Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dostęp do tylnego kanału półkolistego do dostarczania genów do ucha wewnętrznego u nowonarodzonych myszy

10.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56648

⸱

2 marca 2018

 , 
1National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health, 2Department of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, Johns Hopkins School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

W tym badaniu opisujemy dostęp do tylnego kanału półkolistego jako niezawodną metodę dostarczania genów do ucha wewnętrznego u noworodków myszy. Pokazujemy, że dostarczenie genu przez tylny kanał półkolisty jest w stanie przeniknąć do całego ucha wewnętrznego.

Streszczenie

Terapia genowa ucha wewnętrznego jest bardzo obiecująca jako potencjalna metoda leczenia utraty słuchu i zawrotów głowy. Jednym z kluczowych czynników decydujących o powodzeniu terapii genowej ucha wewnętrznego jest znalezienie metody dostarczania, która skutkuje stałą wydajnością transdukcji docelowych typów komórek przy jednoczesnej minimalizacji ubytku słuchu. W tym badaniu opisujemy dostęp do tylnego kanału półkolistego jako realną metodę dostarczania genów do ucha wewnętrznego u nowonarodzonych myszy. Pokazujemy, że dostarczenie genu przez tylny kanał półkolisty jest w stanie przeniknąć do całego ucha wewnętrznego. Łatwa anatomiczna identyfikacja tylnego kanału półkolistego, a także minimalna wymagana manipulacja kością skroniową, sprawiają, że to podejście chirurgiczne jest atrakcyjną opcją dla dostarczania genów do ucha wewnętrznego.

Wprowadzenie

Terapia genowa ucha wewnętrznego to szybko rozwijająca się dziedzina badań. Został zastosowany w różnych modelach zwierzęcych do zwalczania ototoksyczności, urazów spowodowanych hałasem i dziedzicznego ubytku słuchu1. Kilka ostatnich badań wykazało funkcjonalne przywrócenie funkcji słuchu i równowagi u zmutowanych myszy po dostarczeniu terapii genowej ucha wewnętrznego2,3,4,5,6,7. Jednym z kluczowych czynników decydujących o powodzeniu terapii genowej ucha wewnętrznego jest podejście chirurgiczne stosowane w celu uzyskania dostępu do ucha wewnętrznego. Idealnie byłoby, gdyby podejście chirurgiczne było łatwe do wykonania, anatomiczne punkty orientacyjne byłyby spójne i łatwe do zidentyfikowania, a wynikająca z tego transdukcja docelowych typów komórek byłaby wysoka.

W niedawnym badaniu wykazaliśmy, że gdy wirusowa terapia genowa została wstrzyknięta przez tylny kanał półkolisty myszy z wirem (model utraty słuchu i dysfunkcji przedsionkowej), zaobserwowano efektywną transdukcję czuciowych komórek rzęsatych w narządach przedsionkowych, jak również w ślimaku5. Wysoka skuteczność sensorycznej transdukcji komórek rzęsatych skutkowała poprawą funkcji słuchowych i przedsionkowych u tych zmutowanych myszy.

W tym artykule szczegółowo opisujemy dostęp do tylnego kanału półkolistego w celu uzyskania dostępu do ucha wewnętrznego noworodka myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Narodowym Instytucie Głuchoty i Innych Zaburzeń Komunikacyjnych (NIDCD ASP1378-15).

1. Przygotowanie i przygotowanie procedury

  1. Na początku eksperymentu wysterylizuj wszystkie narzędzia tlenkiem etylenu. Między zwierzętami wyczyść narzędzia za pomocą sterylizacji koralików.
  2. Załadować roztwór zawierający wirusową terapię genową do mikropipety na mikrowstrzykiwaczu. Wektorem wirusowym użytym w tym badaniu była AAV2/8-wiryna (1 x 1013 kopii genomu na mililitr, patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Zazwyczaj do mikropipety wprowadza się 1,1 μl całkowitej objętości
    3. .

2. Znieczulenie

UWAGA: Szczep myszy użyty w tym badaniu to mysz wirująca. Wykorzystano zarówno homozygotyczne mutanty (Whrnwi/wi), jak i heterozygotyczne rodzeństwo z miotu (Whrn+/wi).

  1. Umieść matkę w osobnej klatce (oddzielnie od ściółki).
  2. Umieść klatkę domową zawierającą miot (szczenięta P0 - P5) na podkładce grzewczej z recyrkulacją ciepła (ustawionej na 37.5 °C), aby utrzymać myszy w cieple.
  3. Wytnij część kciuka rękawicy lateksowej i umieść w niej szczeniaka.
  4. Umieść szczeniaka w kciuku w rękawiczce lateksowej w wiadrze z lodem na ~2 min.
  5. Umieść znieczulone szczenię na dużym kwadratowym komercyjnym plastikowym opakowaniu do zamrażania z gazą 4 "x 4" między szczenięciem a powierzchnią opakowania.
  6. Napełnij wytrzymałą rękawicę lateksową kruszonym lodem i umieść rękawicę lodową wokół szczeniaka.
  7. Sprawdź, czy szczenię jest odpowiednio znieczulone całkowitym brakiem jakiejkolwiek reakcji na różne bodźce (w tym mocne uszczypnięcie palca u nogi). Pozostaw szczeniaka na okładzie z lodu na czas zabiegu (około 5 - 10 min).
    UWAGA: Zalecamy pozostawienie szczeniąt na okładzie z lodu nie dłużej niż 15 minut podczas zabiegu.

