Inkraplanie przezcewkowe jest trudną procedurą i nie zostało dobrze opisane w literaturze. Celem pracy jest opisanie techniki przezcewkowego wprowadzania cewnika do dopęcherzowego podawania płynów z substancjami czynnymi do pęcherza moczowego i/lub prostaty u dorosłych samców myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Procedura wkraplania przezcewkowego u dorosłego samca myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wewnątrzcewkowe wkraplanie może być wykorzystane do dostarczania różnych roztworów z aktywnymi składnikami (np. lekami, chemikaliami, bakteriami i wirusami) lokalnie do pęcherza moczowego, aby albo wywołać zwierzęce modele patologii pęcherza, albo ocenić skuteczność leczenia dopęcherzowego. Większość modeli gryzoni patologii dolnych dróg moczowych (LUT) jest indukowana u samic myszy ze względu na łatwość dopęcherzowego wkraplania substancji przez cewkę moczową samicy. Jednak ze względu na różnice anatomiczne między żeńskim i męskim LUT, wkraplanie przezcewkowe u samca myszy zostało uznane za bardzo trudną procedurę i nie zostało wcześniej opisane. W tym manuskrypcie przedstawiamy szczegółowy opis, w jaki sposób przygotować rurkę polietylenową (PE) do późniejszego wprowadzenia do cewki moczowej samca myszy. Ponadto omawiamy idealne rodzaje rurek PE, które należy stosować w zależności od pożądanego miejsca inokulacji. Ponadto opisujemy punkt po punkcie, jak przygotować zwierzę do udanego wkraplania przezcewkowego, aby uniknąć uszkodzenia cewki moczowej i zapewnić dostarczenie roztworu w pożądane miejsce. Zabieg rozpoczyna się od cofnięcia napletka i żołędzi w celu odsłonięcia ujścia ujścia cewki moczowej. Następnie żołądź jest chwytana tępymi, nie miażdżącymi kleszczami, aby ustabilizować penisa i rurkę PE. Rurkę PE najpierw wprowadza się do ujścia cewki moczowej równolegle do ciała zwierzęcia, a następnie jej kąt jest regulowany poprzez przechylenie cewnika, aby manewrować nim tak, aby podążał za naturalną krzywizną cewki moczowej. Technika ta może być stosowana do indukowania mysich modeli patologii pęcherza moczowego i/lub oceny skuteczności leczenia dopęcherzowego u samców myszy.
Wprowadzenie
Metoda wkraplania przezcewkowego była stosowana w poprzednich badaniach jako jedna z metod tworzenia modeli patologii pęcherza moczowego u gryzoni1,2,3,4 i może być użyte do oceny skuteczności miejscowo podawanych zabiegów u myszy. Chociaż modele zwierzęce nie mogą w pełni podsumować ludzkich patologii, identyfikacja mechanizmów leżących u podstaw w badaniach na zwierzętach zapewnia lepsze zrozumienie ludzkich zaburzeń LUT, takich jak śródmiąższowe zapalenie pęcherza moczowego/zespół bólu pęcherza moczowego, neurogenne zapalenie pęcherza moczowego, autoimmunologiczne zapalenie pęcherza moczowego i zapalenie gruczołu krokowego5.
