Badanie szkodliwego wpływu niskociśnieniowej sterylizacji plazmowej na przeżywalność zarodników Bacillus subtilis przy użyciu mikroskopii żywych komórek

Podsumowanie

Ten protokół ilustruje ważne kolejne kroki wymagane do oceny znaczenia monitorowania parametrów żywotności i procesów naprawy DNA w ożywianiu zarodników Bacillus subtilis po leczeniu osoczem niskociśnieniowym poprzez śledzenie znakowanych fluorescencyjnie białek naprawczych DNA za pomocą czasowo-rozdzielczej mikroskopii konfokalnej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Streszczenie

Sterylizacja plazmowa jest obiecującą alternatywą dla konwencjonalnych metod sterylizacji dla celów przemysłowych, klinicznych i lotów kosmicznych. Wyładowania w osoczu niskiego ciśnienia (LPP) zawierają szerokie spektrum substancji czynnych, które prowadzą do szybkiej inaktywacji drobnoustrojów. Do zbadania skuteczności i mechanizmów sterylizacji metodą LPP wykorzystujemy przetrwalniki badanego organizmu Bacillus subtilis ze względu na ich niezwykłą odporność na konwencjonalne procedury sterylizacji. Opisujemy wytwarzanie monowarstw przetrwalników B. subtilis, proces sterylizacji plazmą niskociśnieniową w reaktorze plazmowym z podwójnym sprzężeniem indukcyjnie, charakterystykę morfologii zarodników za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) oraz analizę kiełkowania i wzrostu zarodników za pomocą mikroskopii żywych komórek. Głównym celem gatunków osocza jest materiał genomowy (DNA), a naprawa uszkodzeń DNA wywołanych przez osocze po odrodzeniu przetrwalników ma kluczowe znaczenie dla przetrwania organizmu. Tutaj badamy zdolność kiełkowania zarodników i rolę naprawy DNA podczas kiełkowania i wzrostu zarodników po leczeniu LPP, śledząc znakowane fluorescencyjnie białka naprawy DNA (RecA) za pomocą czasowo-rozdzielczej konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Poddane działaniu substancji i niepoddane działaniu zarodników monowarstwy są aktywowane do kiełkowania i wizualizowane za pomocą odwróconego konfokalnego mikroskopu żywych komórek w czasie, aby śledzić reakcję poszczególnych zarodników. Z naszych obserwacji wynika, że frakcja kiełkujących i wyrastających zarodników zależy od czasu trwania zabiegu LPP, który osiąga minimum po 120 s. Fluorescencję RecA-YFP (żółte białko fluorescencyjne) wykryto tylko w kilku zarodnikach i rozwinęła się we wszystkich wyrastających komórkach z niewielkim wzrostem zarodników traktowanych LPP. Co więcej, niektóre bakterie wegetatywne pochodzące z zarodników traktowanych LPP wykazywały wzrost cytoplazmy i miały tendencję do lizy. Opisane metody analizy pojedynczych zarodników mogą być wzorcowe dla badania innych aspektów kiełkowania i wzrostu zarodników.