3. Podejście chirurgiczne (Rysunek 1)

  1. Oczyść skórę za uchem chusteczką jodową i chusteczką nasączoną alkoholem, gdy zwierzę jest znieczulone.
  2. Wykonaj nacięcie zauszne ~2 mm za uchem za pomocą mikronożyczek i podziel mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy za pomocą mikronożyczek.
  3. Zidentyfikuj nerw twarzowy i pęcherz. Bulla jest chrzęstna i półprzezroczysta w tym wieku i leży przyśrodkowo do nerwu twarzowego. W tym wieku tętnicę strzemiączkową można zobaczyć przez pęcherz, co jest przydatnym punktem orientacyjnym.
  4. Podążaj za nerwem twarzowym górnie i do tyłu, aby zlokalizować tylny kanał półkolisty (PSCC). Usuń włókna mięśniowe i tkankę miękką pokrywającą tylny kanał półkolisty za pomocą mikronożyczek.
    UWAGA: W tym wieku PSCC jest chrzęstny.
  5. Przeniknąć do PSCC za pomocą szklanej mikropipety (o średnicy ~10 μm) na mikrowtryskiwaczu.
  6. Wstrzyknąć wirusową terapię genową do ucha wewnętrznego.
    UWAGA: Zazwyczaj do tylnego kanału półkolistego w ciągu ~40 s (całkowita objętość ~1 μL) dostarcza się łącznie 20 wstrzyknięć po 49 nL terapii genowej. Zastosowane miano wirusa wynosiło 1 x 1013 kopii genomu na ml.
  7. Zamknij nacięcie skóry za pomocą szwu poliglaktynowego 5-0.

4. Opieka pooperacyjna

  1. Umieść szczeniaka na podkładce rozgrzewającej, aby przywrócić normalną temperaturę ciała podczas rekonwalescencji po znieczuleniu przy stałej ręcznej stymulacji/rolowaniu ludzkimi palcami w rękawiczkach.
  2. Gdy szczeniak się obudzi, umieść go z powrotem w klatce domowej.
  3. Pieszcz każdego szczeniaka bawełnianym wacikiem, który został wystawiony na działanie pościeli w klatce domowej.
    UWAGA: Celem tego jest, aby myszy pachniały tak, jak przed operacją, co zwiększa prawdopodobieństwo, że matka ponownie zaakceptuje swój miot po operacji. Jeśli to możliwe, mocz matki można zebrać i wcierać w szczenięta za pomocą bawełnianego wacika, aby jeszcze bardziej zmniejszyć prawdopodobieństwo odrzucenia.
  4. Nałóż olej mineralny na nos matki, aby ją znieczulić8 i ponownie wprowadź matkę do klatki domowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wstrzyknięcie terapii genowej AAV8-whirlin do tylnego kanału półkolistego u noworodkowych myszy linii whirler doprowadziło do ekspresji whirliny (kolor zielony) w komórkach rzęsatych utricula (Rysunek 2), przy ogólnej wydajności infekcji wynoszącej 53,1% (SD 38,1, n = 28)5. Przetransdukowane komórki rzęsate posiadały wydłużone stereocilia (kolor czerwony) w porównaniu z komórkami rzęsatymi z przeciwległych, niepoddanych iniekcji uszu (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisano kilka podejść chirurgicznych w celu uzyskania dostępu do uszu wewnętrznych gryzoni. Cochleostomia i dostęp z okrężnym okienkiem są najczęściej stosowane w celu uzyskania dostępu do ślimaka, podczas gdy tylny kanał półkolisty i worka endolimfatycznego są zwykle używane w celu uzyskania dostępu do narządów przedsionkowych1. W niedawnym badaniu wykazaliśmy, że iniekcje wirusowej terapii genowej do tylnego półkolistego kanału skutkowały wysoką skutecznością transdukcji komórek rzęsatych zarówn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych istotnych informacji do przekazania.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusze z NIDCD Division of Intramural Research /NIH (DC000082-02 dla W.W.C., a także DC000081 dla zaawansowanego rdzenia obrazowania). Jesteśmy wdzięczni pracownikom zakładu dla zwierząt NIDCD za opiekę nad naszymi zwierzętami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop operacyjnyZeissOPMI Pico. Inne mikroskopy preparacyjne również by się sprawdziły.
Mikro-forceptyFine Science Tools11251-10, 11295-51#5 i #55 Dumont
Micro-scissorsFine Science Tools15002-08
Nanoliter2000 mikrowtryskiwaczWorld Precision Instruments
Poduszka grzewczaMastexModel 500/600
5-0 vicryl szwyEthicon
AAV8-whirlinVector Biolabs
Pipeta szklanaSutter InstrumentsB100-75-10Szkło borokrzemianowe
Mikroskop laryngologiczny

Bibliografia

  1. Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. Gene therapy for sensorineural hearing loss. Ear Hear. 36, 1-7 (2015).
  2. Askew, C., et al. Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice. Sci Transl Med. 7, 295(2015).
  3. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75, 283-293 (2012).
  4. Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).
  5. Isgrig, K., et al. Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25, 780-791 (2017).
  6. Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19, 345-350 (2013).
  7. Shibata, S. B., et al. RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss. Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).
  8. Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research. Contemp Top Lab Anim. 43, 48(2004).
  9. Chien, W. W., et al. Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice. Mol Ther. 24, 17-25 (2016).
  10. Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph. J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).
  11. Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).
  12. Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Chirurgia noworodków myszywstrzykiwanie AAV28-whirlinwstrzykiwanie za pomocą mikropipetyidentyfikacja nerwu twarzowegotransdukcja komórek rzęsatychwydłużanie stereociliówtesty słuchowe i błędnikowemanipulacje kością skroniową
Dostęp do tylnego kanału półkolistego do dostarczania genów do ucha wewnętrznego u nowonarodzonych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.