Procedura wkraplania przezcewkowego przeprowadzona na dorosłej myszy płci męskiej jest technicznie trudniejsza niż inkraplanie dopęcherzowe u dorosłej samicy myszy6. Naturalnie zakrzywiona anatomia męskiej cewki moczowej wraz z jej małą średnicą sprawiają, że technicznie trudno jest wykonać przezcewkowe wprowadzenie cewnika. Dlatego szczegółowe instrukcje dotyczące przezcewkowej indukcji infekcji dróg moczowych myszy 6 i zapalenie LUT7,8,9,10,11,12,13,14,15 Za pomocą cewnika wprowadzanego do pęcherza moczowego zostały wcześniej opisane tylko dla samic myszy. Niniejszy manuskrypt ma na celu przedstawienie szczegółowego opisu techniki przezcewkowego wkraplania substancji samcom myszy, w tym klipów wideo, obrazów i ilustracji. Procedury wkraplania przezcewkowego u dorosłego samca myszy mogą być wykonywane przy użyciu zmiennych inokulantów podobnych do tych wcześniej opisanych w samicy mouse7 i połączone z dodatkowymi technikami, takimi jak zapisy elektromiogramu reakcji trzewnomotorycznych (VMR)16.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury na zwierzętach, w tym sposób i czas trwania znieczulenia, a także opieka pooperacyjna, zostały omówione z weterynarzem i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w powiązanej instytucji. W tym manuskrypcie wszystkie procedury zostały przeprowadzone na samcach myszy C57BL/6 w wieku od 8 do 15 tygodni, a protokół jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami zatwierdzonymi przez IACUC na Uniwersytecie Kolorado.
1. Przygotowanie wężyków
UWAGA: Aby zaszczepić inokulum, można użyć igły przymocowanej do rurki polietylenowej (PE) (Rysunek 1A) lub małego (<24 G) angiocewnika (Rysunek 1G). Stosowanie angiocewnika nie wymaga żadnego przygotowania poza sterylizacją 70% etanolem (EtOH). Inokulum to substancja, która jest wkraplana/wstrzykiwana/deponowana w drogach moczowych. Może to być roztwór zawierający bakterie, wirusy lub chemikalia. Jest to przygotowywane z wyprzedzeniem i zgodnie z protokołem badawczym. Na przykład, jeśli badanie ma na celu ocenę wpływu zakażenia E. coli na dolne drogi moczowe, badacz będzie musiał przygotować inokulum zawierające bakterie, które można zaszczepić/zaszczepić w dolnych drogach moczowych.
- Przygotowanie igły przymocowanej do rurki PE jest proste i składa się z następujących elementów: Wybierz rozmiar rurki PE w zależności od narządu docelowego i wieku zwierzęcia. W przypadku zwierzęcia w wieku poniżej 12 tygodni należy użyć rurki PE-10 (średnica zewnętrzna wynosi 0.024 cala, a średnica wewnętrzna 0.011 cala). Sugeruje się, że rurki PE-10 mogą być stosowane do (1) pierwotnego wysiewu inokulum w przedniej części prostaty (AP) i pęcherzyków nasiennych (SV) lub (2) pierwotnego wysiewu inokulum w pęcherzu moczowym zwierzęcia w wieku poniżej 12 tygodni. Rurki PE o większej średnicy do rozmiaru PE 50 (średnica zewnętrzna do 0,038 cala i średnica wewnętrzna do 0,023 cala) mogą być używane do pierwotnego wysiewu inokulum w pęcherzu moczowym starszych zwierząt.
- Wytnij około 2.5 cala rurki PE.
- Wybierz igłę, która będzie pasować do wybranej średnicy PE, która ma być użyta. Igła 27 G może zmieścić się w świetle rurki PE-10, a igła 22 G pasuje do światła rurki PE-50.
- Przygotuj igłę przed włożeniem do rurki PE, pocierając ostrą krawędzią igły o dostępny na rynku kamień olejowy (Rysunek 1A-B), aby ją stępić, lub użyj dostępnej w handlu igły.
- Wprowadź igłę (Rysunek 1C) do światła rurki PE. Unikaj uszkodzenia światła lub wejścia do fałszywego światła, upewniając się, że igła pozostaje w środku światła. (Rysunek 1D-E). Jeśli rurka PE zostanie uszkodzona podczas wprowadzania igły, odetnij uszkodzony koniec i ponownie rozpocznij proces.
- Umieść rurkę PE przymocowaną do igły w 70% EtOH w celu sterylizacji do czasu jej użycia do zabiegu. Przepłukać 70% EtOH przez rurkę PE igłową, aby wysterylizować światło i upewnić się, że nie ma wycieku z rurki PE z powodu uszkodzenia podczas procesu wprowadzania igły. W przypadku wycieku należy wyrzucić rurkę PE z igłą.
