Ustanowienie zewnątrzkomórkowego systemu hodowli kwaśnego pH

Podsumowanie

Mikrośrodowisko kwaśnego guza odgrywa kluczową rolę w jego postępie. Aby ocenić wpływ kwaśnego zewnątrzkomórkowego pH na komórki nowotworowe in vitro, stworzyliśmy proste systemy hodowli kwasowych.

Streszczenie

Warunki mikrośrodowiska guza, takie jak niedotlenienie lub głód składników odżywczych, odgrywają kluczową rolę w progresji raka i złośliwości. Jednak rola kwaśnego zewnątrzkomórkowego pH w agresywności guza i jego mechanizmie leżącym u podstaw nie została szeroko zbadana w porównaniu z warunkami niedotlenienia lub niedoboru składników odżywczych. Ponadto dobrze zdefiniowana metoda hodowli w celu naśladowania kwaśnego mikrośrodowiska guza zewnątrzkomórkowego nie została w pełni opisana.

Tutaj prezentujemy prostą metodę hodowli in vitro do utrzymania kwaśnego zewnątrzkomórkowego pH przy użyciu zredukowanego wodorowęglanu i zwiększonych stężeń mleczanu lub HCl w pożywce hodowlanej. pH pożywki utrzymywało się przez co najmniej 24 godziny i stopniowo spadało przez 72 godziny po hodowli komórek raka trzustki PANC-1 i AsPC-1. Trzy różne kwaśne warunki środowiskowe w tym badaniu wysoce regulowane geny reagujące na pH, takie jak MSMO1, INSIG1 i IDI1, w porównaniu z niedotlenieniem lub głodem składników odżywczych. Regulacja w górę tych genów może być wykorzystana jako marker kwaśnego pH. Te proste techniki są korzystne w wyjaśnianiu mechanizmów leżących u podstaw nowotworu złośliwego w kwaśnym mikrośrodowisku guza. Dlatego nasz zewnątrzkomórkowy system hodowli kwaśnego pH umożliwia odkrycie komórkowych kwaśnych odpowiedzi pH nie tylko w komórkach nowotworowych, ale także w komórkach pierwotnych, takich jak komórki kanalików nerkowych, w odniesieniu do innych zaburzeń kwaśnych, w tym cukrzycowej kwasicy ketonowej, kwasicy mleczanowej, kwasicy kanalików nerkowych i kwasicy oddechowej.

Wprowadzenie

Mikrośrodowisko guza odgrywa kluczową rolę w progresji guza i metabolizmie komórek rakowych^1,2,3. Komórki rakowe są często narażone na stany takie jak niedotlenienie, niedobór składników odżywczych i kwaśne zewnątrzkomórkowe pH (pHe). Jednak rola pHe w progresji guza nie została wyjaśniona tak obszernie, jak w przypadku niedotlenienia lub głodu składników odżywczych. pHe w tkance nowotworowej może stać się kwaśny, osiągając około pH 6,8^4,5. Kwaśne pH powstaje w wyniku tlenowego i beztlenowego glikolitycznego wydalania protonów (H⁺) i mleczanu przez proliferację komórek rakowych^5,6.

Ostatnie badania wykazały, że deacetylacja histonów wywołana kwasem pHe, utlenianie kwasów tłuszczowych i egzocytoza kwaśnych lizosomów umożliwiają adaptację do silnie kwaśnego środowiska^7,8,9,10. Jednak mechanizmy, poprzez które zakwaszenie zewnątrzkomórkowe wpływa na zachowanie nowotworu i tożsamość kluczowych regulatorów w mikrośrodowisku guza o kwaśnym pH, nie zostały w pełni określone. Ponadto w kilku raportach opisano różne kwaśne podłoża o pH przy użyciu niejasnych stężeń wodorowęglanu, Tris, PIPES i buforu HEPES lub mleczanu i HCl, ale istnieje niewiele doniesień wykazujących stabilność dostosowanej pożywki ani kompleksowego porównania kilku różnych kwaśnych pożywek hodowlanych7^,8,9,10