Wprowadzenie

Głównym celem eksploracji kosmosu jest poszukiwanie sygnatur form życia i biomolekuł na innych ciałach planetarnych i księżycach w naszym Układzie Słonecznym. Przenoszenie mikroorganizmów lub biomolekuł pochodzenia ziemskiego do krytycznych obszarów eksploracji stanowi szczególne ryzyko, jeśli chodzi o wpływ na rozwój i integralność misji wykrywania życia na ciałach planetarnych, takich jak Mars i Europa¹. Międzynarodowe wytyczne ochrony planetarnej, ustanowione przez Komitet Badań Kosmicznych (COSPAR) w 1967 roku, nakładają surowe przepisy na misje załogowe i robotyczne na inne planety, ich księżyce, asteroidy i inne ciała niebieskie oraz regulują czyszczenie i sterylizację statku kosmicznego i krytycznych komponentów sprzętowych przed startem w celu wyeliminowania skażających mikroorganizmów ziemskich i zapobieżenia zanieczyszczeniu krzyżowemu ciał niebieskich². W ciągu ostatniej dekady zastosowanie plazmy nietermicznej zyskało szerokie zainteresowanie w badaniach biomedycznych i żywieniowych, a także w zastosowaniach związanych z lotami kosmicznymi^3,4,5. Sterylizacja plazmowa jest obiecującą alternatywą dla konwencjonalnych metod sterylizacji, ponieważ oferuje szybką i wydajną inaktywację drobnoustrojów⁶, a jednocześnie jest delikatna dla wrażliwych i niewymiernych materiałów. Wyładowania plazmowe zawierają mieszaninę czynników reaktywnych, takich jak wolne rodniki, naładowane cząstki, neutralne/wzbudzone atomy, fotony w widmie ultrafioletowym (UV) i próżniowym widmie ultrafioletowym (VUV), które prowadzą do szybkiej inaktywacji drobnoustrojów³. W tym badaniu używamy plazmy niskociśnieniowej generowanej przez podwójnie indukcyjnie sprzężoną plazmę niskociśnieniową (DICP) source^7,8 do inaktywacji endospor Bacillus subtilis rozmieszczonych na szklanej powierzchni testowej.

Gram-dodatnie bakterie z rodziny Bacillaceae są szeroko rozpowszechnione w naturalnych siedliskach gleby, osadów i powietrza, a także w nietypowych środowiskach, takich jak pomieszczenia czyste i Międzynarodowa Stacja Kosmiczna^9,10,11. Najbardziej charakterystyczną cechą rodzaju Bacillus jest zdolność do tworzenia wysoce odpornych, uśpionych przetrwalników (zwanych dalej zarodnikami) w celu przetrwania w niesprzyjających warunkach, takich jak wyczerpanie składników odżywczych¹². Zarodniki są na ogół znacznie bardziej odporne niż ich wegetatywne odpowiedniki komórkowe na różne zabiegi i stresy środowiskowe, w tym ciepło, promieniowanie UV, promieniowanie gamma, wysuszanie, zakłócenia mechaniczne i toksyczne chemikalia, takie jak silne utleniacze lub środki zmieniające pH (recenzowane w bibliografii^13,14) i dlatego są idealnymi obiektami do testowania skuteczności metod inaktywacji drobnoustrojów. Ponieważ genomowe DNA jest głównym celem leczenia bakterii metodą plazmową^15,16, naprawa uszkodzeń DNA wywołanych przez osocz (np. pęknięcia podwójnej nici DNA) po odrodzeniu zarodników jest kluczowa dla przetrwania bakterii^13,17.

Dlatego badamy zdolność kiełkowania zarodników i rolę naprawy DNA podczas kiełkowania i wyrastania zarodników po potraktowaniu zarodników plazmą argonową pod niskim ciśnieniem, śledząc pojedyncze zarodniki i ich ekspresję znakowanego fluorescencyjnie białka naprawczego DNA RecA za pomocą czasowo-rozdzielczej konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Udzielamy instrukcji krok po kroku przygotowania zarodników B. subtilis w monowarstwach w celu uzyskania powtarzalnych wyników testów, traktowania monowarstw zarodników plazmą niskociśnieniową w celu sterylizacji, przygotowania zarodników poddanych działaniu osocza do oceny ultrastrukturalnej za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) oraz analizy mikroskopowej żywych komórek na poziomie pojedynczych zarodników w połączeniu z monitorowaniem aktywnych procesów naprawy DNA zachodzących w komórce w odpowiedzi na obróbka plazmowa.

