W tym badaniu opisujemy dostęp do tylnego kanału półkolistego jako niezawodną metodę dostarczania genów do ucha wewnętrznego u noworodków myszy. Pokazujemy, że dostarczenie genu przez tylny kanał półkolisty jest w stanie przeniknąć do całego ucha wewnętrznego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Dostęp do tylnego kanału półkolistego do dostarczania genów do ucha wewnętrznego u nowonarodzonych myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Terapia genowa ucha wewnętrznego jest bardzo obiecująca jako potencjalna metoda leczenia utraty słuchu i zawrotów głowy. Jednym z kluczowych czynników decydujących o powodzeniu terapii genowej ucha wewnętrznego jest znalezienie metody dostarczania, która skutkuje stałą wydajnością transdukcji docelowych typów komórek przy jednoczesnej minimalizacji ubytku słuchu. W tym badaniu opisujemy dostęp do tylnego kanału półkolistego jako realną metodę dostarczania genów do ucha wewnętrznego u nowonarodzonych myszy. Pokazujemy, że dostarczenie genu przez tylny kanał półkolisty jest w stanie przeniknąć do całego ucha wewnętrznego. Łatwa anatomiczna identyfikacja tylnego kanału półkolistego, a także minimalna wymagana manipulacja kością skroniową, sprawiają, że to podejście chirurgiczne jest atrakcyjną opcją dla dostarczania genów do ucha wewnętrznego.
Wprowadzenie
Terapia genowa ucha wewnętrznego to szybko rozwijająca się dziedzina badań. Został zastosowany w różnych modelach zwierzęcych do zwalczania ototoksyczności, urazów spowodowanych hałasem i dziedzicznego ubytku słuchu1. Kilka ostatnich badań wykazało funkcjonalne przywrócenie funkcji słuchu i równowagi u zmutowanych myszy po dostarczeniu terapii genowej ucha wewnętrznego2,3,4,5,6,7. Jednym z kluczowych czynników decydujących o powodzeniu terapii genow....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Narodowym Instytucie Głuchoty i Innych Zaburzeń Komunikacyjnych (NIDCD ASP1378-15).
1. Przygotowanie i przygotowanie procedury
- Na początku eksperymentu wysterylizuj wszystkie narzędzia tlenkiem etylenu. Między zwierzętami wyczyść narzędzia za pomocą sterylizacji koralików.
- Załadować roztwór zawierający wirusową terapię genową do mikropipety na mikrowstrzykiwaczu. Wektorem wirusowym użytym w tym badaniu była AAV2/8-wiryna (1 x 1013 kopii genomu na mililitr, patrz tabela materiałów).
UWAGA: Zaz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wstrzyknięcie terapii genowej AAV8-whirlin do tylnego kanału półkolistego u noworodkowych myszy linii whirler doprowadziło do ekspresji whirliny (kolor zielony) w komórkach rzęsatych utricula (Rysunek 2), przy ogólnej wydajności infekcji wynoszącej 53,1% (SD 38,1, n = 28)5. Przetransdukowane komórki rzęsate posiadały wydłużone stereocilia (kolor czerwony) w porównaniu z komórkami rzęsatymi z przeciwległych, niepoddanych iniekcji uszu (.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisano kilka podejść chirurgicznych w celu uzyskania dostępu do uszu wewnętrznych gryzoni. Cochleostomia i dostęp z okrężnym okienkiem są najczęściej stosowane w celu uzyskania dostępu do ślimaka, podczas gdy tylny kanał półkolisty i worka endolimfatycznego są zwykle używane w celu uzyskania dostępu do narządów przedsionkowych1. W niedawnym badaniu wykazaliśmy, że iniekcje wirusowej terapii genowej do tylnego półkolistego kanału skutkowały wysoką skutecznością transdukcji komórek rzęsatych zarówn.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych istotnych informacji do przekazania.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez fundusze z NIDCD Division of Intramural Research /NIH (DC000082-02 dla W.W.C., a także DC000081 dla zaawansowanego rdzenia obrazowania). Jesteśmy wdzięczni pracownikom zakładu dla zwierząt NIDCD za opiekę nad naszymi zwierzętami.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikroskop operacyjny | Zeiss | OPMI Pico. Inne mikroskopy preparacyjne również by się sprawdziły. | |
| Mikro-forcepty | Fine Science Tools | 11251-10, 11295-51 | #5 i #55 Dumont |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Nanoliter2000 mikrowtryskiwacz | World Precision Instruments | ||
| Poduszka grzewcza | Mastex | Model 500/600 | |
| 5-0 vicryl szwy | Ethicon | ||
| AAV8-whirlin | Vector Biolabs | ||
| Pipeta szklana | Sutter Instruments | B100-75-10 | Szkło borokrzemianowe |
Bibliografia
- Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. Gene therapy for sensorineural hearing loss. Ear Hear. 36, 1-7 (2015).
- Askew, C., et al. Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice. Sci Transl Med. 7, 295(2015).
- Akil, O., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