UWAGA: Końcówka rurki PE musi być gładka przed cewnikowaniem. Aby uniknąć problemów z wprowadzaniem rurki PE do cewki moczowej, zaleca się przecięcie końcówki rurki PE bezpośrednio przed cewnikowaniem (Rysunek 1F). Sugerowana minimalna długość rurki PE to 1,5 cala, która obejmuje część otaczającą igłę.
2. Procedura cewnikowania
- Przed indukcją znieczulenia opróżnij pęcherz myszy.
- Delikatnie uciskaj i masuj dolną część brzucha myszy. Manewry te zazwyczaj prowadzą do spontanicznego oddawania moczu. Pełny pęcherz moczowy może spowodować rozcieńczenie lub natychmiastowy wyciek wkroplonego inokulum.
UWAGA: Dodatkową opcją mającą na celu zapewnienie pustego pęcherza moczowego u myszy jest pozbawienie zwierzęcia wody na co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem procedury wkraplania przezcewkowego. Pozbawienie wody powinno zostać zatwierdzone przez instytucję w ramach protokołu dotyczącego zwierząt.
- Delikatnie uciskaj i masuj dolną część brzucha myszy. Manewry te zazwyczaj prowadzą do spontanicznego oddawania moczu. Pełny pęcherz moczowy może spowodować rozcieńczenie lub natychmiastowy wyciek wkroplonego inokulum.
- Użyj aparatu anestezjologicznego z przepływem izofluranu (2%) w celu wywołania znieczulenia.
- Gdy zwierzę zostanie znieczulone, połóż je na ciepłym kocu grzewczym i przykryj niebieską podkładką z nosem wewnątrz stożka w celu utrzymania ciągłego znieczulenia.
- Upewnij się, że zwierzę jest pod narkozą, sprawdzając odruch pedałowania (szczypanie palców).
- Gdy odruch pedałowania jest nieobecny, kontynuuj, chowając napletek.
- Naciśnij okolicę łonową zarówno kciukiem, jak i palcem wskazującym jednej ręki (Ryc. 2A i 2B), a następnie wyciągnij gruczoły prącia za pomocą kciuka i palca wskazującego drugiej ręki (Rysunek 2C). Gdy zostanie to wykonane prawidłowo, napletek, żołądź prącia i ciało prącia pozostają odsłonięte. (Rysunek 2D i Rysunek 2F). Nie używaj kleszczy do wyciągania gruczołów prącia, ponieważ spowoduje to uszkodzenie tkanki.
- Przed wprowadzeniem cewnika nasmaruj końcówkę cewnika i żołądź sterylnym smarem chirurgicznym. Ułatwi to wkładanie rurki PE.
UWAGA: Do każdego użycia zaleca się pakowane pojedynczo kwadraty lubrykantu chirurgicznego zamiast jednej dużej tubki w celu utrzymania sterylnych warunków. - Delikatnie przytrzymaj czubek penisa za pomocą tępych kleszczy i delikatnie ściśnij żołądź, aby spowodować otwarcie ujścia cewki moczowej.
- Trzymać strzykawkę z rurką PE przymocowaną do igły lub samą rurką PE i wprowadzić rurkę PE przez ujście cewki moczowej.
UWAGA: W celu zapewnienia stabilności zaleca się trzymanie strzykawki na statywie z rurką PE przymocowaną do igły lub samą rurkę PE za pomocą palca kciuka, palca wskazującego i środkowego.
UWAGA: Ścieżka cewnikowania powinna być zakrzywiona ze względu na naturalną krzywiznę cewki moczowej otoczonej żołędzią prącia i ciałem prącia u dorosłego samca myszy, jak pokazano na Rysunek 3A i Rysunek 3B. Cewnikowany przewód PE może napotkać opór podczas cewnikowania, dlatego zaleca się regulację kąta poprzez przechylenie rurki w górę lub w dół, aby pomóc przesunąć rurkę PE dalej do narządu docelowego. W razie potrzeby rurkę PE można lekko obrócić, aby pomóc jej manewrować przez różne ostre zakręty cewki moczowej. Gdy opór jest zbyt duży, rurkę należy odciągnąć do tyłu, a następnie ponownie przesunąć z minimalnym naciskiem. Pomocne może być całkowite wyciągnięcie rurki PE i użycie większego smarowania. - Wykonaj wkraplanie inokulum, gdy rurka PE dotrze do pożądanego narządu, naciskając tłok igły, aby wkroplić żądaną objętość inokulum (sugerowana jest objętość 5-200 μl).