Protokół

1. Produkcja i oczyszczanie przetrwalników Bacillus subtilis

1. W celu produkcji zarodników przenieś 5 mL nocnej hodowli odpowiedniego szczepu B. subtilis, uzupełnionej o odpowiednie antybiotyki, do 200 mL podwójnie skoncentrowanego płynnego medium do sporulacji Schaeffera (na litr: 16 g nutrient broth, KCl 2 g, 0.5 g MgSO₄*7 H₂O, 2 mL 1 M Ca(NO₃)₂, 2 mL 0.1 M MnCl₂ *• 4 H₂O, 2 mL 1 mM FeSO₄, 2 mL 50% (w/v) glukozy¹⁸) i inkubuj przy intensywnym napowietrzaniu w temperaturze 37 °C przez 72 h lub do momentu, gdy > 95% hodowli ulegnie sporulacji. Wykorzystuje się zarodniki następujących szczepów: B. subtilis PY79 (typ dziki), B. subtilis PY79ΔrecA::neo (wybrakowany w białko naprawy DNA RecA) oraz B. subtilis PY79 recA-yfp::cat (RecA połączone z żółtym białkiem fluorescencyjnym [YFP]¹⁹).
2. Zarodniki zbierz poprzez wirowanie przez 15 min przy 3,000 x g w probówkach 50 mL, a następnie oczyść próbki poprzez powtarzane etapy przemywania (do 15 razy) przy użyciu sterylnej wody destylowanej H₂O; czystość oraz stan kiełkowania sprawdź za pomocą mikroskopii kontrastowej. Upewnij się, że zawiesiny zarodników składają się z jasnych w kontraście zarodników (> 99%) i są wolne od komórek wegetatywnych (pręcików), zarodników wykiełkowanych (o wyglądzie czarnym/szarym) oraz szczątków komórkowych, w przeciwnym razie dalsze eksperymenty mikroskopowe mogą zostać zakłócone. Przemywaj próbkę, aż do osiągnięcia pożądanej czystości.
3. Oznacz miano zarodników poprzez wysianie 50 µL 10-krotnych rozcieńczeń seryjnych na agar LB (tj.: użyj 30 µL próbki + 270 µL sterylnej wody dla rozcieńczenia 1:10; pobierz 30 µL z danego rozcieńczenia do 270 µL H₂O dla rozcieńczenia 1:100 i tak dalej), aby obliczyć CFU (jednostki tworzące kolonie), a następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez noc. Po wyznaczeniu CFU dostosuj stężenie próbki do 10⁹ zarodników na mL poprzez zagęszczenie lub rozcieńczenie sterylną wodą.

2. Przygotowanie próbek zarodników Bacillus subtilis naniesionych metodą aerozolu

UWAGA: Nagromadzenie i nakładanie się zarodników może prowadzić do efektów ekranowania podczas obróbki, co w konsekwencji skutkuje sfałszowaną kinetyką inaktywacji. Aby zminimalizować ten problem, należy przygotować próbki zarodników za pomocą techniki osadzania aerozolowego²⁰. W skrócie, wysokoprecyzyjną dyszą dwuskładnikową steruje się za pomocą elektronicznego czasomierza, który reguluje przepływ cieczy w synchronizacji z przepływem sprężonego gazu nośnego (w tym przypadku N₂). Wstrzykniętą próbkę ciekłą rozprasza się przez wylot dyszy za pomocą przepływu azotu.

1. Umieść nośnik próbki w postaci wysterylizowanych szkiełek przedmiotowych (do badania kinetyki przeżywalności) lub okrągłych szkiełek nakrywkowych 25 mm (do fluorescencyjnego śledzenia procesów naprawy DNA/cLSM; konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej) wewnątrz elektrycznej jednostki do rozpylania aerozolu, w osi dyszy. Zastosowane stężenie przetrwalników musi odpowiadać stukrotności pożądanego stężenia końcowego.
2. Przenieś 1 mL kultury przetrwalników do wlotu cieczy w dyszy i zainicjuj proces rozpylania trwający 0,1 s pod ciśnieniem 1,3 bar. Rozpylona zawiesina przetrwalników (1 x 10⁷) tworzy na szkiełku przedmiotowym cienką warstwę, która szybko wysycha w ciągu kilku sekund, tworząc równomiernie rozmieszczoną monowarstwę przetrwalników. Przechowuj przygotowane nośniki próbek w sterylnym pojemniku w temperaturze pokojowej.

