrotnie 20 ml DPBS.
   3. Wlej odpowiednią ilość 0,02% BSA do naczyń. Umieść specyficzne przeciwciała pierwszorzędowe w odpowiednich szalkach:
      Naczynie CD45: 12 ml 0,02% BSA + 20 μl 0,5 mg/ml CD45
      Naczynie Itgb5: 12 ml 0,02% BSA + 20 μL 0,5 mg/ml Itgb5
      Naczynie O4: 8 ml 0,02% BSA i 4 ml przeciwciała O4
      UWAGA: W przypadku immunopaningu myszy należy użyć mysiego anty-szczura CD45 (0,5 mg/ml) dla mikrogleju i HepaCAM (0,5 mg/ml) dla astrocytów.
   4. Przygotuj 30 ml 30% FBS z pożywką neuropodstawową i 10 ml 1X EBSS. Podgrzej oba roztwory w łaźni wodnej o temperaturze 34 °C.
6. Hamować reakcję papainy.
   1. Przenieś tkanki poddane papainie do nowej probówki o pojemności 50 ml. Poczekaj, aż tkanki się uspokoją. Zasysać ciecz przez odsysanie.
   2. Dodaj 4 ml roztworu Low Ovo do probówki i zamieszaj roztwór, aby przepłukać komórki.
   3. Powtórzyć kroki 3.6.1-3.6.2 trzy razy, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.
7. Potaryzować tkanki kory mózgowej.
   1. Dodaj 6 ml Low Ovo do wanny. Szybko odessać i uwolnić tkanki za pomocą pipety 5 ml.
      Uwaga: Nie wprowadzaj bąbelków.
   2. Przygotuj nową probówkę o pojemności 50 ml i dodaj 5 ml Low Ovo. Zbierz pojedyncze komórki w nowej probówce.
   3. Powtórz kroki 3.6.1-3.6.2 dwa razy i zmień pipetę 5 ml na pipetę 1 ml.
   4. Powtarzaj rozcieranie, aż więcej niż 95% tkanek nie będzie widocznych.
   5. Wykonać warstwę roztworu High Ovo z probówki 3 za pomocą pipety o pojemności 10 ml poniżej zdysocjowanych komórek o niskiej zawartości Ovo.
   6. Wirować przy 190 x g przez 6 minut z kilkoma hamulcami.
      UWAGA: Ustaw szybkość zwalniania na jeden lub dwa, gdy maksymalna szybkość zwalniania wynosi dziewięć.
8. Przefiltrować pojedyncze komórki.
   1. Ostrożnie odessać supernatant przez odsysanie, a następnie ponownie zawiesić osad z 3 ml 0,02% roztworu BSA za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
   2. Dodać 0,02% roztwór BSA do 9 ml.
   3. Przygotuj nową probówkę o pojemności 50 ml i sitko do komórek 20 μm na górze probówki. Zwilż sitko komórkowe 1 ml 0,02% roztworu BSA.
   4. Przenieść zawiesinę jednokomórkową do sitka do komórek. Filtruj 1 ml na raz.
   5. Umyj sitko komórkowe 3 ml 0,02% roztworu BSA. Nie należy sporządzać więcej niż 15 ml przefiltrowanej zawiesiny jednokomórkowej.
   6. Inkubować probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 34 °C przez 45-60 minut w celu odzyskania komórek. Etap odzyskiwania komórki pozwala na relokalizację białek powierzchniowych komórki do błony.
9. Wykonaj panoramowanie komórek.
   1. Umyj naczynie do patelni CD45 trzykrotnie 20 ml DPBS. Umyj każde naczynie trzy razy 20 ml DPBS bezpośrednio przed użyciem.
   2. Wlej zawiesinę jednokomórkową do naczynia do patelni CD45. Pozostaw naczynie na 28 min i potrząsaj naczyniem przez 14 min. Aby usunąć niezwiązane komórki z dna, ostrożnie potrząśnij naczyniem.
   3. Przenieść zawiesinę komórek do naczynia pomocniczego. Odczekaj 20 min i ostrożnie potrząsaj naczyniem przez 10 min. Aby uzyskać mikroglej z szalki CD45, przejdź do kroku 3.9.2.
   4. Przenieść zawiesinę komórkową do naczynia BSL-1. Pozostaw naczynie na 10 do 12 minut.
   5. Przełóż do naczynia O4. Odczekaj 20 min i potrząsaj przez 10 min.
   6. Przełóż do naczynia Itgb5. Pozostaw naczynie na 40 minut i delikatnie potrząsaj co 10 min.
      UWAGA: W przypadku panoramowania myszy przenieś zawiesinę komórek do naczynia HepaCAM.