Aby wyjaśnić kluczowe regulatory i zmiany metaboliczne w komórkach nowotworowych w kontekście zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, stworzyliśmy prosty model hodowli in vitro w celu utrzymania kwaśnego pH i zbadaliśmy rolę pHe w komórkach rakowych¹¹. Stosując tę metodę, utrzymywaliśmy kwaśną pożywkę hodowlaną o pHe wynoszącym 6,8 w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO_{2 ,} stosując zmniejszone stężenia wodorowęglanów w pożywce. Jako pożywkę normalną i kontrolną użyto pH 7,4. pH pożywki utrzymywało się przez co najmniej 24 godziny i stopniowo spadało o 72 godziny podczas hodowli komórek raka trzustki PANC-1 i AsPC-1. Ponieważ zwiększona glikoliza przyspiesza wydalanie nie tylko protonów, ale także mleczanu^7,8,9, opracowaliśmy również metodę hodowli naśladującą kwasicę wywołaną mleczanem poprzez dodanie mleczanu, a nie zmniejszenie stężenia wodorowęglanów. Dodatkowo, indukowane przez HCl kwaśne pHe w pożywce pozwala nam wykluczyć możliwość, że reakcje komórkowe na kwaśną pożywkę hodowlaną pH nie są spowodowane zmniejszonym stężeniem wodorowęglanów. Ponadto, używając różnych pożywek o pH od 6,4 do 7,4 o różnym stężeniu wodorowęglanów, możemy ocenić zakres wpływu pHe na odpowiedzi komórkowe.

Protokół

1. Przygotowanie kwaśnego podłoża hodowlanego

1. Przygotowanie pożywki kontrolnej (pH 7,4) i niskopH (pH 6,8)
   1. Rozpuść 4,75 g proszku DMEM bez L-glutaminy w 500 ml wody.
   2. Przygotować 0,33 M roztwór_NaHCO3 w szczelnej butelce.
      Ostrzeżenie: Ważne jest, aby używać butelki szczelnej, ponieważ NaHCO₃ emituje gaz CO₂ po podgrzaniu i rozkładzie termicznym.
   3. Autoklaw pożywki i roztworu. Pozostawić te do ostygnięcia do temperatury 25 °C.
   4. Dodaj 5 ml 200 ml 200 ml L-glutaminy, 5 ml penicyliny-streptomycyny i 50 ml płodowej surowicy bydlęcej do 500 ml DMEM bez wodorowęglanu.
   5. Dla pożywki kontrolnej (pH 7,4) dodać 2,4 ml 0,33 M roztworu NaHCO₃ na 100 ml DMEM bez wodorowęglanu. W przypadku podłoża o niskim pH (pH 6,8) dodać 0,6 ml 0,33 M roztworu NaHCO₃ na 100 ml DMEM bez wodorowęglanu.
   6. Sprawdzić pH podłoża po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO₂,
      UWAGA: Ilość roztworu NaHCO₃ należy dostosować w zależności od pH podłoża, które może się różnić w zależności od zawartości CO₂ w inkubatorze i ciśnienia powietrza. Idealnie, po raz pierwszy, lepiej jest zmierzyć pH podłoża z różnymi stężeniami wodorowęglanów, aby określić odpowiednią ilość roztworu NaHCO₃ do dodania do DMEM.
      1. Natychmiast po wyjęciu szalki hodowlanej z inkubatora CO₂ należy zebrać pożywkę hodowlaną i zmierzyć pH za pomocą pH-metru. W razie potrzeby należy utrzymać temperaturę medium na poziomie 37 °C, korzystając z łaźni wodnej. Zmierz pH podłoża trzy razy niezależnie.
         UWAGA: Roztwór NaHCO₃ należy przechowywać w temperaturze 4 °C, a każde podłoże powinno być świeżo przygotowane. Dostępne na rynku produkty, które można wykorzystać w tym badaniu, są wymienione w Tabeli Materiałów.
2. Przygotowanie kwaśnej pożywki hodowlanej indukowanej mleczanem lub HCl
   1. Dodać 74 μl roztworu mleczanu lub 125 μl 1 M HCl do 100 ml pożywki kontrolnej (przygotowanej w kroku 1.1.5).
   2. Sprawdzić pH podłoża po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO₂,
      UWAGA: Ilość roztworu mleczanu lub HCl należy również dostosować do pH medium, które może się różnić w zależności od zawartości CO₂ w inkubatorze i ciśnienia powietrza. Idealnie jest zmierzyć pH podłoża za pomocą seryjnych stężeń mleczanu lub HCl, aby określić odpowiednią ilość do dostosowania do pożądanego pH pożywki.