3. Obróbka plazmą niskociśnieniową

1. Przygotować układ plazmowy do obróbki próbek biologicznych i uruchomić system przy ciśnieniu 5 Pa z plazmą argonową o mocy 500 W przez 5 min. W ten sposób wszystkie powierzchnie w systemie zostaną oczyszczone i rozgrzane. Ogranicza to osadzanie się cząsteczek z powietrza otoczenia, w szczególności azotu, tlenu i wody, podczas odpowietrzania układu. Po wstępnym przygotowaniu systemu odpowietrzyć komorę i ostrożnie umieścić próbki w centrum naczynia reaktora za pomocą szklanych statywów.
2. Użyć co najmniej trzech powtórzeń biologicznych. Zamknąć komorę i odessać powietrze do poziomu poniżej 2 Pa. Następnie wprowadzić do komory gaz procesowy. Uregulować ciśnienie w systemie do 5 Pa.
3. Po określonym czasie procesu wyłączyć zasilanie i dopływ gazu, a następnie ostrożnie odpowietrzyć system, aby zapobiec wywianiu próbek z uchwytu. Po odpowietrzeniu wyjąć próbki i umieścić w systemie próbki dla kolejnego parametru. W przypadku kontroli niepoddanych działaniu plazmy, próbki należy poddać działaniu samej próżni (5 Pa) w obecności gazu procesowego przez czas odpowiadający najdłuższemu zastosowanemu czasowi plazmy.

4. Odzyskiwanie i ocena przeżywalności zarodników

1. Przygotować roztwór autoklawowanego 10% octanu poliwinylowego (PVA), ostrożnie pokryć nim nośnik próbki ilością około 500 µL i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez 4 h. Usunąć wysuszoną warstwę PVA (zawierającą obecnie próbkę zarodników) za pomocą sterylnej pincety i przenieść ją do probówki reakcyjnej o pojemności 2 mL. Do probówki dodać 1 mL sterylnej wody i rozpuścić warstwę PVA poprzez wstrząsanie w wortexie. Procedura ta pozwala na odzysk >95% zarodników i nie wpływa na ich zdolność do kiełkowania²¹.
2. Wykonać seryjne rozcieńczenia próbki w stosunku 1:10 w sterylnej wodzie na płytce 96-dołkowej (tj. 270 µL sterylnej H₂O + 30 µL próbki/poprzedniego rozcieńczenia). Wysiać 50 µL każdego rozcieńczenia na agar nutrient LB (Lysogeny broth), inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc i policzyć liczbę wyrosłych kolonii (CFU).