10. Odłącz komórki od naczynia.
    1. Wymieszaj 400 μl trypsyny (30 000 U/ml w EBSS) z wstępnie inkubowanymi 8 ml 1X EBSS.
    2. Wlej oderwaną zawiesinę komórkową z naczynia do wiadra na odpady.
    3. Umyj naczynie osiem razy za pomocą DPBS.
    4. Wlej 8 ml EBSS z trypsyną do naczynia.
    5. Inkubować naczynie przez 5 do 10 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Inkubować przez 10 minut w przypadku szalki CD45 i 5 minut w przypadku szalek Itgb5 i HepaCAM.
    6. Postukaj w naczynie i obserwuj naczynie pod mikroskopem.
       UWAGA: Jeśli większość astrocytów nie odczepiła się, włóż naczynie z powrotem do inkubatora na kolejne 5 minut.
    7. Wlej 10 ml 30% FBS do naczynia, aby zneutralizować trypsynę.
    8. Pipetuj w górę i w dół w całym naczyniu, aby odłączyć astrocyty lub mikroglej.
    9. Przenieść roztwór do probówki o pojemności 50 ml.
    10. Do naczynia dodać 10 ml 30% FBS i 200 μl DNazy. Ponownie odłącz komórki. DNaza jest stosowana do hamowania agregacji DNA z pękniętych komórek.
    11. Przenieść roztwór do probówki. Jeśli komórki pozostaną w naczyniu, dodaj kolejne 10 ml 30% FBS i ponownie odłącz komórki.
11. Ułóż komórki na płytce.
    1. Odwirować probówkę o masie 213 x g przez 10 minut.
    2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą pożywki.
       UWAGA: Użyj immunopanned astrocyt basic media (IP-ABM) dla astrocytów i pożywki zasadowej dla mikrogleju siatkówki (MBM) z immunopanned astrocyte-conditioned media (IP-ACM) dla mikrogleju. Kompozycje IP-ABM i MBM przedstawiono w Tabeli Materiałów.
    3. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
    4. Astrocyty i mikroglej należy umieścić oddzielnie na płytkach pokrytych PDL.
       UWAGA: Przed użyciem przygotuj płytkę pokrytą PDL. Aby przygotować płytki pokryte PDL, dodać 50 μl 1 mg/ml poli-D-lizyny do 5 ml wody destylowanej i wlać odpowiednią ilość roztworu do płytki/naczynia studzienki i odczekać 30 minut. Umyj talerz/naczynie trzykrotnie wodą destylowaną.
    5. Inkubuj płytkę. Zmieniaj połowę pożywki co 7 dni w przypadku astrocytów i 3 dni w przypadku mikrogleju.

4. Zbieranie IP-ACM

1. Przygotuj 100-milimetrowe naczynie, gdy astrocyty są nadmiernie zlewające się.
2. Wyrzuć podłoże i umyj naczynie trzy razy 10 ml DPBS.
3. Wlej 15 ml pożywki niskobiałkowej do naczynia.
   UWAGA: Skład podłoża niskobiałkowego przedstawiono w Tabeli Materiałów.
4. Inkubować naczynie przez 7 do 10 dni w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
5. Zbierz i zagęść pożywkę za pomocą 10k (lub 30k) odśrodkowych rurek filtracyjnych.
6. Odwirować probówki przy 851 x g w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Odwiruj probówki, aż pozostała pożywka będzie mniejsza niż 1 ml.
7. Zebrać skoncentrowane podłoże (IP-ACM) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
8. Pomiar stężenia IP-ACM za pomocą analizy ilościowej

5. Test obrazowania na żywo fagocytozy (Rysunek 2)

1. Przygotuj 24-dołkową płytkę (lub dowolną płytkę/naczynie przygotowane do obrazowania na żywo), w której astrocyty zlewają się (ogólnie rzecz biorąc, 7 do 10 dni inkubacji po oczyszczeniu jest idealne do stabilizacji komórek).
2. Usuń pożywkę z każdej studzienki i umyj studzienki trzykrotnie 1 ml DPBS. Aby zminimalizować narażenie na powietrze, szybko umyj studzienki.
3. Dodaj 300 μl IP-ABM z 5 μl synaptosomów sprzężonych ze wskaźnikiem pH i dodatkowymi czynnikami, takimi jak IP-ACM, które mogą modulować fagocytozę komórek glejowych.