- W celu wkroplenia inokulum do pęcherza moczowego, przesuwaj rurkę PE, aż zostanie włożone około 0,75 cala rurki PE (Rysunek 3A).
UWAGA: W przypadku wkraplania inokulum do AP i SV, na ogół wprowadzona rurka napotyka opór, gdy osiągnie punkt otwarcia do przedniej części prostaty. Regulując kąt poprzez przechylenie rurki w górę lub w dół, rurka PE będzie przesuwać się dalej, aż zostanie włożony około 1 cal rurki PE (Rysunek 3B).
- W celu wkroplenia inokulum do pęcherza moczowego, przesuwaj rurkę PE, aż zostanie włożone około 0,75 cala rurki PE (Rysunek 3A).
3. Obrazowanie in vivo dolnych dróg moczowych i nerek
UWAGA: Celem obrazowania in vivo w tym manuskrypcie jest: (1) potwierdzenie lokalizacji przestrzennej inokulum; oraz (2) ocena częstości występowania refluksu inokulum do nerek. W tym celu można użyć znieczulonej lub uśpionej myszy.
- Aby uwidocznić dolne drogi moczowe dorosłego samca myszy, wykonaj laparotomię dolnej linii środkowej brzucha, aby odsłonić pęcherz moczowy, prostatę i pęcherzyki nasienne.
- Naciąć skórę w linii środkowej od kości łonowej do tuż poniżej wyrostka mieczykowatego za pomocą nożyczek.
- Podnieś skórę z tkanki podskórnej.
- Zidentyfikuj jałową linię białą znajdującą się w linii środkowej i naciąć ją, aby wejść do jamy otrzewnej, w której znajdują się wszystkie narządy.
- Potwierdź lokalizację przestrzenną poprzez wizualizację niebieskiego barwnika lub innego odpowiedniego czynnika śledzącego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przezkanałowa instylacja barwnika niebieskiego za pomocą rurki PE 50 doprowadziła do wprowadzenia barwnika do pęcherza moczowego (Rysunek 4A), natomiast za pomocą rurki PE 10 do zabarwienia pęcherzyków nasiennych (SV) i prostaty akcesoryjnej (AP) (Rysunek 4B). Aby ocenić, czy przeprowadzona instylacja przezkanałowa powoduje natychmiastowy refluks inokulatu do nerek, obserwowano nerki i moczowody po instylacji 100 µL barwnika nieb...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Manuskrypt ten szczegółowo opisuje metodę wkraplania przezcewkowego u dorosłego samca myszy. Zróżnicowany obszar siewu pierwotnego można osiągnąć za pomocą rur PE o różnych średnicach. PE-50 jest zalecany do skutecznego dotarcia do światła pęcherza moczowego, podczas gdy PE-10 o większej średnicy służy do dotarcia do AP i SV (ryc. 3A-B). Oprócz wyboru rozmiaru rurki PE i narządu docelowego do inokulacji, inne czynniki, takie jak objętość wkroplonego inokulum, również odgrywa...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy nie mają żadnych podziękowań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| BD INTRAMEDIC Rurka polietylenowa / PE 10 | BD Medical | 63019-004 | |
| BD INTRAMEDIC Rurka polietylenowa / PE 50 | BD Medical | 63019-048 | |
| BD Insyte-N Autoguard / Angiocath | BD Medical | 311411 | |
| Etanol (EtOH) | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Tylko igła BD o rozmiarze 22 (g) 1 cal | Becton Dickson | ||
| Tylko igła BD Rozmiar 27 (G) 1/2 cala | Becton Dickson | 305129 | |
| Luer króciec, 22 G X 0,5 cala / igła | Instech | LS22 | |
| Luer króciec, 27 G X 0,5 cala / igła | Instech | LS27 | |
| 6 "długości x 2" szerokości x 1" grubości, kamień do ostrzenia z tlenku glinu / kamień olejowy | Norton | 40204034 | |
| Smar chirurgiczny Sterylny bakteriostatyczny Folilpac | Surgilube | 281020543 | |
| Isoflurane | Fluriso | 13985-528-60 | |
| System anestezjologiczny SomnoSuite Szczypce | Kent Scientific | SS-01 | |
| , zakrzywione | vwr | 82027-392 | |
| BD 1 ml Strzykawka | BD Medical | 309626 | |
| India Roztwór atramentu., 0,2% w buforze PBS | Alfa Aesar | J61007 | |
| 8 ~ 12 tygodni samiec C57B/6 Myszy | Jackson Lab | #000664 |
Bibliografia
- Lee, S., Yang, G., Bushman, W. Prostatic inflammation induces urinary frequency in adult mice. PLoS One. 10 (2), e0116827(2015).