2. Pobieranie i obróbka komórek

1. Hodowlę komórek w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO₂ należy rozpocząć co najmniej 1 tydzień przed wykonaniem eksperymentów.
   UWAGA: Linie komórkowe użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli materiałów.
2. Komórki pasażowe, gdy osiągną 70 - 90% konfluencji. Nie pozwól, aby komórki się zrosły. Zmieniaj podłoże co 2 - 3 dni podczas codziennej uprawy.
3. Umyj komórki, dodając 5 ml PBS. Odessać PBS i dodać enzym odłączający, taki jak 1 ml trypsyny.
4. Inkubować w temperaturze 37 °C, aż komórki się zaokrąglą i zaczną się odłączać.
5. Dodać 5 ml pożywki hodowlanej do oderwanych komórek i dezaktywować enzym. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 3 minuty przy 300 x g. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą pożywki hodowlanej.
6. Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru i trypanu-błękitu.
7. Wysiew 5,0 x 10⁵ komórek/studzienkę 10-centymetrowego naczynia w 10 ml pożywki. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO_{2 .}
8. Odessać pożywkę hodowlaną, przemyć komórki 5 ml PBS i dodać 10 ml kwaśnej pożywki przygotowanej w sekcji 1. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO_{2 .}

3. Izolacja RNA

1. Odessać pożywkę hodowlaną i przemyć komórki 5 ml PBS. Rozbić komórki, dodając odczynnik do ekstrakcji RNA (patrz Tabele materiałów).
2. Krótko zeskrobać naczynie, a następnie usunąć odczynnik do ekstrakcji RNA za pomocą pipety i umieścić odczynnik do ekstrakcji RNA/lizat komórkowy w probówce o pojemności 1,5 ml. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 5 minut.
3. Dodać 250 μl chloroformu i energicznie wstrząsać probówką przez około 15 s. Pozostawić w temperaturze pokojowej na 5 minut i odwirować przy ≥8 000 x g przez 5 minut.
4. Ostrożnie usuń fazę wodną za pomocą pipety. Pozostaw część fazy wodnej. Umieść w kolejnej probówce o pojemności 1,5 ml.
5. Do fazy wodnej dodać 550 μl izopropanolu i delikatnie wymieszać. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 5 minut. Wirować z maksymalną prędkością (≥20 000 x g) przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
6. Odlej izopropanol i dodaj 1 ml 75% etanolu do uzdatnionej wody DEPC. Delikatnie wymieszaj. Wirować przy 8 000 x g przez 5 min.
7. Odpipetować od etanolu i pozostawić granulki do wyschnięcia na powietrzu.
8. Dodaj około 15 - 25 μL (w zależności od wydajności) uzdatnionej wody DEPC do granulki RNA. Dokładnie wymieszaj.
9. Zmierzyć stężenie wyizolowanego RNA, mierząc OD przy 260 nm za pomocą spektrofotometru.

4. Synteza cDNA

1. Połącz następujące składniki w probówce reakcyjnej PCR: do 5 μg całkowitego RNA, 1 μl Oligo dT (50 μM) lub Random Primer Mix (60 μM), 1 μl 10 mM dNTP i woda wolna od nukleaz do całkowitej objętości 14 μL.
2. Wymieszaj i krótko odwiruj składniki za pomocą małej wirówki stołowej (~5 s). Denaturację RNA/startera próbki przez 5 minut w temperaturze 65 °C. Odwirować krótko (~5 s) za pomocą małej wirówki stołowej i niezwłocznie umieścić próbkę na lodzie na co najmniej 1 minutę.
3. Dodaj następujące składniki: 4 μL 5x bufor odwrotnej transkrypcji, 1 μL odwrotnej transkryptazy (200 U/μL), 1 μL inhibitora RNazy (40 U/μL).
   UWAGA: Przykłady dostępnych na rynku zestawów przedstawiono w Tabeli Materiałów
4. Zakryj probówkę, wymieszaj, a następnie krótko odwiruj zawartość za pomocą małej wirówki stołowej (~5 s). Inkubować połączoną mieszaninę reakcyjną w temperaturze 50-55 °C przez 10 minut.
5. Dezaktywować reakcję przez inkubację w temperaturze 80 °C przez 10 minut.