4. Inkubować płytkę w inkubatorze CO₂ przez 40 minut. Ten krok pozwala synaptosomom sprzężonym ze wskaźnikiem pH osiąść na dnie płytek.
5. Usunąć pożywkę z niezwiązanymi synaptosomami sprzężonymi ze wskaźnikiem pH i przemyć każdą studzienkę 1 ml DPBS, trzy razy.
   Uwaga: Nie myć mocno. Aby zminimalizować narażenie na powietrze, szybko umyj studzienki.
6. Dodaj 500 μl IP-ABM z dodatkowymi czynnikami do przetestowania do studzienek.
7. Zabierz płytkę do przyrządu do obrazowania na żywo i wybierz pozycje. Dostosuj ostrość, czas ekspozycji, jasność i moc diody LED.
   UWAGA: Ustawienia czasu ekspozycji, jasności i mocy diody LED są zmienne w zależności od intensywności fluorescencji i celu eksperymentu. W teście obrazowania na żywo z synaptosomami sprzężonymi ze wskaźnikiem pH zwykle ustawiamy te wartości w następujący sposób: ekspozycja: ~ 150-200 ms, jasność: 15 i moc diody LED: 4-6.
8. Ustaw format obrazu, przedział czasu i całkowitą liczbę cykli obrazowania na żywo. Ustaw przedział czasowy na 1 lub 2 godziny w zależności od liczby wybranych pozycji. Zalecane są odstępy 2-godzinne, gdy do obrazowania na żywo wybranych jest więcej niż 150 pozycji.
9. Rozpocznij eksperymenty z obrazowaniem na żywo.
10. Przeanalizuj dane.
    1. Otwórz program Fidżi.
    2. Importowanie sekwencji obrazów. Konwertuj obrazy na 8-bitową skalę szarości.
    3. Wykonaj odejmowanie tła z promieniem paska tocznego wynoszącym 50 pikseli.
    4. Uruchom analizator szeregów czasowych V3 plugins.
       UWAGA: Adres wtyczek analizatora szeregów czasowych V3 znajduje się w Tabeli materiałów.
    5. Przeciągnij obszar zainteresowania (ROI) na obrazie i kliknij przycisk Dodaj w menedżerze ROI.
    6. Kliknij "Uzyskaj całkowitą intensywność" w V3_0 Szeregi czasowe.
    7. Zapisz wyniki i zintegruj dane.

W tym teście fagocytozy in vitro z długoterminowym obrazowaniem na żywo, użyliśmy synaptosomów z homogenatów mózgu dorosłej myszy, które zostały rozdzielone w roztworze gradientowym między 23% roztworem gradientowym a 10% roztworem gradientowym przez ultrawirowanie (Rysunek 3). Po przygotowaniu synaptosomy odsłoniły PS w swojej zewnętrznej błonie (Ryc. 4), co sugeruje, że utraciły swoją funkcję i mogły być rozpoznawane przez receptory PS w astrocytach i mikrogleju. Jak pokazano w Rysunek 5, synaptosomy sprzężone ze wskaźnikiem pH emitowały jaskrawoczerwoną fluorescencję, gdy były pochłonięte przez astrocyty. Porównanie w czasie rzeczywistym zdolności komórek glejowych do pochłaniania i degradacji jest możliwe dzięki wykonaniu wielu zdjęć zwrotu z inwestycji co 1 lub 2 godziny (film uzupełniający 1, film uzupełniający 2). Dzięki tej metodzie wykazaliśmy różną kinetykę fagocytozy za pośrednictwem astrocytów i mikrogleju (Ryc. 6). Aby określić ilościowo fagocytozę komórek glejowych, zmierzono obszar (μm2) sygnału czerwonej fluorescencji, który odnosi się do indeksu fagocytarnego w Rysunek 6B i Rysunek 7. Chociaż astrocyty wydawały się być skuteczne w fagocytozowaniu dużych ilości synaptosomów sprzężonych ze wskaźnikiem pH, mikroglej był szybszy w pochłanianiu i degradacji synaptosomów (Figura 6B). Mikroglej wykazał maksymalną intensywność wskaźnika pH po 26 godzinach po leczeniu synaptosomem sprzężonym ze wskaźnikiem pH, podczas gdy astrocyty wykazały maksymalne po 45 godzinach (wartość p < 0,05, dwukierunkowa ANOVA między astrocytem z 1X ACM a mikroglejem z 1X ACM). Podobnie komórki mikrogleju wykazały 20,7% zmniejszenie całkowitej intensywności wskaźnika pH 40 godzin po punkcie szczytu, podczas gdy astrocyty wykazały 17% zmniejszenie całkowitej intensywności wskaźnika pH w tym samym okresie. Co ciekawe, nasze dane wykazały, że czynniki wydzielane przez astrocyty, które były zawarte w ACM, są niezbędne do zwiększenia fagocytozy zarówno za pośrednictwem astrocytów, jak i mikrogleju (Ryc. 6B). Wykazano, że astrocyty uwalniają cząsteczki mostkujące, takie jak MFGE8, GAS6 i ProteinS, które mogą łączyć i indukować interakcje między receptorami fagocytarnymi a sygnałami "zjadaj mnie", takimi jak PS23. Jak wspomniano powyżej, astrocyty eliminują synapsy poprzez szlaki MERTK i MEGF104. MEGF10 ulega ekspresji tylko przez astrocyty w mózgu i uczestniczy w pochłanianiu synaps poprzez rozpoznawanie sygnałów "zjadaj mnie" o nieznanej tożsamości. Zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami, test wykazał, że w porównaniu z astrocytami myszy typu dzikiego (WT), astrocyty myszy z nokautem Megf10 (KO) miały znacznie upośledzoną zdolność fagocytarną (Figura 7). W porównaniu z astrocytami WT, astrocyty Megf10 KO wykazały około 40% zmniejszenie całkowitej intensywności wskaźnika pH w punkcie szczytowym (31 godzin) (Ryc. 7).