- Wong, L., Hutson, P. R., Bushman, W. Prostatic inflammation induces fibrosis in a mouse model of chronic bacterial infection. PLoS One. 9 (6), e100770(2014).
- Elkahwaji, J. E., Zhong, W., Hopkins, W. J., Bushman, W. Chronic bacterial infection and inflammation incite reactive hyperplasia in a mouse model of chronic prostatitis. Prostate. 67 (1), 14-21 (2007).
- Boehm, B. J., Colopy, S. A., Jerde, T. J., Loftus, C. J., Bushman, W. Acute bacterial inflammation of the mouse prostate. Prostate. 72 (3), 307-317 (2012).
- Bjorling, D. E., Wang, Z. Y., Bushman, W. Models of inflammation of the lower urinary tract. Neurourol Urodyn. 30 (5), 673-682 (2011).
- Thai, K. H., Thathireddy, A., Hsieh, M. H. Transurethral induction of mouse urinary tract infection. J Vis Exp. (42), (2010).
- Bjorling, D. E., Wang, Z. Y., Boldon, K., Bushman, W. Bacterial cystitis is accompanied by increased peripheral thermal sensitivity in mice. J Urol. 179 (2), 759-763 (2008).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infect Immun. 66 (6), 2798-2802 (1998).
- Dinis, P., Charrua, A., Avelino, A., Cruz, F. Intravesical resiniferatoxin decreases spinal c-fos expression and increases bladder volume to reflex micturition in rats with chronic inflamed urinary bladders. BJU Int. 94 (1), 153-157 (2004).
- Cayan, S., et al. Botulinum toxin type A may improve bladder function in a rat chemical cystitis model. Urol Res. 30 (6), 399-404 (2003).
- Jerde, T. J., Bjorling, D. E., Steinberg, H., Warner, T., Saban, R. Determination of mouse bladder inflammatory response to E. coli lipopolysaccharide. Urol Res. 28 (4), 269-273 (2000).
- Saban, M. R., et al. LPS-sensory peptide communication in experimental cystitis. Am J Physiol Renal Physiol. 282 (2), F202-F210 (2002).
- Schilling, J. D., Mulvey, M. A., Vincent, C. D., Lorenz, R. G., Hultgren, S. J. Bacterial invasion augments epithelial cytokine responses to Escherichia coli through a lipopolysaccharide-dependent mechanism. J Immunol. 166 (2), 1148-1155 (2001).
- Saban, M. R., et al. Discriminators of mouse bladder response to intravesical Bacillus Calmette-Guerin (BCG). BMC Immunol. 8, 6(2007).
- Bjorling, D. E., et al. Acute acrolein-induced cystitis in mice. BJU Int. 99 (6), 1523-1529 (2007).
- Sadler, K. E., Stratton, J. M., Kolber, B. J. Urinary bladder distention evoked visceromotor responses as a model for bladder pain in mice. J Vis Exp. (86), (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