5. Pomiar ekspresji genów reagujących na kwas za pomocą PCR w czasie rzeczywistym

1. Połącz następujące składniki na 384-dołkowej płytce reakcyjnej: 1 μl matrycy cDNA, 0,75 μl 10X N',N'-dimetylo-N-[4-[(E)-(3-metylo-1,3-benzotiazol-2-yliden)metylo]-1-fenylochinolino-1-ium-2-ylo]-N-propylopropano-1,3-diamina, 0,3 μL 50 μM startera do przodu, 0,3 μL 50 μM startera odwrotnego, 1 μL polimerazy Taq, 2,5 μL 10x bufor polimerazy Taq, 2,5 μL 20 mM dNTP, 16,65 μL wody.
   UWAGA: Example dostępnych na rynku zestawów przedstawiono w Tabeli materiałów. Wykaz starterów przedstawiono w Tabeli 1. Na tym etapie można również użyć 96-dołkowej płytki reakcyjnej. Można również użyć innych sond (np. sondy Taqman).
2. Ustaw eksperyment i następujący program PCR w systemie PCR w czasie rzeczywistym: 50 °C przez 2 minuty, 1 cykl; 95 °C przez 10 minut, 1 cykl; 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 minutę, 40 cykli; 95 °C przez 15 s, 1 cykl; 60 °C przez 15 s, 1 cykl; 95 °C przez 15 s, 1 cykl.
3. Umieścić płytkę w aparacie qPCR. Uruchom program.
   UWAGA: Regulację w górę genów reagujących na pH MSMO1, INSIG1 i IDI1 można zmierzyć za pomocą poziomów białka.

Wyniki

Aby określić odpowiednie stężenie wodorowęglanów, przygotowano DMEM w zakresie 0 - 8 mM NaHCO₃ (stężenie końcowe w pożywce hodowlanej), uzyskując pożywki o pH w przedziale 6,4 - 7,4 (Rysunek 1). Jako pożywkę kontrolną przygotowano DMEM z 8 mM NaHCO₃ (pH 7,4), natomiast jako pożywkę o pH kwasowym zastosowano 2 mM NaHCO₃ (pH 6,8), zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami wskazującymi, że pH zewnątrzkomórkowe w przypadku guzów lity...

Dyskusja

W tym miejscu opisaliśmy prosty system kultur o kwaśnym pH i proces jego oceny. Połączenie trzech metod średniego zakwaszenia, tj. obniżonego stężenia wodorowęglanów, dodatku mleczanu i dodatku HCl, umożliwiło nam dokładne zbadanie mechanizmu pH-odpowiedź i porównanie odpowiedzi komórkowej na inne warunki mikrośrodowiskowe guza, takie jak niedotlenienie lub głód składników odżywczych.

Kluczem tej metody jest określenie odpowiednich stężeń wodorowęglanów, mleczanów i HCl w pożywce hodo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Reagents
Dulbecco's Modified Eagle Medium" Nissui" 2	Nissui	05919
Surowica bydlęca	płodu Thermo Fisher	10438
NaHCO3	Wako	191-01305
Roztwór L-glutaminy	Thermo Fisher	25030-081
Roztwór mieszany penicyliny i streptomycyny (stabilizowany)	Nacalai	09367-34
0,5 g / l-trypsyna / 0,53 mmol / l-EDTA z czerwienią fenolową	Nacalai	32778-05
0,5%-trypanowy roztwór niebieskiej plamy	Nacalai	29853-34
Roztwór kwasu mlekowego	Sigma-Aldrich	252476
Roztwór kwasu solnego	Sigma-Aldrich	H9892
RNeasy Plus Mini Kit	QIAGEN	74134
SuperScript IV System syntezy pierwszej nici	Thermo Fisher	18091
Power SYBR Zielony PCR Master Mix	Biosystemy stosowane	4368702
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Linie komórkowe
PANC-1	ATCC	CRL-1469
AsPC-1	ATCC	CRL-1682
KMS-6	JCRB Cell Bank
			komórek TIG JCRB
MRC9	ATCC	CCL-212
HUVEC	ATCC	CRL-1730
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
>Equipment
NanoDrop One spektrofotometr UV-Vis o mikroobjętości z Wi-Fi	Thermo Fisher	ND-ONE-W
QuantStudio 5 System PCR w czasie rzeczywistym	Thermo Fisher	CRL-1682

JCRB0432 Bank