Rysunek 1. Schemat oczyszczania astrocytów metodami immunopanningu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Schemat testu obrazowania fagocytozy na żywo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Reprezentatywne frakcjonowanie homogenatu mózgu w roztworach gradientowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Reprezentatywne obrazy synaptosomów narażonych na PS. (A) Obraz jasnego pola astrocytów z synaptosomami. Synaptosomy są przyłączone do astrocytów. (B) Fluorescencyjny obraz synaptosomów tdTomato-dodatnich, które są oczyszczane z mózgów myszy wykazujących ekspresję tdTomato. (C) pSIVA wiąże się z PS, który jest wystawiony na działanie zewnętrznej błony synaptosomu i emituje zieloną fluorescencję. (D) PS wykryty przez pSIVA (zielony) jest kolokalizowany z synaptosomami tdTomato-dodatnimi (czerwony). Podziałka skali: 20 μm Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Reprezentatywne obrazy jasnego pola i fluorescencyjne astrocytów z synaptosomami sprzężonymi ze wskaźnikiem pH w dwóch punktach czasowych. Po 11 godzinach od leczenia (dolny panel) synaptosomy sprzężone ze wskaźnikiem pH są pochłaniane przez astrocyty i emitują czerwoną fluorescencję, podczas gdy nie po 1 godzinie od leczenia (górny panel). Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Kinetyka fagocytarna astrocytów i mikrogleju szczurów poprzez długoterminowe obrazowanie na żywo. (A) Schemat ideowy testu fagocytozy in vitro z wykorzystaniem oczyszczonych astrocytów i mikrogleju wraz z synaptosomami sprzężonymi ze wskaźnikiem pH. Należy pamiętać, że przed wykonaniem obrazów na żywo, niezwiązane synaptosomy są wypłukiwane po 40 minutach inkubacji. (B) Reprezentatywne wykresy przedstawiające kinetykę pochłaniania i degradacji astrocytów i mikrogleju. ACM, który zawiera czynniki wydzielane przez astrocyty, znacznie zwiększa wychwyt synaptosomów zarówno przez astrocyty, jak i mikroglej. Astrocyt: Kontrola vs. Astrocyt z ACM 1X, ****, test wielokrotnych porównań Tukeya. Mikroglej: kontrola kontra mikroglej z ACM 1X, ****, wielokrotny test porównawczy Tukeya. Słupki błędów wskazują S.E.M. *p ≤ 0,05, **** p ≤ 0,0001, dwukierunkowa ANOVA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7. Zmniejszona pojemność fagocytarna astrocytów myszy Megf10 KO z 1X ACM w porównaniu z astrocytami myszy WT z 1X ACM. Astrocyty WT vs. Megf10 KO z 1X ACM, ****, dwukierunkowym ANOVA. Słupki błędów wskazują S.E.M. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 dwukierunkowa ANOVA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Przepisy na rozwiązania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający 1. Reprezentatywny film z obrazowania na żywo pokazujący fagocytozę synaptosomów sprzężonych ze wskaźnikiem pH przez astrocyty. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający 2. Reprezentatywny film z obrazowania na żywo pokazujący fagocytozę synaptosomów sprzężonych ze wskaźnikiem pH przez komórki mikrogleju. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.