5. Mikroskopia żywych komórek i śledzenie procesów naprawy DNA w kiełkujących przetrwalnikach

1. Do eksperymentów z kiełkowaniem przygotuj podkład z 1,5% agaru LB o grubości 1 mm, gotując 700 µL pożywki i pipetując ją do sterylnej szalki Petriego do mikroskopii. Po 10 min wytnij sterylnym skalpelem podkład z agaru LB o wymiarach 8 mm x 8 mm x 1 mm i ostrożnie przenieś agar na wierzch monowarstw przetrwalników spoczywających na szkiełkach nakrywkowych o średnicy 25 mm.
   UWAGA: Krok ten jest kluczowy dla wizualizacji pojedynczych przetrwalników i pozwala na śledzenie ich reakcji w odpowiedzi na aktywację kiełkowania indukowaną przez agar odżywczy. Zatem agar LB służy dwóm celom: (1) unieruchomieniu przetrwalników na powierzchni, co zapobiega ich przemieszczaniu się wzdłuż powierzchni i utracie ostrości optycznej oraz (2) aktywacji przetrwalników do kiełkowania.
2. Po przykryciu próbki agarem szybko przenieś szkiełko nakrywkowe do komory obrazowania i poddaj próbki badaniu za pomocą zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skaningowego z optyką odwróconą, używając obiektywu imersyjnego olejowego plano-apochromatycznego 63X/1.3.
3. Wykonaj obrazowanie fluorescencji (YFP) z długością fali wzbudzenia 514 nm; emisję można wykrywać w zakresie od 520 do 560 nm.
   1. Zarejestruj obrazy w polu jasnym w trybie skanowania, korzystając z jednego z fotopowielaczy (ścieżka światła przechodzącego).
   2. Zarejestruj serie time-lapse przy mocy lasera 2,6%, ustawiając aperturę konfokalną na 5 jednostek Airy'ego i częstotliwość próbkowania 1 klatka na 30 s od 0 h do 5 h, w zależności od eksperymentu. Należy szczególnie zaznaczyć, że wysokie dawki monochromatycznego naświetlania laserowego przy 514 nm całkowicie hamują kiełkowanie (Rysunek 1A, B).
4. Próbki należy utrzymywać w temperaturze 37 °C (wilgotność powietrza otoczenia) na stoliku grzewczym przez cały proces obrazowania. Dla każdego warunku wykorzystaj co najmniej trzy powtórzenia biologiczne. W przypadku agregacji przetrwalników, wielowarstwowego rozmieszczenia przetrwalników lub zanieczyszczenia cząsteczkami kurzu może dojść do zablokowania obróbki plazmowej („zacienienia”), co może umożliwić kiełkowanie przetrwalników znajdujących się w cieniu (Rysunek 1C, D).

Rycina 1: Potencjalne problemy zaobserwowane podczas konfokalnej fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek w przypadku spor zapoddanych działaniu plazmy. (A, B) Hamowanie kiełkowania spor przez wysokie dawki monochromatycznego (514 nm) naświetlania laserowego. (A) Przegląd (3 x 3 zszytych klatek) spor B. subtilis (LAS72, RecA-YFP) 180 min po zainicjowaniu kiełkowania. Środkowa klatka była naświetlana w odstępach 30 s wysokimi dawkami światła laserowego (514 nm, 70% mocy lasera), podczas gdy obszary otaczające (= klatki) nie były naświetlane (nałożony obraz kanału w jasnym polu i fluorescencji RecA-YFP; uporządkowane struktury były wynikiem zastosowania szalek obrazowych 35 mm z nadrukowaną siatką 500 µm). (B) przedstawia 4-krotne powiększenie granicy między obszarem naświetlanym a nienaświetlanym, pokazując, że spory wystawione na wysokie dawki monochromatycznego naświetlania laserowego nie kiełkowały i nie rozwijały się, podczas gdy spory w obszarach nienaświetlanych w pełni przekształciły się w bakterie wegetatywne wykazujące silną fluorescencję RecA-YFP (sygnał zielony). (C, D) Spory pokryte cząstkami zanieczyszczeń lub wieloma warstwami spor (strzałki) wydają się chronić leżące pod nimi spory przed inaktywacją przez działanie plazmy i umożliwiają ich kiełkowanie oraz rozwój („efekt cieniowania”). (C) Spory były poddawane działaniu plazmy przez 60 s i obrazowane 180 min po zainicjowaniu kiełkowania lub w (D) przez 120 s i obrazowane po 240 min. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

6. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)

1. Zastosuj skaningową mikroskopię elektronową w celu uzyskania informacji ultrastrukturalnych dotyczących morfologii powierzchni zarodników poddanych działaniu plazmy w porównaniu z niepoddanymi kontrolami. Wysuszone monowarstwy zarodników na szkiełkach podstawowych napyl metalizatorem w celu pokrycia ich warstwą złota i palladu (3 nm). Do obrazowania próbek wykorzystaj skaningowy mikroskop elektronowy z emisją polową, pracujący przy napięciu przyspieszającym 5 kV, wyposażony w detektor elektronów wtórnych in-lens w celu uwidocznienia kontrastu topograficznego.

7. Analiza danych

1. Wyznacz przeżywalność zarodników z ilorazu N/N₀, gdzie N to średnia liczba CFU w próbkach poddanych działaniu czynnika, a N₀ to średnia liczba CFU w niepoddanych działaniu próbach kontrolnych w próżni. Przedstaw inaktywację zarodników przez traktowanie plazmą argonową jako funkcję czasu (w sekundach). Wszystkie dane przedstaw jako średnie i odchylenia standardowe (n = 3).
2. Przeanalizuj obrazy uzyskane w drodze obrazowania żywych komórek przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu. Ilościowo określ proporcję kiełkowania i wyrastania zarodników po traktowaniu plazmą, zliczając zarodniki w reprezentatywnych klatkach na początku eksperymentu oraz po 4 h. W celu określenia istotności w testach przeżywalności zarodników zastosuj jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z wykorzystaniem oprogramowania statystycznego. Wartości P <0,05 uznaje się za statystycznie istotne.

Wyniki

Przeżywalność zarodników B. subtilis poddanych działaniu plazmy

Opracowanie plazmowe zarodników B. subtilis wykorzystanych w niniejszym badaniu wykazuje spadek przeżywalności wraz z wydłużeniem czasu trwania zabiegu plazmowego (Rycina 2). Zarodniki szczepu wykazującego ekspresję genu recA połączonego z YFP wykazały krzywe przeżywalności podobne do zarodników szczepu typu dzik...

Dyskusja

Sterylizacja powierzchni przy użyciu plazmy niskotemperaturowej i niskociśnieniowej jest obiecującą alternatywą dla raczej konwencjonalnych procedur sterylizacji, takich jak leczenie promieniowaniem jonizującym, chemikaliami (np. gazami takimi jak_H2O2lub tlenek etylenu) lub suchym i wilgotnym ciepłem²³. Zwykłe metody sterylizacji w większości zapewniają skuteczną sterylizację, ale wiadomo, że wpływają na obrabiany materiał i stanowią potencjalne zagrożenie dla operat...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dysza dwusubstancyjna (model 970-8)	Schlick	14,404	230 V, 50 Hz, D 4.484/8, średnica otworu 0,8 mm
Luria Bertani Medium	Sigma Aldrich	70122-100G
Łączniki rurowe	Festo	n/a	G 1/8
Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC	Bosch Rexroth	820005100
PLN Rurka poliamidowa	Festo	558206	d = 6 mm
Prowadnice szklane	VWR	48300-026
Elektryczny timer 550-2-C	Gefran	F000074	220 V
komora celowa attofluorowa	Menzel, Fisher Ref.	3406816	d=25 mm, okrągły
MgSO4*7 H2O	Sigma Aldrich	13152
Ca(NO3)2	Sigma Aldrich	202967
MnCl2 * 4 H2O	Sigma Aldrich	244589
FeSO4 * 7H2O	AppliChem	13446-34-9
Glukoza	Merck	215422
KCl	Sigma Aldrich	P9541-500G
Bulion odżywczy (NB)	Merck	105443
96-dołkowa płytka	ThermoFisher	243656
Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
Leo 1530 Gemini	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
ZEN 2 i ZEN lite 2012 (oprogramowanie)	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
SigmaPlot, wersja 13.0 (oprogramowanie statystyczne)	Systat GmbH, Erkrath, Niemcy	n/a
Komora komórkowa Attofluor	Invitrogen	A7816
µ-Dish 35 mm, wysoka Grid-500 Szklane dno	ibidi	81168

Luria-Bertani (LB)Merck 110283